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Farmacologia generale - aminoglicosidi Appunti scolastici Premium

Appunti di Farmacologia generale del professor Tomaino sugli aminoglicosidi con analisi dei seguenti argomenti: antibiotici, struttura chimica, desossistreptamina, derivati, disostituiti, inibitori della sintesi proteica batterica, metalli mimetici, modelling, studi di relazione struttura attività, studi di... Vedi di più

Esame di Farmacologia generale docente Prof. A. Tomaino

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figura 8

Dopo il legame della Paramomicina all’RNA, la struttura formata da A 1408,

A 1492 e A 1493 si stabilizza poiché le basi A 1408 e A 1493 formano una coppia

non canonica. Il nucleotide A 1492, che non dovrebbe avere interazione con coppie di

basi, crea un ripiegamento nella struttura dell’RNA e gli effetti combinati di A 1492 e

della coppia A 1408 A 1493 creano un rigonfiamento nel sito A proprio dove è

legata la Paramomicina, ciò determina un ‘estensione dell’angolo di ripiegamento

(figura 9).

figura 9: Rappresentazione schematica Paramomicina I-tRNA. In blu il potenziale elettronegativo, in rosso quello elettropositivo; la

freccia bianca mostra il ripiegamento generato da A 1492,che non dovrebbe legare alcuna base. La freccia gialla mostra la tasca generata dalla coppia

A 1408•A1493 e da A 1492. La freccia rossa mostra l’amino gruppo in 3 dell’anello II, sito di acetilazione enzimatica. 9

I gruppi funzionali essenziali sono l’ossidrile e l’aminogruppo. L’anello I lega

• •

le coppie U 1406 U 1495 e C 1407 G 1494, essenziali quindi per un’iterazione

efficace. •

La tasca creata da A 1492 e dalla coppia A 1408 A 1493 si lega all’anello II

della Paramomicina, questo legame fa shiftare G 1491 al di sopra della sua naturale

posizione.

Gli anelli III e IV rafforzano le interazioni principali, legando il solco maggiore

.

dell’r-RNA tramite i propri gruppi –OH ed –NH

2

La coppia C 1409 G 1491 accomoda il legame dell’aminoglicoside nella

tasca, perciò la presenza di una base errata in questa posizione impedisce la

formazione del legame.

Questo tipo di interazione è comune a tutti gli aminoglicosidi che hanno

analogie strutturali con la Paramomicina.

Dagli studi di cristallografia appare evidente che diversi aminoglicosidi

interagiscono con lo stesso sito in diverse conformazioni.

La conformazione assunta deve soddisfare le costrizioni steriche ed

elettrostatiche del sito di legame.

In effetti l’entità della forza di legame degli aminoglicosidi carichi

positivamente alle molecole di RNA cariche negativamente, è dominata dalle

interazioni elettrostatiche e dallo piazzamento dei cationi dall’RNA.

È stato dimostrato che alcuni gruppi amminici caricati positivamente spiazzano

lo ione magnesio. 2+ (che mimano

Diversi lavori suggeriscono che il cleavage indotto da ioni Pb

2+

Mg ) nel sito A dell’r-RNA è inibito dagli aminoglicosidi (Neomicina).

Nella figura 10 è rappresentata l’interazione tra t-RNA di lievito e Neomicina

2+

B. In particolare in a) è evidenziato il sito di cleavage indotto da Pb ; in b) (ball and

stick) sono evidenziati i possibili legami H che intercorrono tra t-RNA e l’-NH della

3

Neomicina (OP1 e A23, O6 e G45) e la posizione della Neomicina rispetto agli ioni

bivalenti. 10

figura 10

Per quanto detto gli aminoglicosidi possono essere considerati “ metal

mimics”, dato che competono con gli ioni bivalenti nel legame all’RNA.

Perché fungano da metalli mimetici si devono realizzare delle condizioni

strutturali favorevoli nel sito di legame aminoglicoside/ ione bivalente, quali

l’accessibilità e l’esposizione dei gruppi chimici in grado di interagire con le amine

protonate degli aminoglicosidi.

Gli studi di modelling e di cristallografia hanno inoltre dimostrato che in tutte

) è totalmente deidratato e forma tre legami H

le strutture un gruppo ammonico (N

3

con l’RNA. è 5.7 in soluzione, il più basso valore di tutti i

Il valore di pKa del gruppo N

3

gruppi ammonici presenti nella struttura. Il legame dell’aminoglicoside all’RNA

aumenta il pKa da 6.1 a 6.4, valore che favorisce la disidratazione del gruppo

amminico. 11

In tutto questo sistema non vanno trascurate le molecole di solvente, che

giocano un ruolo fondamentale nel riconoscimento molecolare e nel legame degli

aminoglicosidi al sito A.

Come mostra la figura 11,il legame H intra-molecolare tra il gruppo ammonico

dell’anello I e l’O 4’’ dell’anello III della Paramomicina è rimpiazzato, nella

N

2

Tobramicina e nella Geneticina da un ponte H tra acqua, ammonio N dell’anello I e

2

O 5 dell’anello II, il che suggerisce che le molecole di acqua aiutano a mantenere il

corretto orientamento degli anelli I e II.

L’utilizzo dell’acqua d’idratazione dell’RNA riduce il grado di deidratazione

che ogni sostituente subisce al fine interagire in modo forte e specifico col proprio

target. figura 11

Inoltre, le differenti strutture chimiche dei vari aminoglicosidi sono

compensate dai ponti H che le molecole di acqua stabiliscono tra aminoglicoside e

RNA (figura 11). figura 12: (in giallo: complesso t-RNA di lievito-Neomicina; in

fucsia: complesso sito A E. coli-Paramomicina; in turchese: complesso

RNA-Neomicina B; in verde: complesso esoni- Neomicina B; in viola:

complesso RNA- Neomicina B). 12

Nella figura 12 sono state sovrapposte diverse strutture a dimostrazione

dell’importanza degli anelli I e II nel produrre un’interazione favorevole con l’RNA.

L’emergenza legata alla diffusione di ceppi resistenti ha in qualche modo

ridotto il potenziale degli aminoglicosidi in terapia.

I meccanismi di resistenza si attuano essenzialmente attraverso tre vie:

1) Riduzione dell’ingresso e/o accumulo del farmaco all’interno del batterio;

2) Espressione di enzimi batterici che modificano gli aminoglicosidi e li rendono

inattivi;

3) Modificazione del sito di legame ribosomiale.

1. La riduzione dell’ingresso di farmaco è legata all’impermeabilizzazione della

membrana, ma i meccanismi sono in parte sconosciuti. In genere i batteri anaerobi

gram – mostrano fenomeni di resistenza adattativi (riducono via via la sensibilità ad

aminoglicosidi verso cui erano sensibili). Cambiamenti delle proteine di membrana e

alterazioni della regolazione dei geni responsabili della respirazione anaerobia sono

alla base di questo fenomeno, che riverifica a dosi elevate e quando intercorrono

lunghi intervalli tra le somministrazioni. I meccanismi di efflusso attivo sono di

scarsa rilevanza.

2. Gli enzimi che modificano gli aminoglicosidi catalizzano modificazioni

covalenti di funzioni amminiche o idrossiliche, riducendo il legame ai ribosomi per la

scarsa disponibilità di EDP-II. Gli enzimi che inattivano gli aminoglicosidi sono l’N-

Acetiltransferasi (AAC), che usa l’AcetilcoenzimaA come cofattore ed agisce su

funzioni amminiche, l’O-Nucleotidiltransferasi (ANT) e l’O-Fosfotransferasi (APH),

entrambi utilizzano come cofattore l’ATP ed agiscono su funzioni idrossiliche. Le

posizioni attaccate sono la 3, la 2’ e la 6’ per AAC, la 4’ e la 2’’ per ANT, la 3’ e la

2’’ per APH (figura 13).

Dati recenti hanno dimostrato che la resistenza batterica nei confronti degli

aminoglicosidi 4,6- o 4,5-disostituiti si esplica prevalentemente della chinasi (3’)-IIIa

[APH(3’)-IIIa]. 13

figura 13: A= Amikacina; Dbk: Dibekacina; G: Gentamicina; Gmb= Gentamicina B; K= Kanamicina A;

I= Isepamicina; N= Netilmicina; S= Sisomicina; T= Tobramicina.

3. Studi di modelling hanno dimostrato che la mutazione della sola base A 1408 è

sufficiente a generare uno stato di resistenza, in quanto tale mutazione distrugge molti

legami H del complesso aminoglicoside-RNA. La conoscenza di questi meccanismi

di resistenza potrebbe portare allo sviluppo di molecole versatili con scarsa capacità

di legare il sito mutato e, data l’omologia di sequenza tra r-RNA batterico ed umano,

all’individuazione di quelle mutazioni che sono alla base di alcuni degli effetti

collaterali degli aminoglicosidi (oto- e nefrotossicità).

Gli studi a tale riguardo sono in numero limitato, non solo per la difficoltà nel

considerare tutte le variabili che entrano in gioco nell’interazione aminolicoside-RNA

ma anche perché il più rilevante meccanismo di resistenza è quello mediato da

enzimi.

Gli approcci usati per ottenere dei derivati resistenti all’inattivazione

enzimatica sono i seguenti:

1) Studi di relazione struttura attività: effettuati a partire da un lead

compound sul quale vengono apportate delle sostituzioni;

2) Studi di Drug Targeting: l’individuazione dell’esatta struttura dei

targets (RNA e/o enzima), consente di ottenere composti selettivi nei

confronti del bersaglio biologico (RNA). 14

Il primo approccio, prettamente chimico-sintetico, ha inteso mascherare i siti di

attacco dei vari enzimi con opportuni sostituenti ed ha prodotto gli aminoglicosidi

riportati nelle figure 14 e 15.

*Idrossimetilazione in 1 *Fluorinazione in 3'

*Fluorinazione in 2' ed in 5 *Rimozione dell'OH in 3'

*Alchilazione ed acetilazione del 2' amino

*Inversione chiralità in 5

OH *Fluorinazione in 4'

APH (3')

AAC (2') ANT (4')

OH

2'

O

HO H N OH

6'

2

H N

2 O

3'' HO

OH NH

4 2

6

O O NH

2

H N

2 AAC (6')

1 3

ANT (2'') * Alchilazione in 6' amino

APH (2'') *Introduzione di aa e peptidi in 6'

*Idrossimetilazione in 1

*Aminazione in 2''

*Acilazione in 2'' AAC (3)

*Fluorinazione in 2'' e in 5

*Idrossimetilazione in 1

*Aminoacilazione in 1 *Fluorinazione in 5

*Inversione della chiralità in 5 *Idrossimetilazione in 1

*2''-oxo derivatio 5-fluoro derivati *Aminoacilazione in 1

*Alchilazione in 1

*Inversione chiralità in 5

figura 14 15

OH

2'

(H N)HO OH

2 6'

O 5A

5B NH

2 OH

2'

5C

OH HO OH

2' 6'

O

ON CH

OH

2 3

6'

O O-ADP

NH

2 -

O

P -

O Analoghi deaminati della

O H B

APH Kanamicina A

O

2' 5D

HO OH

6'

O

-

O NH

O 2

P

-

O

HO OH N

6'

O NH

2 +

O-ADP

-

O O S O

P

-

O O

O

2' R

HO OH Uso di solfonammidi

6'

O isochinoliniche come

NH inibitori di protein chinasi

2

Enz-Nu

+

H -

O O

HO OH

6' P

O NH -

O

2 O

2'

HO OH

6'

O

Inattivazione enzimatica NH

2

+ ADP

Analoghi che mimano lo stato di transizione

figura 15 16

Il risultato più importante dell’approccio chimico-sintetico ha condotto alla sintesi di

un aminoglicoside di nuova generazione, la Piramnicina, datato di tre peculiari

caratteristiche:

1. L’aminogruppo è ancorato saldamente alla tasca e non è riconosciuto

dall’enzima;

2. L’introduzione di sostituenti sull’anello III e IV, carichi come la guanidina o

neutri come il gruppo metilico o aromatico, hanno portato ad un aumento

dell’interazione carica-carica o dell’interazione di van der Waals, con il

risultato finale di agevolare il legame aminoglicoside-RNA e ostruire quello

aminoglicoside-enzima (figura 16);

3. Il composto ottenuto è molto diverso dal lead originario ma mantiene

un’elevata potenza ed al tempo stesso evita l’inattivazione enzimatica (figura

17). figura 16 17

figura 17

Infine, introducendo in N1 della Piramnicina un acido 4-amino-2-

idrossibutanoico, è stato ottenuto un composto TC005, che ha gli stessi vantaggi del

lead e ridotta tossica renale perché escreto in minima parte tramite tale emuntorio

(figura 17).

Il secondo approccio (drug targeting) è quello più ampiamente perseguito negli

ultimi anni. I risultati più significativi sono stati ottenuti dallo studio cristallografico

del complesso ADP(3’)-IIIa-Kanamicina A o Neomicina B. Da questo complesso, il

target intra-cellulare degli aminoglicosidi, ossia il sito A ribosomiale batterico, può

essere facilmente ottenuto detossificando APH(3’)-IIIa (figura 18). 18

figura 18: 2+

Complesso APH(3’)-ADP-IIIa- Kanamicina (rosso), Neomicina (blu); ioni Mg (verde).

Tali studi hanno dimostrato che in assenza dell’aminoglicoside il loop è molto

flessibile; nei complessi invece il loop è ripiegato sull’antibiotico ed il residuo 160

dell’estremità del loop shifta, stabilizzando il complesso aminoglicoside-tasca (figura

19). figura 19: Complesso APH(3’)-IIIa (grigio)-ADP (nero)-

aminoglicoside (rosso); residui del loop (150-165) (oro e verde); ioni

2+ (nero).

Mg 19


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AUTORE

Moses

PUBBLICATO

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DESCRIZIONE APPUNTO

Appunti di Farmacologia generale del professor Tomaino sugli aminoglicosidi con analisi dei seguenti argomenti: antibiotici, struttura chimica, desossistreptamina, derivati, disostituiti, inibitori della sintesi proteica batterica, metalli mimetici, modelling, studi di relazione struttura attività, studi di Drug Targeting.


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologia farmaceutiche
SSD:
Università: Messina - Unime
A.A.: 2013-2014

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Moses di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Farmacologia generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Messina - Unime o del prof Tomaino Antonio.

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