Farmacologia generale - aminoglicosidi

Derivati della Desossistreptamina

Gentamicina B: OH OH OH H NH H H CH OH CH2 3 3

Isepamicina: OH OH OH H NH COR H CH OH CH2 3 3

Sisomicina: - - - - - H H CH OH CH3 3

Netilmicina: - - - - - CR’’ H CH OH CH3 3R*= CHOHCH NH ; R’= CHOH(CH )NH ; R’’= CH CH (a) = zucchero principale per Sisomicina e Netilmicina2 2 2 2 2 3 4

DERIVATI DELLA DESOSSISTREPTAMINA 4,5-DISOSTITUITI

HO 5''OR4 2' R 3 OHO H N 6'2 O R2HO 4O 5 OHO NH2R HN 11 3

Aminoglicoside R R R R R1 2 3 4 5

Neomicina B H NH OH X H2

Paramomicina I H OH OH X H

Lividomicina A H OH H X Mannosio

Ribostamicina H NH OH H -2

Butirosina B Y NH OH H -2 Y=X= OHNH2O NH2H N OR2 5 OOH

Gli aminoglicosidi sono inibitori della sintesi proteica batterica a livello dellasubunità ribosomiale 30S. Il passaggio di queste molecole polari attraverso lamembrana dei batteri gram- è un processo autoindotto, che implica la distruzione dei2+ponti di Mg presenti tra le molecole di lipopolisaccaride adiacenti e che non puòavvenire tramite le

porine data la loro dimensione elevata (da 1 a 1,8 nm). Il successivo trasporto degli aminoglicosidi attraverso la membrana citoplasmatica è dipendente dal trasporto elettronico e dall'energia termica della fase I (EDP-I). È facile intuire che questa è la tappa limitante il trasporto degli aminoglicosidi, bloccata o inibita da cationi bivalenti, dall'iperosmolarità, da bassi valori di pH e dall'anaerobiosi.

Giunti nel citosol, gli aminoglicosidi si legano alla subunità ribosomiale 30S, attraverso un meccanismo energia dipendente (energia di fase II EDP-II). Il legame aminoglicoside-ribosoma causa tre effetti:

• Previene la formazione del complesso di inizio della sintesi proteica (legame m-RNA-t-RNA e associazione della subunità 50S);
• Blocca l'elongazione della catena nascente interrompendo il processo di controllo traduzionale (lettura errata o terminazione precoce);
• La nativa proteina aberrante può

essere inserita nella membrana cellulare, dicui altera la permeabilità ed al tempo stesso incrementa il trasporto el'accumulo dell'aminoglicoside.

L'esatto meccanismo d'azione dei vari complessi aminoglicoside-subunità 30S è stato rivelato dagli studi di cristallografia.

Quattro basi: A 1408, A1492, A 1493, A 1494, presenti nel sito A, sono responsabili dell'interazione del r-RNA con il t-RNA.

Durante la decodificazione, il sito A cambia dalla conformazione "off" (A1492 e A 1493 sono ripiegati nel solco del sito A) alla conformazione "on" (A 1492 e A 1493 protrudono dal sito A).

Questo cambiamento conformazionale è necessario affinché avvenga un'interazione specifica e direzionata tra A 1492 e A 1493 con due delle tre coppie di basi formate dall'interazione codone-anticodone complementari e provoca la transizione del ribosoma dallo stato aperto a quello chiuso e la sua stabilizzazione per via del

legame che si stabilisce tra t-RNA e ribosoma. Gli aminoglicosidi bloccano il sito A nella conformazione aperta e utilizzano una parte dell'energia necessaria per la chiusura ribosomiale t-RNA dipendente (figura 5).

Di conseguenza il ribosoma perde la capacità di discriminare il t-RNA e il m-RNA complementari da quelli non complementari. Vicens et al. hanno studiato la struttura cristallina di una molecola di RNA a doppia elica contenente due siti A, in un complesso di Paramomicina, Tobramicina e Geneticina: l'anello I (zucchero) ripiegato appare inserito nel sito A, bloccato da un residuo di guanina appartenente all'A 1408 (sito Watson-Crick), con il quale forma due legami idrogeno (figura 6).

È stato osservato che questa particolare interazione aiuta a mantenere i residui A 1492 e A 1493 sul versante esterno e ciò induce all'erronea lettura della sequenza.

legami H nei treaminoglicosidi, resi possibili dalla flessibilità della coppia aminoacidica U 1406: U1495. Gli altri anelli legano in modo blando diversi nucleotidi del sito A in base al tipo di sostituente presente, ma non risultano essenziali per l'attività. Ulteriori informazioni sono state ottenute dallo studio dell'interazione tra quattro aminoglicosidi (Neomicina, Paramomicina, Gentamicina e Kanamicina) e il r-RNA di E. coli (figura 7).

figura 7: Complesso t-Rna – Paramomicina I; in bianco sito A, in giallo l'aminoacil t-RNA, inviola il loop, P ed E (siti del ribosoma). La freccia bianca mostra il legame Paramomicina-tRNA. L'interazione della Paramomicina si attua tramite il legame con 27 nucleotidi del RNA stampo, che è omologo al sito A del r-RNA di E. coli. L'RNA stampo è stato ottenuto considerando che le coppie di basi essenziali perché la Paramomicina stabilisca un legame ad alta affinità sono: C

mostra la tasca generata dalla coppiaA 1408•A1493 e da A 1492. La freccia rossa mostra l’amino gruppo in 3 dell’anello II, sito di acetilazione enzimatica. 9I gruppi funzionali essenziali sono l’ossidrile e l’aminogruppo. L’anello I lega• •le coppie U 1406 U 1495 e C 1407 G 1494, essenziali quindi per un’iterazioneefficace. •La tasca creata da A 1492 e dalla coppia A 1408 A 1493 si lega all’anello IIdella Paramomicina, questo legame fa shiftare G 1491 al di sopra della sua naturaleposizione.Gli anelli III e IV rafforzano le interazioni principali, legando il solco maggiore.dell’r-RNA tramite i propri gruppi –OH ed –NH2•La coppia C 1409 G 1491 accomoda il legame dell’aminoglicoside nellatasca, perciò la presenza di una base errata in questa posizione impedisce laformazione del legame.Questo tipo di interazione è comune a tutti gli aminoglicosidi che hannoanalogie strutturali con la

Paramomicina. Dagli studi di cristallografia appare evidente che diversi aminoglicosidi interagiscono con lo stesso sito in diverse conformazioni. La conformazione assunta deve soddisfare le costrizioni steriche ed elettrostatiche del sito di legame. In effetti l'entità della forza di legame degli aminoglicosidi carichi positivamente alle molecole di RNA cariche negativamente, è dominata dalle interazioni elettrostatiche e dallo piazzamento dei cationi dall'RNA. È stato dimostrato che alcuni gruppi amminici caricati positivamente spiazzano il ione magnesio 2+ (che mimano Diversi lavori suggeriscono che il cleavage indotto da ioni Pb2+ Mg) nel sito A dell'r-RNA è inibito dagli aminoglicosidi (Neomicina). Nella figura 10 è rappresentata l'interazione tra t-RNA di lievito e Neomicina 2+B. In particolare in a) è evidenziato il sito di cleavage indotto da Pb; in b) (ball and stick) sono evidenziati i possibili legami H che intercorrono.

tra t-RNA e l’-NH della3Neomicina (OP1 e A23, O6 e G45) e la posizione della Neomicina rispetto agli ionibivalenti. 10figura 10Per quanto detto gli aminoglicosidi possono essere considerati “ metalmimics”, dato che competono con gli ioni bivalenti nel legame all’RNA.Perché fungano da metalli mimetici si devono realizzare delle condizionistrutturali favorevoli nel sito di legame aminoglicoside/ ione bivalente, qualil’accessibilità e l’esposizione dei gruppi chimici in grado di interagire con le amineprotonate degli aminoglicosidi.Gli studi di modelling e di cristallografia hanno inoltre dimostrato che in tutte) è totalmente deidratato e forma tre legami Hle strutture un gruppo ammonico (N3con l’RNA. è 5.7 in soluzione, il più basso valore di tutti iIl valore di pKa del gruppo N3gruppi ammonici presenti nella struttura. Il legame dell’aminoglicoside all’RNAaumenta il pKa da 6.1 a 6.4, valore che

Favorisce la disidratazione del gruppo amminico. In tutto questo sistema non vanno trascurate le molecole di solvente, che giocano un ruolo fondamentale nel riconoscimento molecolare e nel legame degli aminoglicosidi al sito A. Come mostra la figura 11, il legame H intra-molecolare tra il gruppo ammonico dell'anello I e l'O 4'' dell'anello III della Paramomicina è rimpiazzato, nella N2Tobramicina e nella Geneticina, da un ponte H tra acqua, ammonio N dell'anello I e 2O 5 dell'anello II, il che suggerisce che le molecole di acqua aiutano a mantenere il corretto orientamento degli anelli I e II. L'utilizzo dell'acqua d'idratazione dell'RNA riduce il grado di deidratazione che ogni sostituente subisce al fine di interagire in modo forte e specifico col proprio target. Inoltre, le differenti strutture chimiche dei vari aminoglicosidi sono compensate dai ponti H che le molecole di acqua stabiliscono tra aminoglicoside e RNA.

Nella figura 12 sono state sovrapposte diverse strutture a dimostrazione dell'importanza degli anelli I e II nel produrre un'interazione favorevole con l'RNA.

L'emergenza legata alla diffusione di ceppi resistenti ha in qualche modo ridotto il potenziale degli aminoglicosidi in terapia.

I meccanismi di resistenza si attuano essenzialmente attraverso tre vie:

1. Riduzione dell'ingresso e/o