Farmacologia

Dose-Risposta

La DE50 è la dose efficacie media ovvero la dose che dà origine al 50% dell'effetto massimo possibile. La curva dose-risposta si informa se il farmaco è ottimale dal punto di vista farmacodinamico quindi se è in grado di occupare e attivare il recettore dando origine a un effetto terapeutico, ci definisce inoltre alcune relazioni tra l'effetto e il dosaggio attraverso la determinazione della ED50. I farmaci possono essere divisi in diverse classi, ovvero in diverse tipologie di ligando farmacologico, osservando la curva dose-risposta. Un farmaco può essere definito come agonista ovvero si definisce un farmaco che genera una risposta biologica analoga a quella evocata dal ligando endogeno ed è in grado di dare l'effetto massimo possibile occupando tutti i recettori disponibili. Quindi i farmaci agonisti vengono usati in caso in cui il ligando endogeno sia poco prodotto in caso di una patologia, tra gli agonisti.riconosciamo gli AGONISTI PIENI che danno l'effetto massimo nel momento in cui occupano tutti i recettori e AGONISTI PARZIALI che non sono in grado di dare origine all'effetto massimo pur occupando tutti i recettori.

Il primo step della farmacodinamica è l'occupazione del recettore da parte del farmaco ed è un fenomeno regolato dalla legge di massa, la proprietà che ci permette di definire lo stato di occupazione di un farmaco con il suo recettore è l'affinità. Una affinità elevata ci permette di utilizzare dosaggi bassi di farmaci e che il legame farmaco + recettore sia sufficientemente forte per passare allo step successivo ovvero l'attivazione.
L'affinità di un farmaco per il suo recettore si valuta tramite tecniche diversificate ma la tecnica che si predilige prevede l'utilizzo di una radio marcatura e si parla di SAGGIO DI BINDING.
I dosaggi di binding

recettoriali sono dei saggi che, condotti all’equilibrio, ci permettono di calcolare inmaniera precisa e con poca variabilità, l’affinità per un recettore. I dosaggi di binding possono essere di duetipi:

• Dosaggio per saturazione: eseguito quando si ha la possibilità di radiomarcare direttamente ilfarmaco che sto studiando ovvero sostituire un atomo con il suo corrispondente isotopo
• Dosaggio per competizione: si basano sulla capacità della mia molecola di farmaco che NON possoradiomarcare direttamente di spiazzare dal recettore bersaglio un altro ligando che può essereradiomarcato.

SAGGI DI BINDING PER SATURAZIONE

Si incuba un preparato biologico che contiene il mio recettore che è presente in diverse provette in unaquantità fissa insieme a concentrazioni crescenti del mio farmaco che io ho radiomarcato, i saggi di bindingvengono eseguiti all’equilibrio perché questa incubazione viene eseguito a

Temperature ideali per il legame del farmaco al recettore

Le temperature ideali per il legame del farmaco al recettore all'interno del corpo umano sono quelle che consentono di raggiungere l'equilibrio nel tempo necessario. La scelta del preparato biologico influenzerà la predittività dell'affinità che il farmaco avrà nei confronti del recettore nel nostro organismo.

Il preparato biologico ottimale dovrebbe mimare il più fedelmente possibile le condizioni dell'organismo umano in cui avviene questa interazione. Pertanto, si preferisce utilizzare un tessuto umano quando possibile. Tuttavia, ciò potrebbe non essere sempre possibile, ad esempio nel caso in cui il recettore si trovi nel cervello. In tal caso, si può utilizzare un preparato tissutale murino. In alternativa, se il recettore è poco espresso a livello tissutale, si può optare per l'utilizzo di cellule umane in coltura che sappiamo contenere il recettore.

non ciò diminuisce ulteriormente la predittività del mio dato. Oppure se io non posso avere accesso a colture cellulari umane immortalizzate che contengono il recettore, allora io posso utilizzare cellule transfettate in cui viene inserito il recettore. Allo stesso modo devo stare attenta nella scelta del radioisotopo da utilizzare per marcare direttamente il mio farmaco. Il radioisotopo che andrò ad utilizzare deve avere caratteristiche chimiche importanti che ci permettono di seguire la radioattività che deriva dal decadimento del radioisotopo e quindi deve avere un tempo di decadimento ottimale e un'attività specifica ottimale. L'inserimento dell'isotopo corrispondente al posto dell'atomo nella struttura del mio farmaco non deve determinare un cambiamento tale nella struttura chimica del composto, quindi vengono spesso usati il trizio [H] e lo iodio 125 [I]. Successivamente si può proseguire con l'esperimento, quindi si.

incuba in varie provette una quantità fissa del mio preparato biologico e concentrazioni crescenti del mio farmaco radiomarcato, si attende il tempo necessario per raggiungere l'equilibrio e all'interno delle provette quindi avremo una quantità di farmaco libero che non si è legato al recettore, una quantità di complessi recettore-farmaco e una quantità di recettore libero. Noi vogliamo studiare l'interazione quindi ci interessano solo i complessi.

Il passo successivo è la separazione dei complessi farmaco-recettore dal resto del preparato e può essere fatto con 3 modalità:

• Filtrazione: il preparato viene filtrato su una membrana di vetro che farà passare il radioligando libero e il recettore non legato mentre tratterà i complessi. Noi utilizzeremo la membrana di vetro per verificare la radioattività dei complessi. Il processo di filtrazione è il processo di separazione più utilizzato,

anche in questo caso abbiamo una perdita della radioattività in quanto per essere eseguita correttamente la filtrazione deve essere rapida.

• Centrifugazione: si basa sul fatto che ad una determinata velocità di centrifugazione tenderanno a precipitare i complessi in quanto sono più pesanti, mentre rimarranno nel soprannatante le molecole che non si sono legate, quindi dopo la centrifugazione si elimina il soprannatante e il pellet viene risospeso e la radioattività viene determinata nella sospensione. Questo tipo di metodo ha una variabilità più alta rispetto alla filtrazione perché durante la centrifugazione alcune molecole di ligando non legato possono rimanere intrappolate nel pellet quindi si ha una sovrastima dei complessi farmaco-recettore.
• Dialisi: si utilizzano due camere separate da una membrana semipermeabile attraversabile solo dal farmaco libero quindi in una camera metteremo il contenuto della provetta e dopo un po' di tempo il farmaco libero passerà nella seconda camera attraverso la membrana, mentre i complessi rimarranno nella prima camera. La radioattività viene quindi determinata nella seconda camera.

di tempo avremo il ligando libero che si è equilibrato in entrambi i compartimenti. Purtroppo con questo metodo non riusciamo a separare fisicamente il complesso quindi dobbiamo valutare la radioattività in entrambe le camere: in una camera avremo la somma della radioattività dei complessi + la radioattività del ligando libero, questa quota di radioattività di ligando libero è uguale a quella che ritroviamo nella seconda camera in quanto si è equilibrato nelle due camere di dialisi quindi avremo la radioattività dei complessi tramite una differenza. La filtrazione è più utilizzata ma essendo un metodo un po' "violento", ovvero che può andare a separare i complessi, è preferibile non utilizzarlo nel caso in cui la forza di legame non è molto alta. Dopo che abbiamo determinato la radioattività io attengo una curva che crescerà all'aumentare di farmaco radiomarcato e chesuperiore rispetto al radioligando. In questo modo, il mio farmaco non marcato si lega in modo preferenziale alle molecole del preparato biologico che non sono recettori specifici per il radioligando. Successivamente, si procede a misurare la quantità di radioligando legato al preparato biologico in presenza del mio farmaco non marcato. La differenza tra la quantità di radioligando legato in presenza del mio farmaco non marcato e la quantità di radioligando legato in assenza del mio farmaco non marcato rappresenta il binding aspecifico. In questo modo, si può ottenere una curva di binding specifico, che rappresenta solo i complessi farmaco-recettore desiderati, e una curva di binding totale, che include sia i complessi farmaco-recettore che i legami aspecifici. Utilizzando i tag html, il testo formattato sarà il seguente:

Arriva a una saturazione (a un plateau) nel momento in cui tutti i recettori del preparato biologico saranno legati dal mio farmaco MA IN REALTA' si osserva una curva che cresce senza raggiungere un plateau. Ciò avviene perché, soprattutto ad alte concentrazioni di radioligando, esso può andare a legarsi ad altre molecole del preparato biologico in maniera aspecifica perciò la curva non va a saturazione e quindi viene detta CURVA DI BINDING TOTALE perché si vedono sia i miei complessi farmaco-recettore che i legami aspecifici che noi non vogliamo avere.

Per determinare il binding aspecifico si rifà l'esperimento di binding esattamente allo stesso modo quindi con stesso preparato biologico e stessa concentrazione del radioligando, l'unica differenza è che in tutte le provette viene aggiunto in concentrazioni molto elevate il mio farmaco non marcato. Quindi il mio farmaco non marcato presente in una concentrazione 1000 volte superiore rispetto al radioligando. In questo modo, il mio farmaco non marcato si lega in modo preferenziale alle molecole del preparato biologico che non sono recettori specifici per il radioligando.

Successivamente, si procede a misurare la quantità di radioligando legato al preparato biologico in presenza del mio farmaco non marcato. La differenza tra la quantità di radioligando legato in presenza del mio farmaco non marcato e la quantità di radioligando legato in assenza del mio farmaco non marcato rappresenta il binding aspecifico.

In questo modo, si può ottenere una curva di binding specifico, che rappresenta solo i complessi farmaco-recettore desiderati, e una curva di binding totale, che include sia i complessi farmaco-recettore che i legami aspecifici.

superiore andrà a competere con il mio farmacoradiomarcato per il legame specifico al recettore mentre questa competizione non c'è su siti di legame aspecifici quindi al recettore si lega il ligando non marcato (grazie all'alta concentrazione) mentre non potrà competere per il legame aspecifico. Dopo vado a separare tramite filtrazione o altro metodo e valuto la radioattività che è esclusivamente la radioattività dovuta al legame con i siti aspecifici, quindi il grafico ottenuto è una retta perché c'è una diretta proporzionalità tra concentrazione di farmaco e formazione di legami aspecifici. Quindi per determinare la vera curva per il saggio di binding per saturazione basta sottrarre alla curva di binding totale i punti della retta di binding non specifico quindi finalmente ottengo la CURVA DI BINDING SPECIFICO. DETERMINAZIONE DELL'AFFINITÀ DALLA CURVA DEL SAGGIO BINDING PER SATURAZIONE Dallacurva di binding specifico. Ottengo la Bmax o binding totale che corrisponde alla radioattività che noi raggiungiamo nel momento in cui arriviamo al plateau della curva e quindi è la radioattività massima che otteniamo. Quindi la Bmax ci indica la quantità di recettori nel nostro preparato biologico. Un altro parametro che otteniamo dalla curva è la Kd che rappresenta la concentrazione di farmaco radiomarcato alla quale ho l'occupazione del 50% dei recettori disponibili. La Kd è espressa in nM ed è indice dell'affinità. Più piccola è la Kd, più alta sarà l'affinità del nostro farmaco per il recettore e quindi più stabile sarà lo stato di occupazione del recettore anche a concentrazioni basse. SAGGI DI BINDING PER COMPETIZIONE Si basano sulla capacità della mia molecola di farmaco che NON posso radiomarcare direttamente di spiazzare dal recettore bersaglio un altro.ligandi che possono essere radiomarcati, sono una determinazione più indiretta dell'affinità del farmaco per il recettore. La scelta del preparato biologico è la stessa e tutte le