Farmacologia - farmacinetica e dinamica

• STUDI DI INTERAZIONE DIRETTA FARMACO-RECETTORE: STUDI DI BINDING

• ISOLAMENTO, PURIFICAZIONE O CLONAZIONE DEL RECETTORE (la più recente)

Questi metodi non hanno solo vantaggi ma anche svantaggi.

Per una conoscenza completa dell’interazione tra farmaco e recettore dovrebbero essere applicati tutti

e tre. Studio delle CURVE DOSE-RISPOSTA o CONCENTRAZIONE-RISPOSTA

 Fino agli anni ’70 questa erano le uniche tecniche che avevamo a disposizione; tutt’oggi hanno

ancora una valenza scientifica estremamente importante. Danno informazioni sull’evento iniziale

(formazione di RX) a partire dall’analisi qualitativa e quantitativa di un evento successivo, cioè la

risposta biologica. È possibile andare a valutare l’attività enzimatica, la metabolizzazione, la

contrazione di un organo isolato, ecc. La scelta dell’evento che si va a valutare dipende da quello

che si ha a disposizione nel laboratorio, cioè dal tipo di apparecchiatura di si dispone.

Vantaggi: 59

a. immediata valutazione della rilevanza biologica del fenomeno studiato (se c’è o se non

c’è);

b. possibilità di studiare la specificità farmacologica del recettore in esame: è possibile capire

la natura, la potenza, si può anche distinguere tra l’attività che il farmaco può svolgere

come agonista oppure l’attività che esso può svolgere come antagonista.

Svantaggi:

• ignoranza, non conoscenza, di molti dei fenomeni che si interpongono fra l’interazione

farmaco-recettore (X-R) e la risposta biologica in esame. Non è possibile sapere quanto

complicato sia quello che avviene dal momento in cui c’è l’interazione farmaco-recettore al

momento in cui vado a valutare la risposta: si ha l’impossibilità di valutare quella che

effettivamente è l’interferenza di fenomeni che sono molto importanti.

• interferenza di assorbimento se si stanno eseguendo esperimenti in vivo; di

distribuzione e metabolismo sempre nel corso di esperimenti in vivo, ma anche quando si

stia utilizzando un preparato in organi isolati.

Studi di INTERAZIONE DIRETTA FARMACO-RECETTORE: STUDI DI BINDING

 Valutazione quantitativa dell’interazione tra un ligando marcato con un isotopo

radioattivo ed una preparazione contenente il recettore o il recettore stesso isolato e purificato.

Vantaggi:

• valutazione della presenza del recettore e identificazione del tipo e sottotipo del recettore:

le curve possono cambiare in maniera significativa a seconda che si stia studiando una

popolazione omogenea di recettori rispetto a quando ci si trovi in presenza di sottotipi

recettoriali.

• determinazione della localizzazione cellulare o subcellulare del recettore: a livello

nucleare, nel citoplasma o a livello di un altro organulo all’interno della cellula.

• determinazione dei parametri caratteristici dell’interazione farmaco-recettore: definisce la

densità del numero dei recettori presenti nel preparato studiato, ma soprattutto permette di

stabilire l’affinità che il farmaco ha per quel recettore.

Svantaggi:

• impossibilità di distinguere tra agonisti ed antagonisti

• difficoltà a distinguere tra recettori funzionali e siti di legame di altra natura, quelli che sono

stati chiamati “effettori”. Quindi si viene a sapere che il farmaco si lega, ma non si sa se il

legame è con un recettore propriamente detto oppure con un effettore.

ISOLAMENTO, PURIFICAZIONE e CLONAZIONE DEL RECETTORE

 Vantaggi:

• informazioni dettagliate su peso molecolare, struttura primaria, composizione in subunità

del recettore;

• determinazione della localizzazione del recettore;

• identificazione delle funzioni mediate dal recettore, che possono essere evidenziate

mediante la trasfezione del recettore, precedentemente isolato e amplificato, in cellule che

sicuramente non lo contengono. Quindi, se si evidenzia una risposta biologica data dal

recettore in fase di studio nel preparato dove esso è stato trasferito, sicuramente la

risposta sarà data dall’interazione del farmaco con lo specifico recettore che si sta

analizzando.

Svantaggi:

α. tecniche molto complesse e dispendiose in termini di tempo e di denaro

β. la caratterizzazione finale comporta anche l’utilizzo delle altre tecniche, soprattutto delle

tecniche di binding. 60

Problemi nella Purificazione del Recettore

Ci sono dei problemi nell’utilizzo di questa tecnica:

• quantità di recettore molto piccole: la superficie di una cellula presenta tra le 10.000 e le

-6 -4

20.000 molecole di recettore ormonale, pari a 10 delle proteine cellulari totali o a 10

delle proteine della membrana plasmatica (non è una quantità significativa);

• bassa concentrazione del recettore e alte concentrazioni di materiale estraneo: proteine e

sostanze estranee che possono mascherare o esasperare o permettere di mal

interpretare i dati sperimentali.

• I recettori sono per lo più proteine integrali di membrana, quindi per poterli purificare è

necessario solubilizzarli con detergenti non ionici (la Docente dice "ionici", ma la slide

mostrata si riferisce a detergenti non ionici, NdS) che possono mascherare differenze di

proprietà tra le proteine solubilizzate, e questo significa che si può non essere sicuri di

avere solubilizzato la proteina di interesse.

LA RELAZIONE DOSE-EFFETTO

Ogni effetto che risulta dall'esposizione di un sistema biologico (uomo, animale, organo isolato, cellule

in coltura, microrganismo) ad un farmaco o ad uno xenobiotico, può essere quantitativamente correlato

alla grandezza dell'esposizione, cioè alla dose di farmaco o xenobiotico. È quello che si è già visto: la

correlazione tra l'esposizione e la dose.

Relazione dose-effetto (Utilizzata soprattutto per esperimenti in vivo)

Dose: quantità di farmaco o xenobiotico introdotta per una certa via in un sistema biologico nell’unità di

tempo.

Può essere espressa come:

• mg/Kg nel caso della somministrazione singola, in mg/kg/die nel caso di una

somministrazione ripetuta;

• 2

mg/m nel caso ad esempio di farmaci antitumorali.

Relazione dose-effetto (Utilizzata per esperimenti in vivo e in vitro)

Concentrazione: quantità di farmaco o xenobiotico presente nel volume di esposizione.

Può essere espressa in:

mg/L o mM : peso o molarità del farmaco o xenobiotico per volume di soluzione.

Viene utilizzata:

• negli studi in vitro, dove cellule o tessuti in coltura sono esposti a farmaci o xenobiotici disciolti

nel terreno di coltura.

• inalazione di farmaci gassosi o vapori contenuti nell’aria respirata,

• esposizione a farmaci o xenobiotici contenuti nell’acqua dove vive l’organismo.

Ciò che è interessante e fondamentale è che ci siano due tipi di risposte considerando la relazione

dose-effetto:

1. RISPOSTE GRADUALI: modificate a seconda della dose. Risposte che possono essere misurate

in continuo: la risposta aumenta gradualmente all'aumentare della dose del farmaco tendendo ad un

valore massimo (risposta direttamente proporzionale alla dose). → grafici mostrati fino ad ora nelle

slides.

Esempi:

- in vivo si può andare a valutare l'aumento o la diminuzione della pressione arteriosa, o della

frequenza cardiaca; 61

- in vitro: la contrazione e il rilasciamento di una striscia di muscolo liscio, oppure l'attivazione o

l'inibizione di un enzima.

I parametri valutabili sono potenza ed efficacia del farmaco.

2. RISPOSTE QUANTALI: sono risposte del tipo “tutto o nulla” (la morte o meno dell'animale, la

presenza o l'assenza di una determinata risposta, l'inizio del sonno, ecc.); le risposte si presentano

con una soglia di comparsa o scomparsa dell’effetto. Si correla poi la dose del farmaco col numero

di individui di una popolazione che risponde a tale farmaco (frequenza). Quindi nell'ambito delle

risposte quantali si va a valutare la variabilità della risposta ottenuta nella popolazione che si è presa

in considerazione.

La Varabilità Biologica e lo Studio delle Relazioni Dose-Effetto

Si riscontra una grande variabilità biologica analizzando una popolazione il più omogenea possibile

(specie, età, sesso), la qual cosa impone che esperimenti finalizzati allo studio degli effetti dei farmaci o

xenobiotici negli organismi viventi non vengano effettuati su singoli individui, ma su gruppi di individui

omogenei tra loro.

Anche nel caso della valutazione e ottimizzazione dei risultati ottenuti in questo ambito, importantissimo

è il supporto che viene dato dalla statistica, perché permette di ridurre significativamente il numero di

individui da considerare per avere una valutazione statisticamente valida.

. Se l'effetto osservabile è di tipo graduale, la variabilità biologica interindividuale si riflette sul diverso

grado di intensità dell'effetto alle varie dosi;

. se invece l'effetto è di tipo quantale, la variabilità biologica interindividuale si riflette sul numero di

individui della popolazione che presentano la risposta a diverse dosi.

Il primo tipo di risposta valuta la potenza e l'efficacia del farmaco, il secondo la frequenza di risposta al

farmaco considerato.

Studio delle Risposte Quantali: Esempio

In una popolazione murina omogenea per ceppo, sesso, età, peso e condizione di allevamento e di

stabulazione si valuta una risposta quantale, come ad esempio la morte. Questo dopo aver suddiviso in

modo randomizzato gli animali in vari gruppi trattati con diverse dosi di farmaco (o xenobiotico) X.

I dati relativi alla dose e al numero degli animali morti nella popolazione saranno distribuiti

normalmente. Tale distribuzione permette di osservare che ci sono alcuni (pochi) animali

particolarmente sensibili al farmaco, quindi moriranno con dosi particolarmente basse; dal lato opposto

della campana, sono situati gli animali iposensibili o resistenti che muoiono per dosi molto alte;

chiaramente però la stragrande maggioranza degli animali della popolazione in esame risponde per

dosi comprese nella parte centrale (nella mediana) di questa distribuzione. La mediana viene

rappresentata esattamente dall'intersecazione dell'area sotto la curva della distribuzione normale con

l'asse delle ascisse (si pensa che la prof. volesse intendere che la mediana è rappresentata

dall'intersezione di una linea verticale passante per il punto più alto della curva con l’asse delle ascisse,

o qualcosa del genere. NdS): il numero di animali a destra di questa linea, e quello degli animali a

sinistra rappresenta il 50% della popolazione; quindi la dose let