Farmaci antivirali Lezione 5

Lezione 19 – Virologia 11/12/2014

Diagnosi di infezione virale

Tra le varie prove di infettività ricordiamo il metodo delle placche per quanto riguarda i batteriofagi, la quale viene effettuata su piastra mediante numerazione delle placche adese in un monostrato batterico dove appunto i virus creano lisi e formano le caratteristiche placche. I virus vengono inclusi in una soluzione di terreno e addensante (agar o carbossilmetilcellulosa, inerti), la sospensione virale viene poi distribuita sui batteri e la formazione di lisi si appalesa con la comparsa delle placche stesse (aree trasparenti sulla piastra).

Il metodo delle pustole in cui avviene la numerazione di aree di emoagglutinazione o di aree di lisi cellulare della membrana corioallantoidea è specifico per alcuni virus come l’herpes virus o il virus vaccinico o ancora il virus dell’influenza, e la titolazione sia per quanto riguarda l’infettività dei batteriofagi sia per l’infettività di altre specie virali destinate alle cellule animali su piastra e la numerazione delle placche con il metodo della diluizione. In realtà il metodo della diluizione viene utilizzato anche inoculando animali, andando a verificare le attività indirette del virus come l’emoagglutinazione e da ciò poi scaturisce il titolo del virus che causa effetti citopatici, citotossici letali per gli animali e andando poi ad individuare la dose infettante (mediante emoagglutinazione, test di neutralizzazione).

La diagnosi di infezione virale si avvale delle tecniche di biologia molecolare, in cui si va a cercare il genoma virale mediante l’utilizzo di sonde specifiche. I test per identificare proteine e acidi nucleici virali durante la replicazione virale sono:

• Pattern di proteine (mediante SDS-PAGE, quindi elettroforesi)
• Emoagglutinazione ed emoadsorbimento
• Ricerca di antigeni (mediante immunofluorescenza diretta o indiretta, test ELISA, WESTERN BLOT, quest’ultimo poco utilizzato)

Altre metodiche adottate sono i test radioimmunologici che utilizzano anticorpi marcati e permettono di valutare la separazione delle proteine ed antigeni specifici virali ottenuti con il Western Blot, utilizzando quindi reazioni antigene – anticorpo. La ricerca in situ del DNA mediante Southern Blot, Northern Blot si basa sulla amplificazione del genoma partendo da un materiale biologico idoneo o su processi di retrotrascrizione per quanto riguarda i Retrovirus.

Le caratteristiche distintive per identificare un virus sono rappresentate dalla sequenza genica e dalla struttura del genoma. Le sequenze specifiche sono rilevate attraverso endonucleasi di restrizione per i virus a DNA o attraverso profilo elettroforetico dell’RNA. I metodi più innovativi per rilevare il genoma virale sono invece basati su amplificazione del genoma mediante PCR o l’utilizzo di sonde genetiche.

La diagnosi diretta con queste metodiche risulta essere più rapida e specifica. Queste metodiche di biologia molecolare permettono l’identificazione di virus a basse concentrazioni, virus latenti ed integrati (quali herpesvirus, retrovirus e papillomavirus) e virus particolarmente pericolosi e difficili da isolare in vitro. La Real – Time PCR permette di determinare, ad esempio, la quantità di HIV, molto spesso quiescente. La PCR è centrata su un’amplificazione basata sulla trascrizione per mezzo di una trascrittasi inversa e primers specifici per sequenze virali. Si forma un cDNA complementare alla sequenza riconosciuta dalla RNA polimerasi DNA - dipendente del batteriofago T7. Successivamente una RNAasi digerisce l’RNA e il DNA è trasformato in RNA dalla T7 – RNA polimerasi. Infine le nuove sequenze di RNA sono circolarizzate in una reazione per amplificare la sequenza bersaglio.

Diagnosi indiretta di infezione virale

La diagnosi indiretta di infezione virale prevede invece una diagnosi di tipo sierologica che si basa sulla ricerca di anticorpi specifici contro determinati antigeni (proteici o capsidici) e quindi del titolo anticorpale. La sieroconversione e la valutazione di anticorpi specifici contro determinati antigeni, dove questi antigeni possono essere evidenziati a varie fasi della replicazione virale, ci permettono di valutare l’evoluzione della malattia. Inoltre permettono di discriminare un aumento del titolo anticorpale significativo della fase acuta o della fase di convalescenza e di individuare in che fase dell’infezione ci troviamo.

Nella diagnosi indiretta sierologica si possono individuare dei saggi funzionali capaci di evidenziare specifiche attività derivanti dalla formazione di immunocomplessi. Tra questi vi sono:

• La reazione di inibizione dell’emoagglutinazione in cui si utilizzano anticorpi in grado di inibire l’attività emoagglutinante di alcuni virus (influenza, parainfluenza, morbillo)
• La reazione di fissazione del Complemento, in cui vi sono anticorpi capaci di bloccare l'attività