Espressione genica I

Si prendeva il trascrittoma di due tipologie di campioni da

confrontare. Il trascritto veniva retrotrascritto in DNA

complementare per ragioni di stabilità. Si colorava di colori diversi

con la fluorescenza i due campioni. I due campioni vengono poi

miscelati e la miscela va su un chip. Poi avviene l ibridazione, in cui

le seq sul chip denaturate quindi che diventano a singolo filamento

vanno poi a legarsi alle seq complementari, quindi avrò segnale in

tutte le posizioni che si sono legate al campione, sia per il canale in

rosso che in verde. Scansionando la superficie con un laser avrò

fluorescenza nelle diverse bande. Così ho una quantificazione

digitale e poi elaborando l immagine posso ottenere le quantità e capire

quali sono le posizioni che hanno più trascritto.

Ottengo un immagine con degli spot luminosi emessi dai fluorofori

presenti. L analisi di immagine per la quantificazione del segnale

luminoso associato a ciascun fluoroforo o canale prevede:

1. il grid alignment, ovvero il posizionamento della griglia dei pixel

sull immagine, quindi devo trovare la posizione degli spot in termini di

pixel della matrice

2. segmentazione, ovvero devo selezionare i pixel appartenenti

allo spot luminoso

3. estrazione dell intensità, quindi associare allo spot luminoso un

valore numerico che può essere la media la mediana ecc, cioè la

quantificazione del livello di espressione

4. correzione di background, ovvero devo tenere in conto della

possibile luminosità dello sfondo e quindi devo sottrarla alla

luminosità complessiva per ottenere solo quella legata agli spot

5. valutazione della qualità degli spot, ovvero devo valutare la

qualità dell esperimento guardando la forma la dimensione l

uniformità degli spot.

Posso usare dei grafici di tipo scatter plot per rappresentare i dati d

espressione. Sugli assi ci sono G e R cioè green e red che sono i

colori degli spot indagati. Il valore è riportato dopo la

trasformazione logaritmica, per rendere i valori simili a una

distribuzione normale. Ogni punto è un trascritto. Se per i due

campioni i valori sono simili allora i punti saranno sulla bisettrice. Se

mi allontano dalla bisettrice vuol dire che ho delle differenze. Sono

quantificazioni relative, non ottengo concentrazioni di espressione ma

sono quantificazioni relative, non assolute. I punti che si allontanano

dalla bisettrice sono quelli che ci interessano perché

rappresentano le differenze riscontrate tra i due campioni. Lo

scatterplot a destra è molto usato, ovvero l MA plot, sull asse y ho il

log (R/G) e sulle x ho la semisomma di logR e logG ovvero la

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media. A sinistra ho i valori a bassa intensità, a destra quelli ad alta

intensità. I trascritti non differenziali si trovano lungo l orizzontale

per 0 ovvero quando R=G quindi R/G=1 quindi il log è 0.

Con l MA plot posso vedere se ci sono bias sistematici. Es per i valori

a bassa intensità vedo un andamento non lineare, vedo una

distorsione, perché chiaramente dal pov biologico non ha senso che per

valori poco espressi ci sia una differenza grande tra R e G.

L andamento generale delle curve nei due grafici a scatter plot deve

essere rispettivamente la bisettrice e la retta orizzontale per 0, solo

alcuni punti saranno fuori da questo andamento e saranno quelli

differenziali.

Si possono applicare delle normalizzazioni. Una normalizzazione

preprocessing, prima del risultato su cui vedere le differenze, è quella

in cui si trasla la nuvola di punti di un certo valore lungo la

verticale, qunidi è un aggiustamento globale. Per capire di quanto

traslare vado a vedere l espressione dei geni housekeeping cioè

quelli base che non riteniamo differenziali. Si può prendere una media o

una mediana del set di questi hk per es. Tolgo ai punti l intensità

degli hk. Ci sono alcuni geni sempre usati come hk, ci sono però delle

eccezioni. c = log k.

2

Oppure posso sottrarre a ciascun punto un valore che non è una

costante ma dipende dall intensità dell espressione (x). Di solito

non si prende tutta la nuvola ma solo il cuore, di solito il 20%, si tolgono

gli outlier, per evitare di deformare troppo la nuvola. Questa

normalizzazione si chiama lowess = LOcally WEighted Scatterplot

Smoothing. Se vediamo che nel grafico c è un andamento che segue la

linea rossa, identifichiamo le oscillazioni per ogni valore di A

ovvero c=c(A) e lo sottraiamo ai punti.

Dye swap. La procedura di prima dipende molto dall efficienza dei

fluorofori (detti anche dye). A volte quindi si ripeteva l esperimento

scambiando i fluorofori, esperimento a canali invertiti. Quindi il log

ratio doveva venire molto simile a – il log ratio dell invertito. Per

valutare l affidabilità del risultato.

Questa è una tecnologia superata ormai. Poi arrivano gli array a

oligonucleotidi. Qui le sequenze sono sintetizzate direttamente

sul vetrino (in situ), che è il chip, con una tecnica fotolitografica con

la maschera. Le sonde sono brevi tipo 5 basi da cui il termine

oligonucleotidi, di cDNA. Il vetrino è suddiviso in tanti quadranti, ogni

quadrante contiene tante copie della stessa seq. Il trascritto viene

marcato dal fluoroforo e si va a legare alle sonde complementari, avviene

l ibridazione, la molecola di trascritto è marcata quindi con la scansione

vedo il segnale sulle posizioni in cui è avvenuto il legame, dove non c è

segnale significa che non è avvenuta l ibridazione.

Feature è il quadrante contenente tante copie di una stessa seq

sonda o probe. Di solito le dimensioni del quadrante sono di 5x5 micron,

contenenti milioni di copie della sonda. La sonda è una seq breve,

oligonucleotide, di qualche decina di basi, di solito 25 bp.

Probe set. Se abbiamo una seq breve abbiamo una sonda meno

specifica, perché può essere complementare a tante seq lunghe diverse.

Al contrario, una seq lunga aveva la sua specificità. Qunidi devo

mappare un gene usando non una singola sonda ma un insieme di

sonde, un probe set, dove ogni sonda è una sottosequenza, con un

certo overlap tra loro.

Probe pair. In alcuni macroarray non c è solo il probe set ma anche

delle sonde alterate, formando i probe pair. Ovvero, ogni probe pair è

costituito dalla sonda ovvero dalla sottoseq considerata del trascritto,

che è detta match probe, e da un'altra sonda identica ma con una

diversa base nel centro, che è detta mismatch probe. Questo serve per

valutare i leg non specifici, cioè se il trascritto si lega anche al

mismatch probe vuol dire che c è un problema.

Nel caso del microarray a cDNA: uso una singola sonda per ogni

trascritto; il trascrittoma marcato è doppio, perché vado sul vetrino con

la miscela dei campioni, quindi ho un ibridazione competitiva in cui

il leg è favorito dalla concentrazione maggiore o minore del trascritto di

un campione rispetto all altro. Negli oligonucleotidi (microarray di

Affymetrix): ho un set di sonde perché da sole non sarebbero

abbastanza specifiche; sul vetrino vado con il trascrittoma di un singolo

campione, ogni campione corrisponde a un vetrino, non c è ibridazione

competitiva.