Espressione della regolazione genica

Regolazione dell'espressione genica nel sistema Lac operon

I+ è dominante anche in cis. Anche in presenza di IPTG, non si esprimono comunque.

Conclusioni:

• I- è recessivo su I+
• I+ è dominante sia in cis che in trans su I-
• Is è dominante su I sia in cis che in trans ed è detto superepressore, perché non si ha induzione anche in presenza di IPTG.

Sulla base di questi dati è stato costruito il modello regolativo. LacI codifica per un repressore, un omotetramero costituito da quattro subunità. In condizioni normali, il repressore, in assenza di induttore (lattosio) si lega all'operatore e, per ingombro, impedisce alla polimerasi di procedere, quindi non vengono prodotti i tre geni strutturali. Se nel terreno di coltura è presente lattosio o IPTG, questo cambia di conformazione, si stacca dall'operatore O, l'rnasi può trascrivere, quindi viene prodotto β-l'RNA che poi sarà tradotto in galattosidasi, permeasi, transacetilasi.

I- indica l'assenza del repressore, quindi è costitutivo.

I+ è dominante su I- in cis e in trans. Il repressore non viene prodotto, pertanto si ha sempre espressione perché il repressore non può legarsi a O, anche in assenza di lattosio o IPTG. Tuttavia, se introduciamo mediante plasmide F' un gene I+, questo produce un repressore che si legherà sia all'operatore del plasmide F' (cis) che all'operatore del cromosoma batterico (trans).

Is non consente l'induzione: i geni sono sempre repressi perché codifica per un super-repressore, cioè per una proteina che è in grado di legarsi all'operatore, ma non all'induttore (IPTG o lattosio), per cui rimane sempre attivo e si lega sempre all'operatore, impedendo la trascrizione. Is è dominante su I+.

La mutazione Is non consente l'interazione con l'induttore (non riconosce l'induttore), probabilmente per alterazione del sito di legame con l'induttore: in ogni caso, in presenza di...

undiploide parziale in cui si ha un Is, si ha sempre repressione, anche in presenza dell’induttore. Se ipotizziamo la presenza di un repressore che, in assenza dell’induttore, si lega al DNA impedendo la sintesi di mRNA, si devono anche trovare mutanti alterati nella regione di riconoscimento del repressore (operatore). Ogni repressore lega uno specifico operatore. Li immaginiamo come costitutivi anche in presenza di un induttore. O rappresenta il sito di interazione con il repressore. Attraverso l’analisi genetica è stato localizzato tra I e Z. Oc non è riconosciuto dal repressore che non si lega, permettendo l’espressione dei geni adiacenti. Anche in presenza di Is (repressore che non riconosce l’induttore) si osserva costitutività. OC è epistatico su IS. L’operatore rappresenta una sequenza di DNA localizzata fra il promotore e il gene Z, dove inizia la trascrizione. Il repressore si lega specificamente all’operatore.

Il legame del repressore previene la trascrizione da parte della RNA polimerasi. L'operone Lac è quindi sotto il controllo negativo da parte del repressore.

In presenza dell'induttore, il repressore interagisce con l'induttore e si stacca dall'operatore. Il repressore interagisce alternativamente con l'induttore o con il DNA al sito operatore.

Il repressore è una proteina allosterica, con un sito di riconoscimento del DNA al sito operatore e un sito di riconoscimento dell'induttore. Il legame con l'induttore altera la struttura conformazionale della proteina repressore. Questa variazione modifica il sito di riconoscimento con l'operatore diminuendo l'affinità di legame.

L'assenza del legame del repressore all'operatore lascia libera la RNA polimerasi di attuare la trascrizione dell'operone Lac.

In presenza di glucosio non è presente galattosidasi, nemmeno a basso livello. Se le cellule vengono

trasferite da glucosio alattosio la galattosidasi viene indotta più tardi. L'operon Lac è sottoposto ad un secondo controllo: repressione da cataboliti. Facendo crescere cellule in terreno contenente glucosio a bassa concentrazione (limitante) + lattosio si ottiene una curva diauxica (con due picchi separati), perché inizialmente viene utilizzato solo glucosio, che permette la crescita. Quando il glucosio viene terminato, si ha una fase lag di adattamento, in cui si devono esprimere i geni dell'operone Lac. A questo punto si comincia ad utilizzare la seconda fonte di carbonio presente nel terreno (lattosio) e ricomincia la crescita esponenziale. Quando anche il lattosio sarà terminato, seguirà una seconda fase lag. Diminuendo la concentrazione iniziale di glucosio, si anticipano la comparsa del plateau (fase lag) e l'utilizzazione del lattosio come fonte di carbonio. Questa osservazione fu attribuita all'esclusione dell'induttore in

presenza di glucosio: si riteneva che in presenza di glucosio non vi fosse l'induttore necessario per produrre gli enzimi codificati dall'operone Lac. Nei mutanti costitutivi Oc e I-, in cui l'espressione c'è sempre, non si osserva la curva diauxica, quindi glucosio e lattosio vengono consumati insieme. Questo fenomeno prende il nome di repressione da cataboliti perché non si verifica solo in presenza di glucosio, ma anche di suoi derivati, come glucosio-6-fosfato, fruttosio, che sono derivati della glicolisi (cataboliti perché derivano dalla degradazione del glucosio). È un tipo di controllo generalizzato attivo su sistemi enzimatici che non sono necessari in presenza di glucosio (es. enzimi necessari per l'utilizzo di fonti di carbonio alternative). In presenza di glucosio si ha una drastica riduzione del livello intracellulare di AMPc. La repressione da catabolita dell'operone Lac e di parecchi altri operoni è mediata da

una proteinaregolativa chiamata CAP (da Catabolite Activator Protein, proteina di attivazione del catabolita),chiamata anche CRP. Per l'induzione del sistema Lac sono necessari alto livello di AMPc e proteina CAP oltre all'induttore. Il complesso CAP-AMPc facilita il legame della RNA polimerasi al promotore dell'operon Lac e, in presenza dell'induttore rende possibile la trascrizione. Glucosio presente (AMPc basso) lattosio assente: non c'è sintesi di mRNA. Glucosio presente (AMPc basso) lattosio presente: sintesi di mRNA a basso livello. Glucosio assente (AMPc alto) lattosio presente: Si forma il complesso CRP-AMPc che si lega al promotore. Il repressore è inattivato dall'induttore. Si ha produzione di mRNA in gran quantità. Il complesso CAP-AMPc è una proteina che si lega al DNA e ne causa la curvatura: si è osservato che questa ripiegatura aumenta l'efficienza di legame da parte dell'RNA polimerasi e,Quindi, l'inizio della trascrizione. L'operone Lac è quindi sotto il controllo negativo da parte del repressore che blocca l'espressione genica. repressione (regolazione negativa): e sotto il controllo positivo da parte del complesso CAP-AMPc: attivatori dell'espressione genica attivazione (regolazione positiva): Questa doppia regolazione permette ai batteri di utilizzare gli zuccheri in modo efficiente: se sono presenti sia glucosio che lattosio, verrà utilizzato prima il glucosio perché dà la massima resa energetica, perché i geni che codificano per gli enzimi coinvolti nella glicolisi sono espressi sempre ad alto livello in maniera costitutiva e non vengono espressi enzimi come quelli necessari per il catabolismo del lattosio, la cui sintesi richiederebbe energia. Una volta esaurito il glucosio, sarà possibile utilizzare il lattosio come fonte di energia. Struttura delle regioni di controllo dell'operone Lac Operone TRP di E.a cui si lega un repressore, e un operatore attivatore, a cui si lega un attivatore. La presenza di triptofano nel mezzo di coltura inibisce la trascrizione dell'operone TRP. In assenza di triptofano, il repressore si lega all'operatore e impedisce la trascrizione. Quando il triptofano è presente, si lega al repressore e lo rende incapace di legarsi all'operatore, permettendo così la trascrizione dell'operone. Inoltre, la presenza di triptofano influenza anche il meccanismo di attenuazione. Durante la fase di allungamento della trascrizione, se il triptofano è presente in quantità sufficiente, viene sintetizzato un peptide chiamato leader peptide che causa la formazione di una struttura a tronco di cono nell'mRNA. Questa struttura impedisce la formazione del terminatore di trascrizione, permettendo così la trascrizione completa dell'operone. Invece, se il triptofano è presente in quantità limitata, il leader peptide non viene sintetizzato e la trascrizione viene attenuata, cioè interrotta prima di raggiungere la regione codificante.che svolge un ruolo analogo a quello di Lac, anche se il tipo di regolazione è diverso, e una regione leader (trpL) che contiene l'attenuatore, che contiene una sequenza specifica che permette di bloccare la trascrizione, qualora essa sia già iniziata, in presenza di triptofano. La prima regolazione è una repressione a controllo negativo: a monte dell'operone trp è presente il gene trpR, che codifica per una proteina aporepressore. In presenza di triptofano, l'aporepressore è inattivo, non si lega all'operatore, per cui l'RNA polimerasi può legarsi al promotore e iniziare la trascrizione dell'RNA policistronico, che sarà poi tradotto per sintetizzare gli enzimi per la sintesi di triptofano. In presenza di triptofano, invece, questi geni non vengono trascritti: il triptofano si comporta da corepressore, si lega all'aporepressore e forma con esso un olorepressore, cioè un repressore attivo, che silegamento indipendente dal repressore); - in un mutante Oc (costitutivo) la presenza del triptofano non inibisce completamente la trascrizione (quindi deve esistere un secondo meccanismo di repressione). Questi risultati hanno portato all'ipotesi dell'esistenza di un secondo sistema di regolazione, chiamato sistema di attenuazione. In questo sistema, la presenza di triptofano determina la formazione di una struttura a forcina nel trascritto primario, chiamata terminatore di attenuazione, che impedisce la sintesi del trascritto completo. Il sistema di attenuazione è basato sulla presenza di sequenze specifiche nel trascritto primario, chiamate sequenze di attenuazione. Queste sequenze sono composte da due regioni: una regione leader, che contiene il codone di terminazione del peptide leader, e una regione di terminazione, che contiene il terminatore di attenuazione. La presenza di triptofano determina la formazione di un complesso tra il triptofano e il peptide leader. Questo complesso induce la formazione della struttura a forcina nel trascritto primario, impedendo all'RNA polimerasi di progredire e terminando la trascrizione. Nel caso in cui il triptofano sia presente in quantità limitate, il complesso tra il triptofano e il peptide leader non si forma e la struttura a forcina non si forma. In questo caso, l'RNA polimerasi può proseguire la trascrizione e sintetizzare il trascritto completo. In conclusione, il sistema di regolazione dell'operone del triptofano è basato su due meccanismi: il sistema di repressione, mediato dal repressore R, e il sistema di attenuazione, mediato dalla formazione di una struttura a forcina nel trascritto primario. Questi meccanismi permettono una regolazione precisa dell'espressione dei geni dell'operone del triptofano in risposta alla presenza o all'assenza di triptofano.