Esperimenti: Appunti di Biochimica Applicata

METODI INDAGINE CELLULE NELLA LORO INTEREZZA:

A) METODI ANALITICI:

1. CITOMETRO A SCANSIONE
2. CITOMETRO A FLUSSO (O CITOFLUORIMETRO)

B) METODI PREPARATIVI:

1. CENTRIFUGAZIONE
2. CROMATOGRAFIA
3. AGGLUTINAZIONE
4. CELL SORTER

(1) (rimozione di acidi nucleici puri prive di proteine ed enzimi sfruttando sali chaotropici e modulando l'attività biologica delle molecole

(2) strumento che permette l'esame delle cellule in sospensione mentre fluiscono di fronte a una sorgente di luce perfettamente collimata e prevalentemente laser, a 4000/6000 per secondo.

I metodi a flusso pifferi sono quelli in fluorescenza per requisiti di analisi e sensibilità di azione.

SORGENTE LASER

Ar 488 nm

INIEZIONE DI CELLULE MARCATE (10⁶/mL)

IN FLUSSO LAMINARE CON SOLUZIONE TAMPONE

DIFFUSIONE: f diametro cellulare ( forward scatter )

DIFFUSIONE: f diametro cellulare

RIFLESSIONE, RIFRAZIONE: f granularità interna, rapporto nucleo/citoplasma, rugosità di superficie e diametro cellulare (side scatter)

CITOGRAMMA: combinazione dei suoi tipi di segnali

(6) le cellule con determinati valori di fluorescenza e scattering possono essere separate da un altro sorter posto a valle dell’atomo di flusso.

(+)

(=)

(-)

elettrodo che applicando una d.d.p. emette attivo che carida le cellule, le quali vengono raccolte nei contenitori dedicati determinati, mentre le molecole neutrali sono raccolte da uno aspiratore

Ar

COTURE DI CELLULE E TESSUTI ANIMALI

A) Coture Primarie: frammentazione meccanica dei tessuti e trattamento con enzimi che indriscono proteine e contentuti della matrice. Ridotta capacità replicativa.

B) Linee Cellulari: popolazioni cellulari omogenee derivanti da colture primarie di tumori Hanno alta capacità replicativa.

STUDIO DELLA PROTEINA: 1) Estrazione, 2) Purificazione, 3) Saggi

Biologici e/o Quantificazione

1. PROTEINE EXTRACELLULARI: rimuovere il materiale insolubile per centrifugazione o filtrazione
2. PROTEINE INTRACELLULARI: rottura delle cellule e centrifugazione differenziale
   • avviene in tampone e, se asfetto, isotermico, e pH fisiologico
   • la temperatura è mantenuta costante a 0-4°C per limitare denaturazione
   • no fa uso di chelanti es. EDTA
   • si usano e conservazione del nucleo e i ribosomi. DTT e β-mercaptoetanolo che sono riducenti ed evitano l'ossidazione proteica

Metodi di rottura:

• SHOCK OSMOTICO: rompere la cellula variando l'osmolarità con un mezzo ipotonico o ipertonico e poi ipotonico
• CICLI CONGELAMENTO/SCONGELAMENTO
• DIGESTIONE ENZIMATICA CON PROTEASI
• SOLUBILIZZAZIONE CON DETERGENTE per proteine di membrana. Un molto usato è il Triton X-100 non ionico
• Metodi meccanici: FRULLATORI: forze di taglio
• I OMOZENIZZATORI: forze di cavitazione
• - ULTRASUONI: onde sonore ad altra frequenza

2. La purificazione avviene seguendo vari stadi: all'inizio facciamo precipitare le proteine dall'estratto grezzo e poi si procede con cromatografia a scambio ionico, cromatografia per esclusione, cromatografia per affinità

METODO DI LOWRY:

sensibilità buona, specificità bassa, accuratezza moderata/bassa

• Reattivi di Folin - Ciocalteu: acido fosfotungstico e fosfomolibdico
• Vengono ridotti a pH alcalino e pH alcalino; si forma un complesso del rame congiurazione degli acidi indicati in tungsteno e molibdeno, entrambi blu
• Termina l'andamento con 500 e 700 nm

Ci sono interferenze da ioni K⁺ e Mg²⁺, ione TRIS e EDTA

Necessario una curva di taratura

METODO BCA (Acido Bicinchonico):

sensibilità medio-alta, specificità media, accuratezza buona

10 μg

Modifica del metodo di Lowry: il complesso cu²⁺- proteina viene chelato dall'acido bicinchonico per avere un complesso molto stabile di colore violetto che assorbe a 562 nm; è più stabile del Lowry e non ci sono interferenze di lipidi e detergenti.

METODO DI BRADFORD

sensibilità alta, specificità media, buona accuratezza

5 μg

Colorante Coomassie Brilliant Blue G-250 in soluzioni acide; il massimo del il massimo di assorbimento del colorante dal 465 nm a 595 nm quando è legato a proteine.

Dei quantità di colorante che si lega a residui basici è proporzionale alla quantità di questi residui presenti in soluzione; è raccomandata la preparazione di una curva standard; principali problemi è che il reagente colora le cuvette ed è difficile pulirle non sono solubili in ambiente acido.

STUDIO DELLA STRUTTURA PRIMARIA DELLE PROTEINE

Analisi della Composizione amminoacidica: quali e quanti AA?

1. IDROLISI DELLA PROTEINA CON LIBERAZIONE DEGLI AA CHE LA COSTITUISCONO
2. SEPARAZIONE DEI VARI AA
3. QUANTIFICAZIONE DEGLI AA

A) L'idrolisi può avvenire secondo due modalità:

• fase liquida: _proteina + HCl 6N a 110°C per 24/72 h
• fase gassosa: un proiettore piccol contiene la proteina essiccata viene posto in una più grande munita di tropo da 3 me per fare il vuoto: il HCl e posto nel fondo della proiettore grande, quindi l'idrolisi avviene in vapori di HCl

ERRORI COMMESSI

ANALISI CORRETTA:

Ser → parzialmente distrutto, 10% / 24 h / br

Tyr → parzialmente distrutto, 5% / 24 h

Cys → distrutto

cistina → distrutto

Trp → distrutto

As → distrutto

Gln → distrutto

preparano 3 campioni uguali di proteine e sui idrolisa si 24, 48, e 72 h..i chromatografare

legami peptidici tra AA idrolisano con HCl idrolizzano in acido per ridurre i idrolisano in acido per ridurre i idrolizzando in acido per ridurre i idrolizzando in ambiente acido resistenti alle condizione di HCl almeno di ambiente acido, reunga protetta di As e Glu

legami peptidici tra AA idrofobici (val, leu, I leu...) sono molto resistenti all'idrolisi, pertanto le condizioni di reazione devono luogo 48, e 72 h.

B/(2) utilizzato di apparecchi automaticati che eseguono la separazione chromatografica degli AA e li quantificano.

Gli amminoacidi devono attra derivate con reagenti per essere riconosciliti: le derfinatezione idrolisi può essere effettuota premo o dopo la colonna chromatografica

Acido cisteico:

R: -CH₂-SO₃-

OTt = ditiotreitolo

• CH₂SH
• CHOH
• CH₂SH

N.B.: se si usa protettomato, amino peptidasi ea seguace inizio al 2^o AA

TPCK> tosyl-L-fenilalanina clorometil chetone

N.B.: i metodi di reazione enzimatica sono bloccati per congelamento, per acidificazione di tamponi di reazione, per aggiunto di inibitori delle proteasi

CONDIZIONI DI ELETTROFORESI (SU POLIACRILAMIDE)

- native: le proteine vengono separate in base alla loro carica netta e alle loro dimensioni; è possibile discriminare tra proteine cariche lo steso ma con carica diversa e studiare proteine bimodali; le proteine possono essere rapidamente fissate e recuperate alla fine da soluzione e salti connesse senza denaturante;

- tecnica impiegata nella separazione di proteine del riso le dallo un tracciato elettroforetico caratteristico e si rispetta gela:

Es. ELETTROFORESI IONALE:

- denaturante: s$\diva

Na⁺ - O - S - O - (CH₂)₁₅ - CH₃

- destrutturano la struttura terziaria denaturando la proteina, questo perché conferire una carica netta negativa proporzionale alle mole amino e quindi uguale per tutte e permettere di ricostituendo:

SE SDS - PAGE: elettroforesi su gel di poliacrilamide e in presenza di SDS

Tecnica verticale in cui si utilizzano gel disioncativo composto da: stacking gel (3,5%), running gel (3,5 / 20%)

Preparazione:

- il running gel viene fatto polimerizzare fra due lastre di vetro parallele con uno spessore di 0,2 - 1,5 mm

- sulla superficie del running gel viene deposta una piccola quantità di solvente H₂O / BaOH per ottenere una superficie piatta; dopo la polimerizzazione si colla quello che sarà lo stacking gel

- prima che polimerizzi si ottiene un "cibito" nello stato superiore del gel per ottenere i pozzetti di caricamento del campione

- quando tutto è pronto s'assembla l'apparato per elettroforesi; e si riempiono le sacche a contatto con le dure estremità di gel di un tampone opportuno

- le proteine vengono caricate nel pozzetto componere una banda molto sottile, in modo che siano tutte allineate sulla linea di partenza del running gel