Esperimenti: Appunti di Biochimica Applicata

Metodi indagine cellule nella loro interezza:

• A) Metodi analitici :

  1. Citometro a scansione
  2. Citometro a flusso (o citofluorimetro)

• B) Metodi preparativi :

  1. Centrifugazione
  2. Cromatografia
  3. Agglutinazione
  4. Cell sorter

2. Fluorocromi: n\i rica fie pure di proteine ed esmi effettuando titoli chimico-fisici e mantenendo l’attività biologica delle medele

2) Strumento che permette l' esame delle cellule in sospensione mentre fluiscono difronte a una sorgente di luce popolamento illuminate; purificamente lene, a 4000/6000per secondo. I sistemi a flusso più diffusi sono quelli a fluorescenza per rapidità di analisi eampiezza di azione.

Sorgente laser Ar - 488 nm

Iniezione di cellule marcate (10⁶/ml)in flusso laminare con soluzione tampone

Assorbimento Light scattering: - Diffusione - Rifless.ione

Fluorescenza: Marcatura confluorocromi che rilasciano energiain eccesso cono fotoni

Diffusione: f diametro cellulare (forward scatter)

Rifless.ione, rifrazione: f granularità interna, rapporto nucleo/citoplasma, rugosità di superfice, e diametro cellulare (side scatter)

C I T O G R A M M A: combinazione dei due tipi di segnali

6. le cellule con determinati valori di fluorescenza e scattering possono essere separate da un cell sorter posto a valle del citometro a flusso.

elettriche che applicano una d.d.p. metto altezza che carica le cellule, le qualli vengono raccolte in contenitori dotati termostattati, mentre le molecole neutre sono raccolte da un aspiratore

Ar

METODI INDAGINE CELLULE NELLA LORO INTEGRITÀ:

• A) METODI ANALITICI:
• 1) CITOMETRO A SCANSIONE
• 2) CITOMETRO A FLUSSO CO CITOFLUORIMETRO
• B) METODI PREPARATIVI:
• 3) CENTRIFUGAZIONE,
• 4) CROMATOGRAFIA,
• 5) AGGLUTINAZIONE,
• 6) CELL SORTER

(1) Affioramenti ricchi ... più pure di proteine ed enzimi sfruttando centri chimiciphysici e mantenendo l'attività biologica delle molecole

(2) Strumento che permette il saggio delle cellule in sospensione mediante flusso di fronte a una sorgente di luce propriamente delimitata e purificamente laser, a 4000/6000 per secondo

I sistemi a flusso più diffusi sono quelli di fluorescenza per rapidità di analisi e ampiezza di azione.

SORGENTE LASER

Ar - 488 n m

INIEZIONE DI CELLULE MARCATE (10⁶/ML) IN FLUSSO LAMINARE CON SOLUZIONE TAMPONE

ASSORBIMENTO

LIGHT SCATTERING:

• DIFFUSIONE
• RIFLESSIONE
• FRAZIONE

FLUORESCENZA: marcature con fluorescenza che rilasciano energia in eccesso come fotoni

DIFFUSIONE: ⨍ diametro cellulare (forward scatter)

RIFLESSIONE, RIFRAZIONE: ⨍ granularità interna, rapporto nucleo/citoplasma, rugosità di superficie e diametro cellulare (side scatter)

CITOGRAMMA: combinazione dei due tipi di segnali

(6) Le cellule con determinati valori di fluorescenza e scattering possono essere separate da un cell sorter posto a valle del citometro a flusso.

➕ ➖ 〇

Elettrodi che applicano una d.d.p. mettono altre che carica le cellule, le quali vengono raccolte in contenitori ideali termosettati; mentre le molecole neutre sono raccolte da un aspiratore

Ar

COLTURE DI CELLULE E TESSUTI ANIMALI:

• A) COLTURE PRIMARIE: frammentazione meccanica di tessuti e trattamento con enzimi che idrolizzano proteine e costituenti della matrice. Ridotta capacità proliferativa.
• B) LINEE CELLULARI: popolazioni cellulari omogenee derivate da colture primarie di tumori. Hanno alta capacità replicativa.

STUDIO DELLA PROTEINA:

1. ESTRAZIONE
2. PURIFICAZIONE
3. SAGGI BIOLOGICI E/O QUANTIFICAZIONE

1. PROTEINE EXTRACELLULARI:

Il rimuove il materiale insolubile per centrifugazione o filtrazione

* PROTEINE INTRACELLULARI:

Rottura delle cellule e centrifugazione differenziale

• Ancora in tampone e in ghiaccio, ottimale pH isotonico, a pH fisiologico
• Le temperature si mantengono controllate a 0-4°C per evitare denaturazione
• Nel caso di inibitori delle proteasi, come ci sono anche dei chelanti di cationi meccanici a stabilizzare le membrane
• Nel for uso di stabilizzanti come Mg2, 2 che aiutano a conservare in intatto il nucleo e i ribosomi, DTT e β-mercaptoetanolo che sono riducenti ad evitare l'ossidazione proteica

Metodi di rottura:

• SHOCK OSMOTICO: rompere la cellula variando l'osmolarità con un mezzo ipotonico (ipertoni