Esame di microbiologia

Il processo infettivo

Il contagio è il processo di trasmissione di microrganismi da un individuo malato o sano ad un altro individuo sano. La colonizzazione è il processo di insediamento di una comunità microbica su una superficie cutanea o mucosa. L'infezione è un processo caratterizzato da penetrazione e moltiplicazione di microrganismi unicellulari nei tessuti viventi. La malattia infettiva o da infezione è uno stato patologico sostenuto dall'attività di microrganismi.

Le infezioni nosocomiali e iatrogene

Le infezioni nosocomiali e iatrogene uccidono più degli incidenti stradali. Una volta oltrepassate le barriere chimiche, fisiche e anatomiche dell'ospite si ha la penetrazione batterica.

Adesione e penetrazione

Si ha 1) adesione delle specie microbiche alla superficie delle mucose. Ciò è mediato da adesine batteriche e recettori della mucosa. I pili sono le principali adesine, ma si tratta di molecole presenti sulla membrana esterna con le quali i batteri si appiccicano. Anche l'acido lipoteicoico e altre molecole sono importanti per l'adesione. 2) Penetrazione all'interno della cellula, interazione adesina-recettore → formazione di un vacuolo → vescicola endocitica → poi esocitica: avviene un fenomeno di transocitosi. Poi avviene la digestione della lamina basale ad opera della ialuronidasi.

Alcuni batteri si replicano a livello delle cellule epiteliali che portano a morte prima di diffondersi nel tessuto subepiteliale. Mentre normalmente la prima replicazione avviene a livello subepiteliale. L'organismo avverte l'inizio della replicazione del batterio → Vengono messe in atto le risposte immunitarie aspecifiche, utilizzando sia elementi cellulari che acellulari. Fondamentale è il sistema del complemento. Un batterio virulento si distingue da un non virulento perché presenta i mezzi per superare le barriere dell'immunità innata.

Danni batterici

I batteri possono generare danno in modo diretto o meno. Nel primo caso il batterio penetra all'interno della cellula e riesce a causare un danno funzionale o istopatologico al tessuto in cui è penetrato. Oppure indirettamente, producono le tossine che hanno effetto patologico sul tessuto.

Le tossine batteriche

Le tossine batteriche sono macromolecole prodotte e rilasciate dai batteri o componenti strutturali batterici che possono danneggiare direttamente o indirettamente tessuti e organi. Le tossine non sono prodotti di secrezione, ma delle molecole che sono prodotte e si accumulano all'interno della cellula. Vengono rilasciate quando avviene la lisi.

Antitossina

Si tratta di anticorpi diretti contro le tossine che permettono di neutralizzare la tossina. Le esotossine sono molecole proteiche sintetizzate in forma solubile dai batteri gram+, rilasciate in seguito a lisi cellulare, con elevata tossicità e altamente immunogene e stimolano la formazione di antitossina neutralizzante. Esotossine citolitiche come la streptolisina O, che agisce a livello della membrana e induce necrosi; neurotossina come quella botulinica; pirogeniche come quelle stafilococciche.

Le endotossine

Le endotossine sono parte integrante della parete dei gram- rilasciata in seguito a lisi cellulare; resistente al calore; pirogene e debolmente immunogene. Lo shock settico è dovuto sia all’endotossina sia alla risposta immune dell’ospite, sepsi con ipoperfusione tissutale cioè ipotensione + disfunzione cellulare fluido-resistente associato aumento di mortalità.

Sepsi

La sepsi è un'infezione con reazione sregolata dell’ospite e conseguente disfunzione d’organo minacciosa e associato aumento di mortalità. Segni precoci di sepsi comprendono alterazioni termiche, ipotermia nei pazienti anziani, tachipnea, tachicardia, la cute è calda e iperemica a causa della vasodilatazione periferica. La sede d’infezione più frequente è l’apparato urinario, seguito da quello respiratorio e gastroenterico, cute e tessuti molli dopo ferite.

Biofilm microbici associati alle infezioni

Il biofilm si forma prima dell’infezione stessa, quindi prima della penetrazione.

Ecosistema orale

La cavità orale NON è un ambiente uniforme ma è un insieme di habitat: labbra, denti, gengiva, lingua, palato, guance.

• Grande diversità anatomica della cavità orale, che origina habitat diversi, con fattori fisico-chimici diversi e nicchie idonee a popolazioni microbiche diverse.
• Grande plasticità nel tempo: gli ambienti variano con il tempo, sia a breve (nel corso della giornata) che a lungo termine (nel corso della vita).

Alla nascita la cavità orale è sterile, ma già nei primi giorni inizia la colonizzazione di batteri che provengono dall’ambiente esterno: le prime a colonizzare sono le specie chiamate "pioniere", che sono quei batteri con maggiore capacità di crescere. I primi a colonizzare sono gli streptococchi salivarius e mitis: i ceppi di streptococchi presenti nel cavo orale del bambino subito dopo la nascita sono molto simili a quelli della madre, ma con l’eruzione dei denti inizia la colonizzazione massiva da parte di gram+ e-, e in una fase successiva si creano le condizioni favorevoli alla colonizzazione degli anaerobi che si localizzano nelle regioni con basso apporto di O₂, come per esempio il collettogengivale.

I meccanismi di difesa del cavo orale sono la saliva, che svolge attività meccanica e contiene proteine ad attività antibatterica, come il lisozima, che provoca la lisi della colonia batterica, e la lattoferrina, che lega il Fe sottraendolo all’ambiente esterno, rallentando e inibendo la crescita batterica.

Un altro meccanismo di difesa è rappresentato dal sistema immunitario, mediante le immunoglobuline.

Acquisizione della popolazione microbica normale

La cavità orale è sterile alla nascita. In 6-10 ore inizia la colonizzazione, con la popolazione batterica in equilibrio "plastico", con cambiamenti nelle ore, giorni, mesi, anni.

Bocca edentula (solo mucosa): i primi batteri colonizzatori sono definiti pionieri: batteri aerobi-anaerobi facoltativi, primi fra tutti gli Streptococchi, con S. salivarius. I batteri anaerobi sono scarsi: veillonelle (cocchi Gram-, dal 2^° giorno di vita), i fusobatteri (dal 3-4^° mese), i peptostreptococchi (dopo il 5^° mese). Aumento netto degli anaerobi (facce approssimali, solchi dentali e soprattutto solco gengivale).

Nuove superfici dure (non sfaldanti) colonizzabili: dentizione. Si ha la colonizzazione: i batteri devono aderire alla superficie, l’adesione è un’interazione tra macromolecole della superficie batterica dette adesine e strutture complementari delle cellule eucariotiche, cioè i recettori. I meccanismi mediante i quali i batteri aderiscono alle cellule sono molteplici: si ha la produzione di polisaccaridi extracellulari come lo Streptococcus mutans e sanguis, che sono sostanze appiccicose che fanno aderire il batterio alla superficie del dente.

Per l’aderenza dei gram+ abbiamo molecole poste sulle superfici batteriche quali l'acido lipoteicoico che funge da ponte macromolecolare tra microrganismo e cellula bersaglio; per i gram- l’interazione con le cellule bersaglio avviene grazie alla presenza di fimbrie e di polimeri extracellulari prodotti dai gram+ che formano un reticolo a maglie larghe che offre un sito d’attacco ai gram-. Dopo l’adesione si verifica la colonizzazione ed in conseguenza di ciò si forma la placca dentaria.

Tra le specie che colonizzano il cavo orale la più diffusa è quella dello Streptococcus mutans, ritenuto uno dei maggiori responsabili della carie nell’uomo e negli animali. La carie è una demineralizzazione prodotta da acidi e soprattutto dall’acido lattico che deriva dalla fermentazione degli zuccheri ad opera di batteri presenti nella placca batterica: gli streptococchi infatti sono detti anche batteri lattici proprio per la fermentazione degli zuccheri introdotti con la dieta.

L’acido porta ad un abbassamento del pH che porta a demineralizzazione. Il fattore microbico della carie dentale è rappresentato dai microrganismi presenti nel cavo orale, capaci di costituire la placca aderente al dente. I microrganismi appartengono principalmente agli streptococchi (Streptococcus mutans, sanguis, lactis), ai lattobacilli (Lactobacillus acidophilus, casei), agli actinomiceti e alle veillonelle. La loro azione cariogena si fonda sull’elevata capacità di sintesi di acido lattico e di polisaccaridi adesivi.

Lo Streptococcus mutans fu isolato negli anni ’20 da Clark, il quale lo osservò nel campione prelevato dalla lesione batterica, ed è detto mutans per la sua forma circolare ma un po' allungata. Gli Streptococchi mutans posseggono un elevato potenziale cariogeno perché producono zuccheri dal saccarosio: la glicosil-transferasi è un enzima del mutans e trasforma il saccarosio in un polimero detto destrano, staccando fruttosio e legando glucosio e questo fa sì che i batteri aderiscano alla superficie del dente in un dato punto e, a questo livello, in seguito ai processi fermentativi, cioè la produzione di acido lattico e l’abbassamento del pH, si ha la lesione cariosa. Lo Streptococcus mutans mantiene attivo il suo metabolismo anche a valori di pH bassi, condizione che inibirebbe gli altri batteri, ed è anche per questo che il potenziale cariogeno è elevato; oltretutto possiede elevata capacità adesiva e resistenza agli antibiotici.

La demineralizzazione di smalto e dentina si ha intorno a pH 5, che è detto "valore critico": al di sotto di tale valore il processo di demineralizzazione è veloce e non più controllabile. Il Lactobacillus acidophilus utilizza come substrato il glucosio e sintetizza acido lattico che con la sua acidità scioglie un po’ per volta lo smalto dentale, intaccando la dentina. Gli actinomiceti e le veillonelle utilizzano l’acido lattico come fonte di energia e possono quindi interferire con i processi cariogeni.

Va ricordato che i microrganismi possono svolgere la loro azione solo quando il tempo di contatto con i residui alimentari è lungo, ossia quando si trovano bloccati a livello della placca batterica, e contemporaneamente, i residui alimentari non sono sollecitamente rimossi.

Ecosistema orale

La cavità orale NON è un ambiente uniforme ma è un insieme di habitat: labbra, denti, gengiva, lingua, palato, guance.

• Grande diversità anatomica della cavità orale, che origina habitat diversi, con fattori fisico-chimici diversi e nicchie idonee a popolazioni microbiche diverse.
• Grande plasticità nel tempo: gli ambienti variano con il tempo, sia a breve (nel corso della giornata) che a lungo termine (nel corso della vita).

Diversità anatomica

• Tessuti duri (denti), che non sfaldano e permettono colonizzazione e possono essere descritti come una superficie dura non soggetta a sfaldamento, che può essere colonizzata sopra o sotto il margine gengivale.
• I tessuti molli della mucosa sono invece caratterizzati da una continua desquamazione delle cellule epiteliali di superficie, che permette una rapida eliminazione dei batteri aderenti.
• Area crevicolare, con caratteristiche peculiari. Ambiente umido: le superfici orali sono costantemente bagnate da due fluidi, essenziali per il mantenimento dell'ecosistema orale, in quanto forniscono acqua, nutrienti, fattori di aderenza e fattori antimicrobici.

Saliva

Fluido complesso che entra nella cavità orale attraverso i dotti delle 3 paia di ghiandole salivari maggiori (parotidi, sottomandibolari e sottolinguali) e delle ghiandole salivari minori. La saliva "lava" le superfici orali e asporta i detriti, cellule sfaldate e microrganismi, ha un pH ~ 6.75 e contiene per il 99% acqua, glicoproteine, proteine, ormoni, vitamine, urea, e ioni. Condiziona il tipo e la crescita delle comunità microbiche.

Fattori antibatterici

• Lisozima: attività disgregante sul peptidoglicano (rottura legame glucosidico β1-4 tra NAM e NAG).
• Sistema lattoperossidasico: acido tiocianico e perossido di idrogeno (da metabolismo batterico) in presenza di lattoperossidasi danno acqua e ipotiocianato, che ha azione antibatterica.
• Lattoferrina: proteina che lega il ferro sottraendolo ai batteri.
• Immunoglobuline: prevalentemente IgA, prodotte da plasmacellule delle ghiandole salivari.

IMPORTANTE: la saliva fornisce la "pellicola acquisita", materiale non strutturato, acellulare e abatterico di origine salivare. Spessore 0.1-3 µm. Ricopre il dente non appena si ha la sua eruzione. Se viene rimossa si riforma nel giro di pochi secondi. Rappresenta la superficie su cui avviene l'adesione dei batteri.

Composizione: principalmente glicoproteine salivari di vario tipo (incluse glicoproteine antigeniche dei gruppi sanguigni, fattori aggreganti specifici, anticorpi).

Caratteristiche fisico-chimiche: resistente agli enzimi proteolitici, stabile alla temperatura, relativamente insolubile. Rappresenta una barriera alla diffusione degli acidi nello smalto.

Fluido crevicolare

Definizione: essudato di origine plasmatica che attraverso l'epitelio giunzionale della gengiva raggiunge il solco gengivale. La sua presenza è legata all'eruzione dei denti. Il flusso aumenta in condizioni infiammatorie.

Composizione: simile a quella del siero. Contiene proteine, albumina, leucociti, Ig, complemento. Condiziona le popolazioni microbiche, sia in positivo che in negativo. Nutrimento (albumina, emina, α₂globulina). Difesa aspecifica e specifica: IgG, IgM, IgA, complemento, leucociti PMN, Mø, linfociti T e B.

Fattori che influenzano l'ecosistema orale

La crescita dei microrganismi orali è influenzata da numerosi fattori, ognuno dei quali induce la selezione di determinati microrganismi e mantiene l'equilibrio tra le diverse popolazioni.

• Fattori fisico-chimici come temperatura, pH, anaerobiosi e nutrienti.
• Fattori dell'ospite come la difesa dell'ospite, l'età, le variazioni ormonali, lo stress e i fattori genetici.
• Fattori batterici come l'aderenza e le interazioni batteriche.
• Fattori esterni come la dieta, l'igiene orale, gli agenti antimicrobici, i farmaci, il fumo.

La temperatura interna della cavità orale è relativamente costante a 34-36° e può variare maggiormente in corrispondenza delle parti sopragengivali dei denti e durante l'ingestione di cibo. Il pH è tra 5-8 e si mantiene neutro tra 6,5 e 7,5 grazie al potere tampone della saliva attuato mediante il fatto che elimina i carboidrati che potrebbero essere metabolizzati dai batteri e gli acidi da essi prodotti e tampona l'acidità presente grazie soprattutto al bicarbonato, ma anche peptidi, proteine e fosfati.

Tra i componenti esogeni hanno grande influenza sulla composizione microbica i carboidrati e le proteine. Tra i componenti endogeni:

• La saliva contiene nutrienti sufficienti a sostenere la crescita di molti microrganismi anche in assenza di apporti esogeni.
• Il liquido crevicolare è ricco di nutrienti (plasma), inoltre contiene alcuni composti necessari ad alcuni ceppi colonizzatori di questa area (Es: emina e vitamina K, necessari a Porphiromonas gingivalis).
• Prodotti del metabolismo batterico: ad esempio le Veillonelle, non essendo in grado di fermentare i carboidrati, utilizzano gli acidi organici prodotti da altri batteri come fonte di energia.

Adesività

Primo step indispensabile per diventare un microbiota commensale, o se patogeno per essere nelle condizioni di poter danneggiare l’ospite.

• Ritenzione: i batteri si insinuano nelle zone protette (solco gengivale, facce approssimali dei denti, difetti dello smalto).
• Adesione: si attaccano alle superfici orali.
• Coaggregazione: aderiscono ad altri batteri a loro volta attaccati alle superfici orali.

È possibile valutare in vitro le capacità adesive dei diversi microrganismi. In vivo esiste una preferenza di determinati batteri per superfici specifiche: Salivarius dorso lingua, S. mutans superfici dentali, S. sanguis superfici dentali, S. mitis denti e mucosa guance.

Adesione batterica e fattori di adesività

• Polimeri extracellulari come il saccarosio che è il composto maggiormente implicato nei fenomeni di adesività della placca.
• Glucosiltransferasi (GTF): catalizza la formazione di glucani, ma agisce anche come fattore di adesione; lega lo smalto, la superficie del batterio e il glucano.
• Acido lipoteicoico: componente della membrana dei Gram+. Presente spesso in fibrille superficiali (es. Streptococchi), complessato a proteine che ne protrudono la porzione glicolipidica, si attacca alle cellule epiteliali mediante la fibronectina. Inoltre è in grado di interagire con le glicoproteine salivari della pellicola acquisita.
• Pili/Fimbrie: appendici presenti sia nei Gram- che nei Gram+.