Microbiologia con domande esame

Microbiologia

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Microbiologia

Esame: 15 domande a risposta multipla su tutti gli argomenti del

programma, ciascuna domanda vale 1 punto (totale 15 punti). 5 domande

aperte ma molto specifiche (5-6 righe) ognuna delle quali vale 3 punti.

Studiare su: appunti, diapositive, “Principi di microbiologia medica” edizione

ambrosiana 3° edizione.

La microbiologia è la scienza che studia i più piccoli organismi viventi (dal

greco micros e bios).

È una scienza relativamente giovane che studia i microbi, che sono

importanti per la patologia umana (possono, infatti, causare delle malattie

nell’uomo). È giovane se comparata ad altre scienze come la matematica o

la fisica perchè tratta dei microbi, la maggior parte dei quali non sono visibili

ad occhio nudo, e finché non si sono sviluppate delle tecnologie che

permettessero di vedere i microbi stessi non se ne conosceva l’esistenza.

Il sospetto che esistessero organismi così piccoli, però, c’era già da molto

tempo, nonostante la limitazione tecnologica (non si poteva mettere in

evidenza l’esistenza dei virus perchè non c’erano gli strumenti adatti).

L’uomo ha imparato fin dai tempi più antichi a tenere comportamenti che

tenessero conto dell’esistenza di questi microrganismi, anche non potendola

dimostrare (es. tecniche antichissime per conservare i cibi che altrimenti

andavano a male a causa della crescita in essi di microrganismi,

l’essiccamento e quindi la perdita di acqua per impedire la crescita di batteri,

la fermentazione, che è un processo sostenuto da microbi, utilizzata fin dai

tempi più antichi per produrre pane o vino, ma anche la trasmissione delle

malattie: si pensava ovviamente che un soggetto malato trasmettesse la

malattia a chi lo curava, contagiandolo. Si pensava che un’entità invisibile

passasse da un soggetto all’altro).

È per questo che la microbiologia viene considerata una scienza applicativa.

La prima vera dimostrazione dell’esistenza dei microbi risale al 1676 ad

Antoine Van Leeuwenhoek,

opera di mercante di stoffe olandese con una

passione smisurata nella forgiatura delle lenti. Egli fabbricò delle lenti con un

potere di risoluzione molto elevato per quei tempi, che riuscivano ad

ingrandire 300 volte ciò che si osservava. Costruì, con queste lenti, un

rudimentale microscopio che consisteva in una placchetta metallica con una

punta in cui veniva incastrato il materiale da osservare, c’era poi una lente

incastonata nella placchetta che permetteva di ingrandire l’oggetto per

poterlo osservare meglio.

La prima cosa che egli pensò di osservare era la placca gialla (noi sappiamo

oggi che essa è fatta di batteri) che aveva sui denti e vide dei microrganismi

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che disegnò a mano: dei batteri tondi, dei batteri allungati e dei batteri fatti a

spirale. Aveva visto per la prima volta dei microrganismi.

Rese note le sue scoperte inviando una lettera alla Royal Society di Londra,

ma le sue osservazioni rimasero a lungo isolate perchè nessuno era in grado

di fabbricare lenti buone come le sue e, geloso delle lenti da lui prodotte, non

accettava di cederle ad altri.

La scoperta dei microrganismi rafforzò l’idea che questi fossero responsabili

delle malattie, molte di queste, infatti, sembravano contagiose anche se

l’entità che ne provocava la diffusione era ancora sconosciuta.

Quasi 200 anni dopo le scoperte dell’olandese i microrganismi vennero

scoperti come agenti di malattie, nel 1800, e fu una delle maggiori conquiste

della microbiologia come scienza.

Robert Koch scoprì che i microrganismi sono agenti responsabili delle

malattie, nel 1878 dimostrò l’eziologia microbica del carbonchio (malattia

Bacillus Antracis;

che colpiva gli animali e causata da un batterio detto

questa fu la prima correlazione tra agente e malattia), nel 1882 isolò l’agente

Bacillo di Koch),

eziologico della tubercolosi (detto infatti nel 1888 isolò il

batterio del colera. Per le sue ricerche e scoperte Koch venne insignito del

premio nobel per la Medicina nel 1905: fu tra i primi a trovare la correlazione

tra un agente infettivo e la malattia.

Ebbe inizio, così, l’era d’oro della microbiologia e in circa 25 anni vennero

scoperti e descritti la maggior parte dei più importanti agenti batterici di

malattie dell’uomo e furono messi a punto metodi di prevenzione per molte

malattie infettive. L’operazione di accoppiamento di un agente microbico ad

una data malattia è attiva tutt’oggi, non è finita con i tempi antichi, e dal 1973

al 1999 sono state molte le scoperte fatte. Ad esempio negli anni 80 è stato

identificato il virus dell’immunodeficienza acquisita, negli anni 90 il virus

dell’epatite, nel 2003 la SARS, nel 2009 la suina (virus H1N1) che arrivò al

livello di pandemia, nel 2014 epidemia di ebola in Africa e nel 2019 il virus

SARS-CoV-2.

Che cos’è un Coronavirus?

“CO” sta per “corona”, “VI” sta per “virus” e “DI” sta per “disease”, il 19 fa

riferimento all’anno 2019. Come altre malattie respiratorie l’infezione da

nuovo Coronavirus può causare sintomi lievi influenzali ma anche più gravi

malattie respiratorie. Si trasmette per mezzo delle goccioline emesse che

vanno a contaminare le superfici e l’aria. Il lavaggio e la disinfezione delle

mani sono la chiave per prevenire la disinfezione, lavandole per almeno 60

secondi 3

La varietà del mondo microbico

I microrganismi sono un gruppo molto eterogeneo di organismi viventi

comprendenti alcuni metazoi, protozoi, numerose alghe, funghi, batteri e

virus. Di solito sono unicellulari (addirittura alcuni, come i virus, sono

strutture super-cellulari, cioè meno di una cellula), ma a volte possono

formare aggregati pluricellulari in cui tutte le cellule sono equivalenti (non c’è

una differenziazione in tessuti e organi), solo occasionalmente possono

presentare cellule o gruppi di cellule morfologicamente e funzionalmente

differenziate.

In una scala che va da 10 metri (100 miliardesimi di metro) a 1 metro sono

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presenti tutti gli organismi, osservabili per mezzo del microscopio elettronico

e del microscopio ottico.

Si parte dai virus, osservabili al microscopio elettronico per passare a batteri

e protozoi, osservabili per mezzo del microscopio ottico e poi ai più grandi

vermi, visibili anche ad occhio nudo.

DOMANDA: Con cosa posso osservare un virus? Microscopio elettronico. (le

grandezze di un virus sono dell’ordine di 10 alla -8 metri)

In questa grande varietà di microrganismi viventi è necessaria una

classificazione e i criteri per svolgerla sono molti.

in base alla complessità strutturale:

Uno dei criteri più semplici è quanto

complessi sono questi organismi. Dividiamo in 3 grandi gruppi:

Procarioti: tra i procarioti troviamo tutti i batteri, che sono capaci di vita

• autonoma. Tra i batteri ce ne sono anche alcuni che non sono capaci di vita

autonoma e sono quindi dei parassiti endocellulari obbligati, cioè per vivere

devono obbligatoriamente entrare nelle cellule dell’ospite. Tutti i batteri

sono procarioti.

Eucarioti: sono i miceti (o funghi), che possono essere unicellulari o

• pluricellulari, presentano una spessa parete, e anche i protozoi, unicellulari

e privi di parete.

Struttura acellulare: virus, ovvero parassiti endocellulari obbligati, che

• devono utilizzare, per sopravvivere e replicarsi, una cellula ospite. Fuori

dalla cellula possono diffondersi ma non sono capaci di replicarsi.

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Confronto tra procarioti ed eucarioti

1. Gli eucarioti sono più grandi (>5 micron) rispetto ai procarioti (da 0.5 a 3

micron).

2. Negli eucarioti il nucleo è circondato da una membrana nucelare che

racchiude il materiale genetico all’interno, mentre nei procarioti il materiale

genetico è libero nel citoplasma.

3. La riproduzione è sessuata o asessuata per gli eucarioti, mentre è solo

asessuata per i procarioti ed avviene per scissione binaria.

4. Negli eucarioti abbiamo una compartimentalizzazione cellulare dove vari

organelli svolgono varie funzioni (es. i mitocondri svolgono la respirazione

cellulare, l’apparato del Golgi modifica le proteine dopo la traduzione).

5. Negli eucarioti abbiamo flagelli complessi mentre nei procarioti solo

flagelli semplici.

6. Negli eucarioti c’è una limitata attività metabolica, mentre nei procarioti ci

sono numerose attività metaboliche con diverse fonti energetiche

(l’energia può essere prodotta in molti modi diversi come ad esempio

attraverso la respirazione aerobia, anaerobia, la fermentazione, ecc.). I

procarioti sono molto più versatili degli eucarioti.

per quanto riguarda i batteri è in base a

Un altro metodo di classificazione

criteri morfologici (forma, dimensioni, disposizione, caratteri tintoriali, ecc.).

- Forma: COCCHI e i BASTONCELLI

ci sono 2 forme principali: i (immagini

con il microscopio elettronico a scansione che dà immagini

tridimensionali). I cocchi sono sferici, i bastoncelli sono dei piccoli

bastoncini allungati. Queste forme possono presentare, però, numerose

variazioni come ad esempio dei cocchi con una forma a rene (neisserie); gli

pneumococchi sono cocchi con una parte più appuntita, si dispongono a

coppia e si dice che abbiano una forma a punta di lancia o a fiamma di

candela; alcuni sono incurvati a virgola come i vibrioni del colera. I

bastoncelli possono essere diritti e regolari (bacilli), possono essere molto

lunghi e filamentosi o fatti a spirale (spirilli o spirochete). È importante

sapere la forma dei batteri perchè in base ad essa si possono riconoscere

gli specifici batteri, collegandoli direttamente alle patologie che producono

nelle procedure diagnostiche. 5

- Disposizione: la disposizione di una cellula rispetto alle altre ha molto

rilievo a livello dei batteri, essa è il risultato di una non completa divisione

cellulare. Raramente si trova un batterio singolo, spesso batteri si possono

associare a due a due (diplococchi), possono formare delle lunghe

catenelle (streptococchi), si possono disporre in ammassi irregolari come

dei grappoli d’uva (staphylococchi, dal greco staphylo=grappolo), si

possono associare in tetradi 4x4 o sarcina 8x8.

La disposizione è fissa nell’ambito di un determinato tipo di batteri, perciò è

importante a livello di riconoscimento ed identificazione (è un criteri o

tassonomico).

Negli streptococchi la catenella si forma in modo particolare. La cellula si

divide in 2, si ha una ulteriore divisione delle 2 cellule e se ne ottengono 4 e

in seguito alle divisioni si forma una lunga catenella perchè esse avvengono

su piani paralleli. Le cellule figlie rimangono unite e a loro volta si dividono

secondo piani tra loro paralleli e perpendicolari al piano di allungamento di

catena di cellule.

La divisione su piani irregolari nello spazio, secondo assi casuali irregolari,

origina ammassi irregolari di cellule. Ogni cellula ha il suo asse di divisione

ed il risultato è una disposizione irregolare.

Anche i bacilli possono avere una disposizione regolare, con l’asse maggiore

delle cellule parallelo o una disposizione irregolare e caotica dove ogni

cellula ha il suo orientamento indipendentemente dalle altre.

- Caratteri tintoriali: colorazione di Gram. I batteri sono così piccoli che la

maggior parte delle volte per essere osservati necessitano del microscopio

e devono essere colorati per poter essere visti nel modo migliore. I batteri

GRAM POSITIVI GRAM NEGATIVI.

si dividono in e La distinzione è fatta

in base alla colorazione dei batteri messa a punto da Gram tra il 1800 e il

1900. I batteri Gram positivi o negativi sono diversi tra loro per la struttura,

per la modalità con cui causano la malattia e molto altro. La microbiologia

è fatta di batteri Gram positivi e Gram negativi, che rappresentano 2 mondi

paralleli. Prima di tutto, per poter distinguere un batterio Gram + da uno

preparare la coltura

Gram -, bisogna da osservare: si usa un vetrino e

tramite un’ansa di metallo (strumento del microbiologo) si distribuisce una

coltura di batterio sul vetrino, questa secca all’aria e per fissarla la si passa

sulla fiamma viva 3 o 4 volte (fissaggio al calore: i batteri grazie al calore si

attaccano alla superficie del vetrino in modo tale da poterli colorare). Poi

colorazione vera e propria,

inizia la che consiste in 4 passaggi diversi:

Colorazione primaria

1. (DOMANDA APERTA: Descrivi la colorazione di

Gram, perchè e i principi): preparare uno striscio del batterio e trattare con

il primo colorante, il cristal violetto. Il cristal violetto, come molti coloranti

usati in microbiologia è un colorante basico, affine alla superficie dei

batteri che è invece carica negativamente. Il colorante penetra sulla

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superficie dei batteri e li colora TUTTI (sia Gram positivi che negativi) di

violetto.

Fissaggio del colore (Mordente):

2. il colorante deve essere fissato ai

batteri, perchè finora ha solo aderito alla superficie. Il vetrino viene

coperto con una soluzione di ioduro di potassio e iodio (liquido di Lugol)

che si complessa con il cristal violetto e con il materiale cellulare

permettendo la formazione di una molecola più grande (il cristal violetto

aumenta le dimensioni delle molecole e rimane attaccato alle superfici dei

batteri poichè intrappolato in esse).

Decolorazione:

3. Gram notò che nella colorazione dei batteri la

decolorazione è fondamentale e cruciale, perchè si iniziano a differenziare

e diversificare i batteri Gram + dai Gram - in base al loro comportamento.

Vengono aggiunte allo striscio gocce di etanolo e lasciate agire per circa

15 secondi: i Gram + rimangono colorati con il cristal violetto (viola), e

l’etanolo non li cambia, mentre nei Gram - il colorante viene lavato via

dall’etanolo. È una tappa cruciale della colorazione di Gram.

Colorazione di contrasto:

4. uso un colorante di colore diverso rispetto al

primo utilizzato, la safranina (di colore rosso). I Gram + rimangono di

colore violetto, mentre i Gram - si colorano di rosso poichè erano rimasti

privi di colore, assorbendo la safranina. A questo punto il preparato è

pronto per essere osservato al microscopio (microscopio ottico con un

ingrandimento di 100 volte). Per meglio osservare i batteri si mette sul

preparato una goccia d’olio per rendere i batteri meglio rilflettenti alla luce.

Al microscopio posso valutare non solo le proprietà tintoriali, ma anche la

forma dei batteri (Gram + cocchi, Gram - bastoncelli) e la disposizione (Gram

+ disposti in ammassi irregolari, stafilococchi, Gram - uno dei più frequenti

Escherichia coli).

abitanti del nostro intestino, come ad esempio

L’osservazione dei batteri

Tramite un’osservazione macroscopica è possibile osservare le colonie

batteriche, cioè il prodotto della divisione di una singola cellula batterica. La

colonia diventa talmente grande in seguito alle divisioni che la posso

osservare anche ad occhio nudo sulla superficie di terreni di coltura solidi,

cioè mezzi artificiali che contengono vari nutrienti in grado di sostenere la

crescita dei batteri.

Così come la forma, la disposizione e le proprietà tintoriali, anche la

morfologia della colonia è importante per la distinzione dei diversi tipi di

batteri. Le colonie possono avere tante forme e tanti colori (di una colonia si

valuta la forma: rotonda, irregolare, filamentosa; il margine: intero, ondulato,

lobato; il profilo, la superficie: liscia o ruvida, morfologia della colonia, ecc.).

queste proprietà sono costanti per un certo gruppo di batteri e sono delle

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vere e proprie caratteristiche tassonomiche. DOMANDA: Come posso

osservare la morfologia di una colonia batterica? Ad occhio nudo.

Classificazione dei batteri in base a criteri metabolici e biochimici

Questo tipo di classificazione permette di identificare una specie batterica o

varianti all’interno di essa (BIOTIPI) tramite l’analisi del profilo biochimico.

Questo criterio di classificazione è oggettivo e permette di compiete ulteriori

distinzioni tra batteri della stessa specie.

Alcuni esempi:

Necessità o meno dell’ossigeno per la crescita

• Utilizzazione di alcuni zuccheri come unica fonte di carbonio

• Produzione di substrati

• Utilizzazione del citrato

• Produzione di certi enzimi

• Decarbossilazione di alcuni amminoacidi

•

Queste proprietà (stabili e codificate a livello genetico) si possono valutare

usando kit commerciali che permettono di eseguire contemporaneamente 20

o più di questi test sullo stesso isolato chimico con una piccola quantità di

sospensione batterica. Dopo incubazione a 37°C della goccia di

sospensione batterica i risultati sono confrontati con un database utilizzando

un programma computerizzato. Si crea una mascherina dicotomica dove la

combinazione dei - e dei + è caratteristica di una certa specie (il pattern di

positività e negatività viene riconosciuto dal computer ed identifica la

specie).

Con queste semplici chiavi tassonomiche si può arrivare all’identificazione di

coli.

una specie. Un esempio è un batterio gram negativo, l’Escherichia Dalla

colorazione di una coltura di batteri ottengo il risultato gram negativo,

scopro che è un bacillo aerobio che fermenta il lattosio con produzione di

acido e/o gas. Tramite test biochimici riconosco come Escherichia coli il

batterio analizzato.

La stessa procedura può essere seguita per identificare un batterio gram

Staphylococcus aureus

positivo come