Microbiologia con domande esame

Struttura dei lipidi A e del core polisaccaridico

PARTE LIPIDICA: Il lipide A è un glicofosfolipide composto da una parte glucidica, una parte fosforica (due gruppi fosforici) e una parte lipidica costituita da acidi grassi a catena lunga. Il lipide A è quindi composto da due glucosammine fosforilate con legati acidi grassi a catena lunga. Questa porzione idrofobica si ancorata alla membrana esterna ed è anche la parte tossica della molecola per l'ospite. Il lipide A è altamente conservato in tutti i batteri Gram -.

PARTE POLISACCARIDICA: Il core (cuore della molecola) è un oligosaccaride costante all'interno di un genere batterico. Ad esempio, tutti gli Escherichia coli hanno lo stesso core, così come tutte le Salmonelle. L'inner core (parte più interna) di tutti i batteri Gram - contiene uno zucchero ad 8 atomi di carbonio chiamato 2-keto-3-deoxyoctulosio.

• Rappresenta la parte più esterna della molecola, è un polimero di unità oligosaccaridiche di ripetizione (in media 40 unità, come fossero gli anelli di una catena).
• Ciascuna unità (ripetuta nella catena) è fatta o da 3 o 4 o 5 zuccheri a seconda dei batteri, alcuni sono comuni, altri sono presenti in natura solo nella parete dei batteri.
• Ci possono essere almeno 20 tipi diversi di zuccheri, molti dei quali sono dei dideosseosi che si ritrovano, in natura, solo nella parete dei batteri Gram -.
• La catena laterale O rappresenta la parte più variabile alla base della classificazione sierologica dei Gram -.

La membrana esterna è una barriera selettiva (ancor più selettiva della membrana interna) che si oppone al passaggio di molecole idrofobiche (dovuto alla catena laterale O, idrofilica, del LPS, composta da zuccheri) e di molecole idrofiliche (dovuto al doppio strato fosfolipidico e idrofobo) al di sopra di certe dimensioni. La permeabilità è assicurata dalle porine, proteine fatte come tubi che permettono il passaggio dei nutrienti.

L'LPS (ovvero la parte più esterna), invece, rappresenta un'importante struttura di superficie nell'interazione dell'agente patogeno con il suo ospite: per esempio può essere coinvolto nell'adesione (colonizzazione), grazie alle catene laterali il batterio può aggrapparsi alle mucose dell'ospite e nella resistenza alla fagocitosi; è sede dei determinanti antigenici; se liberato in un ospite sensibile, dà luogo a numerosi effetti tossici.

(endotossina batterica). Il lipide A della molecola, infatti, è tossico per l'ospite e se liberato in un ospite sensibile dà luogo a numerosi effetti tossici. La produzione di tossine (cioè di veleni molecolari verso le cellule ed i tessuti dell'ospite) è uno tra i più importanti meccanismi di patogenicità batterica (metodi con cui i batteri provocano malattie). Si distinguono:

ENDOTOSSINE (lipopolisaccaridi): componenti strutturali della membrana esterna dei batteri (finché la cellula è viva l'endotossina rimane attaccata alla membrana, ma quando la cellula va incontro a morte o a lisi provocata dall'azione degli antibiotici la membrana si disintegra e l'endotossina si stacca venendo rilasciata nello spazio esterno).

ESOTOSSINE (proteine): vengono prodotte all'interno della cellula e poi rilasciate all'esterno per mezzo di un vero e proprio processo attivo di secrezione.

Tra queste due

classi di molecole ci sono, però, molte altre differenze: Le endotossine sono lipopolisaccaridi, mentre le esotossine sono proteine. I lipopolisaccaridi sono termostabili (stabili al calore) mentre le esotossine, essendo proteine, sono tutte termolabili (possono essere denaturate, cioè disattivate, dal calore). La modalità di azione delle endotossine è non specifica, hanno diversi bersagli cellulari ed inducono febbre, infiammazione e nessuna attività enzimatica, mentre le esotossine hanno meccanismi di azione molto differenziati e azioni specifiche in base ai tipi cellulari. Le endotossine sono relativamente poco potenti, mentre invece le esotossine sono altamente tossiche, spesso fatali. Le endotossine inducono una risposta immunitaria che però non è sufficiente a neutralizzare la tossina, mentre le esotossine sono altamente immunogeniche e stimolano la produzione di anticorpi neutralizzanti. Ne deriva la potenzialità di essere usate come

vaccini: le endotossine non hanno alcuna potenzialità in tal senso, mentre le esotossine hanno un'ottima possibilità di essere usate come vaccini. Il trattamento della tossina con formaldeide al calore elimina la tossicità (detossificazione per renderla non tossica) ma permette il mantenimento delle caratteristiche antigeniche che inducono anticorpi. Le tossine detossificate sono dette TOSSOIDI.

DOMANDA: Cos'è un Tossoide? Un tossoide è un'esotossina batterica detossificata tramite trattamento con formaldeide al calore che ne elimina la tossicità, ma non l'immunogenicità, cioè ne mantiene le caratteristiche di antigene. Questo tossoide, se inoculato in un organismo, induce la formazione di anticorpi che lo proteggeranno dall'effetto di quella tossina se incontrata nel corso della vita.

Effetti biologici dell'endotossina: se inoculata in un animale sensibile, dà luogo ad una vasta gamma di sintomi, perché agisce su tantissimi

organi e sistemi, ma l'effetto che provoca l'endotossina su un ospite sensibile dipende molto dalle dosi. A piccole dosi l'effetto è quasi benefico e si dice che la molecola sia un immuno-stimolante. In piccole quantità stimola positivamente i sistemi cellulari, in particolare il sistema immunitario. I problemi insorgono quando veniamo a contatto con alte dosi di endotossina, che causano degli effetti gravi, talvolta perfino mortali. Effetti dovuti al fatto che l'endotossina stimola la coagulazione del sangue (coagulazione intravasale in tutto il corpo), che può portare a insufficienza d'organo multipla e shock emodinamico.

L'endotossina è una molecola dai molteplici effetti biologici:

• Induce febbre: ha un effetto pirogeno, agisce sui macrofagi e li stimola a produrre delle citochine solubili che sono molecole che scatenano febbre poiché agiscono sul centro regolatore dell'ipotalamo.
• Attiva numerosi tipi

cellulari: macrofagi, linfociti B, cellule endoteliali, piastrine. Se li attiva stimolano la proliferazione cellulare, la fagocitosi, la produzione di citochine solubili.

Induce un'infiammazione generalizzata in tutto l'organismo con conseguente ipotensione e shock: l'infiammazione porta ad una vasodilatazione e questo causa un brusco abbassamento della pressione del sangue.

Stimola la coagulazione intravasale disseminata (CID): stimola la coagulazione in tutto il corpo ed il coagulo di tossina che si viene a creare ostruisce il vaso e se quel vaso portava sangue ad un tessuto il tessuto stesso non verrà più irrorato. Infatti i coaguli a livello del micro-circolo degli organi causano ischemia con conseguente insufficienza d'organo. A livello cutaneo, invece, può causare "petecchie" emorragiche. La coagulazione in tutto il corpo consuma i fattori della coagulazione e c'è un effetto paradosso (le molecole di fibrina vengono

prodotte e subito formano coaguli, tanto da non essere più disponibili) , perciò vengono rilasciati enzimi idrolitici da parte dei granulociti adesi all'organo e possibili conseguenti emorragie.

Lo shock endotossico è un grave quadro clinico che può accompagnare le setticemie (presenza dei batteri nel circolo sanguigno, costante e stabile, in cui i batteri si moltiplicano nel sangue. La batteriemia vede batteri nel sangue ma è una condizione transitoria. Il nostro sangue è normalmente sterile, non ci sono microrganismi. Temporaneamente vi possono essere dei batteri e si parla di batteriemia. La setticemia è una condizione grave perché i batteri si trovano stabilmente nel sangue e proliferano. In generale la presenza di batteri nel sangue è una condizione molto grave.) dei batteri Gram - caratterizzato da febbre, ipotensione, acidosi, insufficienza renale e respiratoria e nelle fasi finali da CID ed insufficienza d'organo.

L'1% dei pazienti ospedalizzati sviluppa sepsi, il 20-30% nei reparti di terapia intensiva. Per il 40-60% dei pazienti l'esito è fatale nonostante terapie antibiotiche.

Metodi di dosaggio dell'endotossina: I LPS batterici, per la loro diffusione ubiquitaria e per l'estrema stabilità ad agenti chimici e fisici, rappresentano una frequente contaminazione ambientale. Esiste la necessità di verificare la presenza di endotossine in tutti i preparati farmaceutici, nei prodotti biologici e nei reagenti che dovranno essere somministrati per via endovenosa.

Un test tanto utilizzato nelle case farmaceutiche era il test pirogeno nel coniglio. Venivano utilizzati i conigli e la sostanza di cui si voleva dosare la presenza di LPS veniva iniettata nelle vene delle orecchie dei conigli e poi analizzate e registrate le modifiche di temperatura corporea. Un aumento della temperatura indica la presenza di patogeni. Pur avendo dimostrato la sua efficacia per oltre 50 anni.

Per il controllo della sicurezza dei medicinali, oggi in disuso sia per i costi elevati nel mantenimento degli animali, che per la mancanza di etica. Test del Limulus.

Oggi si usa il LAL test, che si serve dell'utilizzo di un Limulus polyphemus, crostaceo, il quale possiede un'emolinfa (corrisponde al sangue) ricca di cellule dette amebociti. Gli amebociti hanno la proprietà di gelificare (assumere consistenza gelatinosa) anche in presenza di piccole quantità di endotossina. Si raccoglie l'emolinfa (dal colore azzurro, tanto che l'animale viene detto "Granchio reale" per il sangue blu) ricca di enzimi che agiscono sull'LPS e ne permettono la gelificazione. È un test molto semplice che si può fare anche su un vetrino. Se è presente l'LPS il preparato gelifica, diventa gelatina. Il metodo più utilizzato per fare il