Che materia stai cercando?

Appunti esame microbiologia

Appunti di microbiologia basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Provvedi dell’università degli Studi di Padova - Unipd, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea in biologia. Scarica il file in formato PDF!

Esame di MIcrobiologia docente Prof. R. Provvedi

Anteprima

ESTRATTO DOCUMENTO

PARETE CELLULARE

La parete cellulare è presente in gran parte dei Procarioti, dove circonda la membrana citoplasmatica. Essa è

formata da strati rigidi di peptidoglicano (mureina)

Eccezioni: Archea (generalmente assente; alcune specie presentano uno pseudoglicano), Micobatteri

(peptidoglicano a struttura caratteristica), Micoplasmi (privi di parete).

È una struttura rigida ma elastica e estendibile all'esterno della membrana citoplasmatica.

Caratteristiche:

Presente nella maggior parte dei procarioti (ad eccezione di alcuni)

• - Contribuisce a determinare la forma della cellula procariotica.

- Impedisce la lisi osmotica.

- Filtro per sostanze tossiche.

Elemento essenziale per la sopravvivenza della cellula batterica che è bersaglio di molti antibiotici.

• STRUTTURA DEL PEPTIDOGLICANO

Il peptidoglicano è un componente della parete delle cellule batteriche, importante perché conferisce rigidità

e serve per mantenere la pressione osmotica.

Il peptidoglicano è un polimero composto da subunità monomeriche tutte identiche di cui fanno parte due

aminozuccheri: l' N-acetilglucosamina (NAG) e l'acido N-acetil-muramico (NAM).

Catena polisaccaridica → Questi due aminozuccheri sono tenuti insieme da legami glicosidici (1,4)

• (= disaccaridi ripetuti in alternanza) catalizzato da enzimi che prendono il nome di transglicosilasi.

Tetrapeptide → Al NAM è aggiunto un residuo di acido lattico. Al gruppo carbossilico dell'acido

• lattico si lega un peptide di quattro amminoacidi la cui configurazione si alterna tra D e L (la

presenza di D-a.a. conferisce maggiore resistenza nei confronti delle proteasi).

Sebbene la sequenza di aminoacidi nei tetrapeptidi sia specie-specifica, essa contiene sempre in posizione 3

un aminoacido bibasico: generalmente L-lisina (Gram +), oppure acido meso-diaminopimelico o DAP

(Gram-).

Oltre i legami glicosidici c'è un altro tipo di legame che interviene per creare questa maglia/rete di

(1,4)

protezione e si tratta di legami crociati in cui viene coinvolto il gruppo COOH della D-Alanina che forma un

legame peptidico con il DAP di una unità monomerica appartenente a una catena adiacente.

! unità del peptidoglicano o mureina

DAP e Lisina hanno struttura molto simile, la differenza sta nel gruppo COOH del DAP

sostituito nella Lisina dall'idrogeno (H).

! Nel caso dello Staphylococcus aureus (Gram +) si interpone un

ponte di cinque glicine, tra la D-Alanina finale (di un tetrapeptide di

una unità monomerica di una catena) e la L-Lisina (di un'altra

catena tetrapeptidica appartenente a un altra unità monomerica di

un'altra catena).

Nella struttura del peptidoglicano si susseguono i due zuccheri NAM-

NAG.

È possibile notare rappresentazione schematica della catena

tetrapeptidica mediante legami crociati la cui formazione è catalizzata

da enzimi chiamati transpeptidasi.

La struttura sembra una rete, può essere paragonata alle maglie

metalli che i crociati indossavano, che conferisce resistenza e allo

stesso tempo elasticità.

In realtà gli studi hanno evidenziato che la catena di peptidoglicano

(costituita dalle varie unità monomeriche si susseguono) è elicoidale e i

peptidi protrudono all'esterno in diverse direzioni per prendere contatto

con le catene adiacenti.

La lunghezza di queste catena varia a seconda della specie microbica e della

sua dimensione: per esempio in Bacillus si hanno 50-250 unità

monomeriche, in S. aureus 18 unità monomeriche (entrambi sono Gram +).

! Nella figura le cinque sferette rappresentano gli amminoacidi della catena

peptidica. BIOSINTESI DEL PEPTIDOGLICANO

La biosintesi del peptidoglicano si articola in tre fasi che avvengono in tre diversi distretti cellulari.

Citoplasma → avviene la sintesi dei precursori (zuccheri, amminoacidi);

• Membrana citoplasmatica →avviene l'assemblaggio dei precursori per costituire l'unità

• monomerica (=sintesi dell'unità monomerica);

Spazio extracitoplasmatico → polimerizzazione delle diverse unità monomeriche per formare le

• catene di peptidoglicano.

Intervengono sia le transglicosilasi (per formare i legami glicosidici sia le transpeptidasi per formare i

(1,4)

legami crociati tra le catene peptidiche.

! Gli enzimi vengono prodotti all'interno della cellula (citoplasma) e molte proteine che il batterio produce

svolgono la loro azione all'esterno della cellula (quindi vengono secrete).

Citoplasma (avviene separatamente la sintesi dei precursori)

L'unità monomerica di peptidoglicano è costituita da due aminozuccheri il NAG e il NAM.

Il NAG viene sintetizzato sottoforma di UDP-NAG, a questo viene aggiunto il residuo di acido lattico per

formare l'UDP-NAM.

All'UDP-NAM vengono legati cinque amminoacidi (=pentapeptide, grazie ad enzimi specifici) : L-Alanina, D-

Glutammato, m-DAP, D-Alanina, D-Alanina (dipeptide D-Ala D-Ala).

Membrana citoplasmatica (avviene la sintesi dell'unità monomerica)

L'UDP-NAM assieme al pentapeptide viene prodotto nel citoplasma.

Una volta prodotto si lega ad un vettore lipidico (bactoprenolo o undecaprenil fosfato) inserito inizialmente

nel foglietto interno della membrana citoplasmatica. Il complesso prende il nome di lipide 1 (bactoprenolo+

NAM + pentapeptide).

Al lipide 1 si associa l'UDP-NAG per formare il lipide 2 (complesso macromolecolare formato dal

bactoprenolo associato all'unità monomerica di peptidoglicano composta dalla catena pentapeptidica).

! Il bactoprenolo è un alcool di 55 atomi di C, derivante dall'isoprene.

Spazio extracitoplasmatico (polimerizzazione e transpeptidazione)

Una volta formato il lipide 2 avviene un evento di traslocazione (processo di flip-flop) : l'unità monomerica

con pentapeptide associata al bactoprenolo viene traslocata dal foglietto interno della membrana

citoplasmatica al foglietto esterno e le singole unità sono polimerizzata grazie all'opera delle transglicosilasi

(è un processo ciclico).

Avviene quindi l'accrescimento della catena di peptidoglicano grazie all'associazione delle diverse unità

monomeriche questo fa si che il vettore lipidico si scarichi e traslochi dal foglietto esterno a quello interno.

Gli spazi nel peptidoglicano preesistente vengono prodotti da enzimi chiamati autolisine che lavorano nello

spazio extracitoplasmatico andando a idrolizzare determinati punti e regioni del peptidoglicano già

preesistente per consentire l'inserimento di catene neosintetizzate e quindi consentire l'accrescimento della

cellula batterica.

A questo punto avviene la formazione dei legami crociati catalizzati dagli enzimi transpeptidasi; questo

processo richiede energia che viene ottenuta dall'idrolisi del quinto amminoacido (D-Alanina). Questo è il

motivo per cui nel citoplasma l'unità monomerica è composta da un pentapeptide (5 a.a.) mentre in

superficie è composta da un tetrapeptide).

! Le autolisine tagliano il peptidoglicano pre-esistente in diversi punti, a seconda dell'attività catalitica, per

consentire l'inserimento di quello neosintetizzato.

Esempi sono le transglicosilasi litiche e le muramidasi che tagliano il legame sono endopeptidasi

(1,4);

che tagliano i legami peptidici tra due amminoacidi; sono carbossipeptidasi che rimuovono l'ultimo

amminoacidi; oppure enzimi come l'amidasi che idrolizzano il legame amidico tra il NAM e la L-Alanina.

Questi enzimi oltre che nell'accrescimento cellulare e nel turn-over del peptidoglicano intervengono anche

nel processo di separazione delle cellule figlie dopo la divisione cellulare e nel creare spazi per l'inserimento

di strutture esterne quali flagelli, pili e sistemi di secrezione.

!! Molte proteine coinvolte nella biosintesi del peptidoglicano (transglicosilasi, transpeptidasi, autolisine)

sono denominate PBP (penicillin binding proteins) per la loro capacità di legare l'antibiotico penicillina (le

PBP bloccano la biosintesi del peptidoglicano → la cellula muore)

PARETE DEI GRAM POSITIVI

Una delle peculiarità dei Gram + è il fatto di avere una parete composta da uno spesso strato di

peptidoglicano tanto che può andare a costituire il 40% del peso secco della cellula.

Hanno una membrana citoplasmatica.

Un'altra caratteristica è che nei Gram + si trovano gli acidi teicoici e lipoteicoici (assenti nei Gram -).

Gli acidi lipoteicoici attraversano tutto lo strato di peptidoglicano e si vanno ad ancorare alla membrana

citoplasmatica attraverso un'ancora di natura glicolipidica.

Gli acidi teicoici sono dei composti che si legano covalentemente al

peptidoglicano (si legano al carbonio 6 dei residui di NAM).

- Sono dei polimeri anionici che possono contenere glicerolfosfato oppure

ribitolfosfato.

- Generalmente sono associati alla D-Alanina.

- Fonte di fosfato in carenza di questo nutriente.

- Responsabili della carica complessiva negativa della superficie cellulare.

- Contribuiscono al passaggio di ioni attraverso la membrana cellulare (Ca ,

2+

Mg ).

2+

! In Bacillus subtilis in carenza di fosfato sintetizza gli acidi teicuronici, polimeri privi di fosforo e composti da

N-acetil-galattosammina e acido glucuronico.

Proteine della parete dei Gram +

Proteine possono essere associate allo spesso strato di peptidoglicano, attraverso legami covalenti o non

covalenti. Hanno diverse funzioni

Sintesi e nel ricambio di peptidoglicano.

• Adesine :

• Quando un batterio deve colonizzare un habitat (per esempio la superficie dei nostri tessuti) deve

poter aderire. Questo è reso possibile da proteine che il batterio sintetizza nel citoplasma e secerne

all'esterno. Grazie a queste proteine, il batterio può interagire con dei recettori specifici presenti sulla

superficie delle cellule epiteliali per esempio. Queste proteine consentono al batterio di aderire alla

superficie che vuole colonizzare.

Difesa verso il sistema immunitario dell'ospite :

• Nel caso dei patogeni, sono organismi che hanno evoluto dei sistemi che permettono di invadere il

nostro organismo, superando la nostra difesa immunitaria. Di solito questi sistemi sono rappresentati

da proteine che il batterio espone sulla superficie e che gli servono per fronteggiare gli anticorpi

prodotti dal nostro sistema immunitario.

Oppure altro.

! Staphylococcus aureus è un cocco Gram + che possiede sulla superficie numerose proteine che gli

consentono di instaurare un processo di infezione.

Tutti quei fattori che servono ad un batterio per aiutarlo ad instaurare un processo di infezione sono definiti

fattori di patogenicità.

Le proteine di S. aureus leganti il collagene e la fibronectina (proteine del tessuto connettivo) consentono

alla cellula batterica di aderire ai tessuti dell'ospite.

Esempio di fattore di patogenicità che S. aureus ha evoluto per superare l'azione neutralizzante degli

anticorpi è la proteina A che serve al batterio per proteggersi dal sistema immunitario dell'ospite.

La proteina A di S. aureus lega il frammento Fc degli anticorpi.

Gli anticorpi sono delle proteine di grosso peso molecolare che si organizzano a formare una struttura a Y

dividendosi in due regioni: la regione Fc (gambo) e la regione Fab (due braccia → coinvolte nel

riconoscimento specifico di alcuni pattern molecolari presenti sulla superficie dei batteri).

Gli anticorpi hanno attività neutralizzante nei confronti di proteine importanti per la sopravvivenza del

batterio e servono per indirizzare il batterio verso i fagociti del nostro sistema immunitario che hanno

proprio la funzione di distruggere i patogeni.

Sulla superficie dei fagociti sono presenti dei recettori che riconoscono specificatamente la regione Fc.

Quindi da una parte, tramite la regione Fab l'anticorpo prende contatto con la superficie batterica, dall'altra

la regione Fc trasporta e avvicina il batterio in prossimità della superficie di un fagocita che lo distrugge.

Questo processo è detto OPSONIZZAZIONE (che avviene durante la risposta immunitaria) : il frammento Fc

viene riconosciuto da recettori specifici presenti sulla superficie dei fagociti e media l'ingresso del batterio

all'interno del fagocita dove verrà distrutto.

Ruolo della proteina A di S. aureus

La proteina A inibisce la fagocitosi di S. aureus da parte del fagocita perché impedisce l'interazione tra il

frammento Fc degli anticorpi associati a pattern molecolari presenti sulla superficie del batterio e il recettore

specifico per l'Fc presente sulla superficie dei fagociti (inibizione del processo di opsonizzazione).

! La proteina A lega aspecificatamente qualsiasi frammento Fc infatti è usata in laboratorio per purificare gli

anticorpi.

Sono Gram + :

Bacillus

Streptococcus

Staphylococcus

Enterococcus

Clostridium PARETE DEI GRAM NEGATIVI

La prima differenza che salta agli occhi è che lo strato di peptidoglicano è più sottile rispetto a quello dei

Gram +.

Lo strato di peptidoglicano è circondato da un'altra membrana detta membrana esterna. La membrana

esterna ha una struttura asimmetrica con composizione chimica diversa rispetto alla membrana

citoplasmatica.

Quindi hanno due membrane (interna o citoplasmatica ed esterna)

Lo spazio compreso tra la membrana esterna e la membrana citoplasmatica, nel quale è contenuto il

peptidoglicano, prende il nome di periplasma.

La membrana esterna si ancora al peptidoglicano mediante la lipoproteina di Braun, ancorata al gruppo

COOH libero del DAP mediante legame peptidico.

La membrana esterna è formata da due foglietti: il foglietto interno è composto da fosfolipidi, il foglietto

esterno contiene fosfolipidi ma prevalentemente è composto dal lipopolisaccaride (LPS).

Anche il lipopolisaccaride è un fosfolipide ma è caratterizzato dalla presenza di una lunga catena

polisaccaridica (cosa che i fosfolipidi della membrana citoplasmatica non hanno).

Struttura del lipopolisacaride

Il lipopolisaccaride contiene lipidi e carboidrati ed è composto da tra parti:

Lipide A (parte lipidica).

• Core o nucleo polisaccaridico (parte centrale).

• Catena laterale O o antigene O-specifico (parte più distale di natura polisaccaridica).

Lipide A o endotossina

Il lipide A è un fosfolipide con acidi grassi a lunga catena (acido: capronico, laurico, miristico, palmitico,

stearico) legate mediante legame estere-aminico a un disaccaride di glucosammina-fosfato.

Il numero di acidi grassi è variabile (da 4 a 7).

Core

Il core polisaccaridico si può suddividere in due regioni:

la regione interna presenta una struttura piuttosto conservata costituita da 1 a 3 molecole di acido

• chetodeossioctonato (KDO) e zuccheri con 7 atomi di C.

la regione esterna è più variabile e contiene zuccheri a 6 o 7 atomi di C.

Antigene O-specifico o catena laterale O

Ha una composizione che varia da specie a specie (specie specifico) o all'interno della stessa specie può

variare.

Detto “antigene” perché in grado di stimolare la produzione di anticorpi specifici nei suoi confronti (=

innesca la risposta immunitaria). Alcuni patogeni “intelligenti” possono cambiare la loro composizione

chimica per sfuggire agli anticorpi specifici (questo processo è detto variazione antigenica).

È di natura polisaccaridica costituita da unità di 3-4 o 5 zuccheri ripetute (da 25 a 40 volte) che si estendono

verso l'esterno della cellula. Struttura tridimensionale del lipopolisaccaride

Ruolo del lipopolisaccaride

- Contribuisce a conferire carica negativa alla superficie della cellula batterica; associato a cationi divalenti.

- Mantiene la barriera di permeabilità della membrana esterna (previene l'entrata dei sali biliari, di detergenti

e alcuni antibiotici → proprio grazie alla membrana esterna, molti batteri Gram – sono resistenti a certi

antibiotici come certe penicilline nei confronti dei quali invece sono sensibili i Gram +).

- Favorisce l'adesione del batterio alle superfici (adesina) e la formazione di biofilm.

! Il lipide A è denominato endotossina.

È in grado di sviluppare una forte risposta infiammatoria che può uccidere la persona.

Il lipide A è il responsabile della tossicità del lipopolisaccaride:

- si libera con la lisi della cellula dovuta all'azione del sistema immunitario (il lipide A associato alla cellula

batterica integra non è tossico)

-stimola il rilascio di citochine pro-infiammatorie (IL-1, IL-6, prostaglandine e TNF):

Febbre

Ipotensione

Shock settico

Proteine associate alla membrana esterna : Porine

Sono proteine con funzione di canale presenti nella membrana esterna.

Formano dei pori e servono per facilitare la diffusione di alcune molecole, nutrienti secondo gradiente di

concentrazione (diffusione facilitata).

Si aggregano per formare un trimero all'interno della membrana esterna.

Ciascun monomero ha una struttura a barrile all'interno del quale passa il nutriente, poi ciascun monomero

di associa a formare tre unità.

Sono di due tipologie: alcune sono aspecifiche come OmpC e OmpF e attraverso queste diffondono

molecole che hanno un cut off fino a 700 Da; altre sono specifiche per esempio LamB che facilita la

diffusione di maltosio e maltodestrine (chiamata così perché rappresenta il recettore del batteriofago

lambda); Tsx facilita la diffusione di nucleosidi, serina, glicina e fenilanina (rappresenta il recettore del

batteriofago T6); TonA facilita la diffusione del ferricromo (sideroforo→molecola che trasporta ferro

dall'esterno all'interno del citoplasma) (rappresenta il recettore del batteriofago T1 e T5); BtuB facilita la

diffusione della vitamina B12.

Funzione delle proteine associate alla membrana esterna

Adesine.

• Difesa verso il sistema immunitario dell'ospite.

• Trasporto dei nutrienti.

• Secrezione.

• Altro.

Spazio periplasmatico

E' la regione compresa tra la membrana esterna e la membrana citoplasmatica.

In questo spazio oltre ad essere presente il peptidoglicano, possono essere presenti numerose proteine di

vario genere che possono svolgere diverse funzioni.

Ruolo delle proteine periplasmatiche :

Acquisizione di nutrienti

• Generazione di energia (trasporto di elettroni)

• Sintesi del peptidoglicano

• Biogenesi della membrana esterna, dei pili e dei flagelli

• Enzimi degradativi per il catabolismo di nutrienti complessi : possono esserci dei nutrienti, che

• vengono trasportati attraverso la membrana esterna raggiungendo lo spazio periplasmatico, che

però hanno delle dimensioni che sono troppo grosse per poter attraversare la membrana

citoplasmatica. Hanno quindi bisogno di essere ridotte a dimensioni minori in modo che le singole

parti possano attraversare più facilmente la membrana citoplasmatica.

Chaperonine periplasmatiche : spesso le proteine che devono essere secrete attraversano la

• membrana citoplasmatica in forma ancora denaturata e quindi per essere rilasciate richiedono

chaperonine che contribuiscono al loro folding corretto.

Sono Gram - :

Enterobatteri → Hanno come habitat naturale intestino di uomo o animali : Escherichia

Salmonella

Shigella

Yersinia

Neisseria (cocco)

Pseudomonas

Vibrio (vibrione)

Helicobacter (spirillo)

Haemophilus (coccobacillo)

Bordetella (coccobacillo)

Spirochete (spiraliformi, colorazione di gram non utile per

visualizzarli).

Colorazione di Gram (differenziale→ riconosce due tipologie di cell batteriche)

Prende il nome da Hans Christian Joachim Gram (1853-1938) collaboratore di Robert Koch (scienziato che

aveva preso il premio nobel scoprendo che la tubercolosi era causata da un batterio → Tuberculosis).

Gram nel 1882 a Berlino cerca di mettere a punto una tecnica di colorazione per evidenziare i batteri in

tessuti polmonari di pazienti morti di polmonite.

Scopre che le cellule batteriche si coloravano più intensamente con cristalvioletto e soluzione di Lugol.

Data la scarsità di tessuti reperibili, Gram ricicla vetrini precedentemente colorati, decolorandoli con etanolo

e scopre che batteri come gli pneumococchi conservano il colore anche dopo il trattamento con etanolo

mentre altri no.

Allestimento preparato :

1. Preparazione vetrino : si deposita il campione lasciandolo asciugare.

2. Fissazione : il vetrino viene messo sulla fiamma di un bunsen tre volte velocemente.

3. Colorazione

4. Osservazione

Dopo aver fissato i batteri sul vetrino, il vetrino viene immerso in un primo colorante (solitamente il cristal

violetto), successivamente avviene il trattamento con la soluzione di Lugol (a base di iodio, è un mordenzante

che facilita la penetrazione del colorante attraverso la superficie delle cellule batteriche).

Il tutto viene poi decolorato con alcool. Successivamente si immerge il vetrino in un secondo colorante (di

contrasto, di solito la safranina).

I Gram + restano viola (pertanto per Gram positivi si intendono quei microganismi che non si decolorano), i

Gram – si colorano di rosso (si decolorano e colorano con safranina).

Questo diverso comportamento è dovuto al fatto che nei Gram + il peptidoglicano costituisce uno spesso

strato che riesce a trattenere il colorante nonostante la decolorazione successiva.

I Gram – sono dotati di membrana esterna e sottile strato di peptidoglicano per cui il decolorante riesce a

rimuovere il cristal violetto e a colorarsi successivamente con la safranina.

! Le differenze strutturali tra Gram + e – sono state definite con l'avvento del TEM.

La parete cellulare aiuta a contenere la pressione osmotica infatti se metto

un batterio (bacillo) in una soluzione ipotonica e aggiungo il lisozima, il

lisozima rompe il legame glicosidico → si rompe la parete e la cellula

(1,4)

batterica va incontro a lisi. In presenza di una soluzione isotonica o con

concentrazione 0.25 di saccarosio in questo caso la cellula non scoppia e si forma un protoplasto (batterio

che ha la membrana citoplasmatica ma priva di parete). In questo caso cambia la forma questo perché il

peptidoglicano contribuisce alla forma della cellula batterica.

Esempi atipici

La maggioranza dei batteri presentano una struttura come i Gram + o i Gram -. Ma ci sono delle eccezioni:

Mycoplasma sono cellule batteriche di dimensioni piccole. Hanno una parete che non è costituita da

• peptidoglicano ma da una membrana trilaminare di natura lipoproteica .

Il genoma è di dimensioni variabili tra 580-1350 kb.

La membrana cellulare è ricca di steroli che conferiscono rigidità (gli steroli non sono presenti nei

batteri, questa è un eccezione).

Sono dotati di notevole polimorfismo strutturale ossia sono in grado di assumere forma anche molto

diverse tra loro: per questo motivo sono stati raggruppati nella classe Mollicutes (dal latino mollis

cutis, “pelle molle”).

! M. pneumoniae è la causa più frequente di polmonite dopo S. pneumoniae.

Causano infezioni croniche localizzate a livello dell'apparato respiratorio o genitale.

Micobatteri caratterizzati da una parete con struttura molto diversa rispetto a quella di Gram+ e -.

• possiedono uno strato di peptidoglicano al di sopra del quale c'è uno strato di Arabinogalattano

legato covalentemente (composto da arabinosio e galattosio). Questo strato di arabinogalattano è

sormontato da uno strato di acidi grassi a lunga catena che possono contenere tra i 60 e 90 atomi di

C e sono gli acidi micolici (tipici dei micobatteri). Questo strato di acidi micolici è sormontato a sua

volta di glicolipidi fenolici detti anche cere, pertanto i micobatteri hanno una parete altamente

idrofobica.

Sono stati fatti studi sulla parete dei micobatteri ed è stato visto che la loro struttura si avvicina di più

a quella dei Gram – che +, con la colorazione di Gram restano viola come i Gram + (a causa dello

spesso strato detto anche micomembrana).

COLORAZIONE DI ZIEHL – NEELSEN

E' una colorazione differenziale che permette di evidenziare i batteri acido-alcool resistenti (AAR).

Ha significato diagnostico per Mycobacterium tuberculosis.

Reagenti :

Fucsina fenicata: colorante primario, - Solubile nei lipidi perché contiene fenolo e etanolo.

• Acido-alcool: (3% acido; 97% colorante): è molto forte, decolorante. Rimuove la fucsina non legata

• agli acidi micolici.

Blu di metilene: colorante di contrasto. Non penetra lo strato di acidi micolici. Colora solo cellule

• non acido-alcool resistenti.

Procedimento

- Allestire il vetrino.

- Fissare alla fiamma.

- Colorante primario (5-6 min) fucsina fenicata riscaldata.

- Decolorante (30 sec) 3% Hcl in etanolo 97%.

- Colorante secondario (1 min) blu di metilene.

POLISACCARIDI EXTRA-CELLULARI

La cellula batterica si può rivestire di un ulteriore strato di natura polisaccaridica (glicocalice) denominato

capsula o strato mucoso in base alla consistenza.

Se i polisaccaridi sono ben strutturati e compatti si parla di capsula altrimenti si parla di strato mucoso se si

tratta di uno strato di polimeri non ben organizzati che permettono il passaggio di particelle.

! Colorazione con inchiostro di china per visualizzare la presenza della capsula (non ha affinità per il

colorante).

La presenza di capsula conferisce alle colonie batteriche una morfologia liscia e un aspetto lucido.

Esperimento di Griffith : attraverso questo esperimento, nel 1928, Griffith scoprì il “principio

trasformante”. Stava studiando la possibilità di fare un vaccino per prevenire la polmonite e per i suoi studi

utilizzava due ceppi del batterio Streptococcus pneumoniae: il ceppo R (rugoso) e il ceppo S (liscio).

Il ceppo R, che è privo di capsula polisaccaridica non causa la polmonite nei topi in cui viene iniettato perché

questi si difendono con il loro sistema immunitario. Al contrario, il ceppo S, che ha una capsula

polisaccaridica che lo protegge dalle difese immunitarie dell'animale, causa polmonite e successiva morte nei

topi in cui viene iniettato.

Quando il ceppo S viene inattivato alzando la temperatura e poi iniettato nei topi, perde l'effetto patogeno.

Tuttavia, quando il ceppo S inattivato viene mescolato col ceppo R e i due sono iniettati insieme nei topi,

questi contraggono polmonite e muoiono.

Isolando i batteri dal sangue di questi topi morti, Griffith scoprì che il ceppo R normalmente non patogeno

acqusisce la capsula polisaccaridica e mantiene questa caratteristica fenotipica per molte generazioni. Griffith

ipotizzò che un qualcosa del ceppo S inattivato penetrasse nel ceppo R convertendolo in un S virulento. Lui

chiamò questo qualcosa principio trasformante (oggi diremmo gene/i per la produzione della capsula

polisaccaridica).

Resistenza alla fagocitosi

Produzione di una capsula mucoide che impedisce al fagocita di aderire in maniera efficace al batterio

(Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae).

Bacillus anthracis

Le capsule possono anche non essere di natura polisaccaridica, alcuni organismi possiedono una capsula di

natura proteica come il Bacillus anthracis. Possiede una capsula costituita da un peptide omopolimerico di

acido D-glutamico. Questo è un esempio di batterio Gram + che presenta S-layer.

Streptococcus pyogenes

La capsula di Streptococcus pyogenes è costituita da acido ialuronico. Questa è una grande strategia di difesa

nei confronti del sistema immunitario dell'ospite perché l'acido ialuronico è presente nel nostro corpo . In

questo caso la capsula non è immunogena.

Neisseria meningitidis

E' un Gram – capsulato. La sua capsula è costituita da polisaccaridi che sono immunogeni, infatti il vaccino

contro questo patogeno si basa sull'antigenicità dei polisaccaridi capsulari.

RIASSUMENDO la capsula è :

Di varia natura

• polisaccaridica

◦ proteica

Prodotta da G+ e G- ancorata covalentemente alla parete o al lipide A della membrana esterna.

Funzioni e proprietà dei polisaccaridi extracellulari (capsula e glicocalice) :

Adesività

• Si tratta di materiale “appiccicoso” che favorisce l'adesione del batterio a superfici e la possibilità di

colonizzare particolari nicchie ecologiche (formazione di “biofilm”).

Resistenza

• Ad essiccamento (materiale ricco d'acqua) e nei confronti di sostanze tossiche (materiale simile a

resine a scambio ionico, che può assorbire antibiotici, metalli pesanti, batteriocine, o impedire

l'infezione da parte di batteriofagi).

Virulenza (grado di patogenicità)

• Protezione contro l'azione del sistema immunitario (capsula).

PILI O FIMBRIE

Sono delle appendici di natura proteica, più corte dei flagelli, che protrudono dalla superficie della cellula

batterica.

Si distinguono dai flagelli che sono più lunghi e spessi.

Mediano l'adesione e l'aggregazione batterica, quindi favoriscono la colonizzazione (adesione ai tessuti

animali) e la formazione di pellicole superficiali o biofilm.

Alcuni tipi di pili mediano il processo della coniugazione : il pilo sessuale prodotto dalla cellula batterica

donatrice prende contatto con la cellula batterica ricevente e si accorcia per favorirne il contatto.

Certi pili possono mediare processi di motilità (twitching motility).

! I pili non sono solo peculiarità dei Gram – perché strutture proteiche simili a pili sono state osservate anche

nei Gram +.

I pili sono suddivisi in diverse classi in base al pathway biosintetico:

Tipo I → Escherichia coli

• Tipo II o Curli → Escherichia coli

• Tipo IV → Neisseria gonorrhoeae

Le differenze riguardano sia la struttura che le diverse modalità di sintesi.

Pili di tipo I (nei Gram -)

Costituiscono la classe più abbondante di appendici superficiali.

• Sono fattori di virulenza importanti

• Adesione alla superficie dei tessuti dell'ospite.

◦ Evasione dei sistemi di difesa dell'ospite.

! Per esempio i pili consentono alla cellula batterica (Escherichia coli uropatogeno) di restare attaccata alla

superficie del tessuto epiteliale dell'uretra. I batteri privi di pili vengono lavati via dall'urina.

Struttura

Presentano una base che gli permette di ancorarsi alla membrana esterna dei batteri Gram -. Da questa

struttura basale fuoriesce un filamento costituito da un'unica proteina (pilina) ripetuta tante volte.

In questo caso la proteina si chiama PapA.

All'estremità del filamento ci sono piline diverse da PapA che interagiscono tra loro per formare l'apice del

pilo. Quella che si trova alla massima estremità, PapG, è la vera e propria adesina che interagisce

specificatamente con il recettore presente sulla superficie di una cellula tissutale.

I pili di tipo I di Escherichia coli uropatogeni sono noti anche come Pili P chiamati così da Pyelonephritis-

associated (P) pilus (la Pielonefrite è un infiammazione renale causata da alcuni ceppi di E. coli uropatogeni).

Sintesi

I pili si assemblano a partire dall'apice mediante la via “chaperon/usciere”. Detta così perché le piline dei

pili vengono prodotte nel citoplasma e secrete nel periplasma ancora in forma denaturata.

Nel periplasma ci sono le chaperonine che legano la proteina denaturata per rinaturarla/foldarla e portare la

proteina alla sua struttura tridimensionale.

“Usciere” perché accompagna la pilina in prossimità della membrana esterna dove si sta accrescendo il pilo.

Le subunità proteiche che costituiscono i pili di tipo I (e quindi i loro geni) sono raggruppate in un unico

operone insieme al sistema di secrezione “chaperon/usciere”.

Curli (pili di tipo II)

Espressi sulla superficie degli enterobatteri.

• Promuovono l'adesione e l'invasione cellulare.

• Promotori della risposta pro-infiammatoria.

Pili di tipo IV

Sono diversi, dal punto di vista strutturale, ai pili di tipo I. Si ancorano alla membrana citoplasmatica,

attraversano il periplasma, attraversano la membrana esterna e protrudono all'esterno.

Si assemblano quindi a partire dalla membrana citoplasmatica.

Anche in questo caso il pilo è costituito da un filamento di piline.

Questo è un esempio di pilo di Neisseria: la pilina del filamento è la PilA sintetizzata come preproteina

integrale di membrana → questa proteina viene sintetizzata con una regione amminoterminale (una sorta di

sequenza segnale), caratterizzata dalla presenza di amminoacidi idrofobici che servono per inserire la

proteina sulla membrana citoplasmatica.

A livello della membrana citoplasmatica interagisce con una proteina PilB è una peptidasi che rimuove il

dominio transmembrana di pre-PilA consentendone il rilascio nel periplasma e le diverse subunità di PilA

interagiscono tra loro per formare il filamento.

Questo processo richiede energia: idrolisi di ATP → PilB/PilF e PilT legano nucleotidi la cui idrolisi fornisce

energia.

L'ATP serve sia per assemblare il filamento che per disassemblarlo.

Infatti caratteristica dei pili di tipo IV è quella di assemblarsi e disassemblarsi.

PilQ è una secretina necessaria per il passaggio del pilo attraverso la membrana esterna.

Ruolo dei pili di tipo IV

Auto-aggregazione

• Adesione

• Motilità a scatti

• Formazione di biofilm

• Invasione cellulare

• Coniugazione

Adesione

Un produttore di pili di tipo IV è la Neisseria che sono

molto importanti nella fase di adesione della cellula

batterica sulla superficie tissutale.

La rappresentazione della Nesseria è quella di due cocchi

Gram - attaccati a due a due.

Le cellule prendono contattato attraverso i pili di tipo IV

con recettori espressi sulla superficie di cellule epiteliali.

I pili di tipo IV si disassemblano e consentono a Neisseria

di avvicinarsi alla cellula epiteliale e di aderire ad essa in

maniera più forte: interazione mediata da proteine

batteriche sulla membrana esterna che interagiscono con

proteine sulla superficie della cellula epiteliale.

Coniugazione

Il pilo sessuale è un pilo di tipo IV che media il processo di scambio genico denominato coniugato.

Serve per consentire alla cellula batterica donatrice di prendere contatto con il ricevente, il pilo si disassembla

e le due cellule si avvicinano creando un canale di comunicazione e il donatore trasferisce il suo materiale

genetico al ricevente.

Motilità

A scatti - twitching motility

I pili di tipo IV consentono alla cellula di muoversi a scatti con un tipo di motilità definito twitching motility

(“motilità a scatti”).

Il pilo permette al batterio di aderire alla superficie e nel momento in cui si disassembla consente

l'avanzamento della cellula batterica.

! Questo accade in Pseudomonas aeruginosa.

Per scivolamento – slime motility

Consente alla cellula batterica di muoversi su una superficie solida.

È un movimento più lento di quello consentito dal flagello.

È presente nei batteri filamentosi o bastoncellari che si muovono lungo l'asse maggiore della cellula.

“Scivolamento” perché le cellule batteriche producono una sostanza mucosa di natura polisaccaridica definita

“slime” e la secernono all'esterno attraverso il complesso del poro.

La sostanza mucosa si distribuisce tra l'interfaccia della superficie cellulare e quella della superficie solida su

cui si muove il microrganismo.

! Nei cianobatteri sono state trovate proteine fibrillari chiamate oscilline che si contraggono e favoriscono lo

scivolamento del batterio sullo slime.

In Flavobacterium johnsoniae (Gram -) lo scivolamento è indotto da un movimento delle proteine della

superficie cellulare: meccanismo a ruota dentata.

Myxococcus xanthus si muove per scivolamento utilizzando sia i pili di tipo IV sia la produzione di slime.

FLAGELLI

Sono organi di locomozione che vengono utilizzati dai batteri per spostarsi in ambienti fluidi.

• Sono filamenti sottili di natura proteica, cavi, che consentono lo spostamento mediante un

• movimento rotatorio (orario e antiorario).

Le proteine che costituiscono il flagello sono genericamente definite flagelline.

In base alla specie di appartenenza, una cellula batterica può essere dotata di uno o più

flagelli.

Pseudomonas aeruginosa (Gram - , bastoncellare) possiede un unico flagello localizzato ad un

• polo/estremità della cellula. I flagelli singoli polari sono definiti monotrichi.

Helicobacter pylori (Gram -, spirillum) possiede più flagelli che partono da un unico polo della cellula.

• I flagelli sono detti lofotrichi.

Spirillum volutans possiede due flagelli che partono da entrambi i poli della cellula. Questi flagelli

• sono detti amfitrichi.

Escherichia coli possiedono flagelli che partono da punti diversi della superficie cellulare. Questi

• flagelli sono detti peritrichi.

Il flagello è un organo di locomozione . Serve al batterio a muoversi in ambiente acquatico. Si può

muovere in maniera rotatoria sia in senso orario che antiorario.

Pseudomonas aeruginosa è un monotrico. A seconda del senso di rotazione si muove in avanti oppure

indietro.

Rhodobacter sphaeroides è un monotrico in cui il flagello ruota solo in una direzione (senso orario). Quando

ruota lui si sposta, quando smette di ruotare la cellula batterica si ferma.

E. coli è un peritrico. Quando i flagelli si muovono in maniera antioraria i flagelli si raggruppano tutti in un

fascio (questo è dovuto alle caratteristiche strutturali del flagello) che spinge il batterio in avanti.

Il movimento in senso antiorario non dura per sempre, a un certo punto il batterio inverte il senso di

rotazione e i flagelli cominciano a ruotare in senso orario. Quando ruotano in senso orario, per via della

struttura del flagello, si aprono/distendono. Avviene il capovolgimento, i flagelli si separano e avviene la

rotazione oraria (il batterio cambia direzione).

! Nel caso in cui il batterio si trovi in un ambiente dove percepisce la presenza di nutrienti, si muoverà

laddove c'è una maggiore concentrazione di nutriente.

Struttura (Gram -)

I flagelli hanno una struttura elicoidale : sono filamenti costituiti di flagellina.

Si compone di tre parti:

- Il corpo basale serve per ancorare il fllagello alla parete della cellula batterica.

- Un filamento che si estende all'esterno Costituito da circa 20.000 subunità di flagellina, lungo 10-15

micrometri – 20 nanometri.

- Un uncino o gancio struttura flessibile che serve per collegare il filamento al corpo basale.

Sono strutture di natura proteica : si formano in seguito all'interazione di proteine.

Il corpo basale nei Gram- è composto da 4 anelli mentre nei Gram + solo da 2.

Quattro anelli :

anello L costituito dalla proteina FlgH. L perché serve a tenere ancorato il flagello alla membrana

• esterna (L perché sulla membrana esterna c'è il lipopolisaccaride);

anello P costituito dalla proteina FlgI. P come peptidoglicano (anello che serve per ancorare il

• flagello al peptidoglicano);

anello MS M come membrana citoplasmatica;

• anello C costituito dalle proteine FliG, FliM, FliN. C come citoplasma.

L'anello C è il rotore del motore flagellare le tre proteine sono importanti per determinare il senso di

rotazione.

Le proteine MotB e MotA costituiscono lo statore , contribuiscono alla stabilizzazione del flagello a livello

della parete.

!

I flagelli sono strutture cave. Solitamente all'interno del filamento c'è un canale attraverso il quale passa la

flagellina. La flagellina viene prodotta nel citoplasma, viene trasportata lungo la parte interna cava del

filamento che viene generato per autoassemblaggio (associazione spontanea) della flagellina.

Di fatto il flagello è un sistema di secrezione di tipo III : secerne fattori di patogenicità importanti.

Movimento del flagello

L'energia necessaria per il movimento rotatorio del flagello, è fornita dalla forza protomotrice. La forza

protomotrice (PMF) fornisce l'energia per la rotazione del flagello. Il passaggio dei protoni attraverso le

proteine Mot esercita una forza elettrostatica sulle cariche delle proteine del rotore: l'attrazione tra cariche

positive e negative causerebbe la rotazione del corpo basale durante il flusso di protoni attraverso le

proteine Mot (modello a turbina protonica).

Ci sono alcuni microrganismi come le Spirochete (agente

eziologico della sifillide) che possiedono numerosi flagelli. Questi

sono contenuti all'interno dello spazio periplasmatico e per

questo sono definiti endoflagelli partono da un polo, sono tutti

raggruppati in un fascio detto filamento e si estendono verso il

polo opposto.

Sono dotati di movimento rotatorio, considerando la forma a

spirale imprimono alla cellula batterica un movimento tipo

cavatappi.

I flagelli delle Spirochete hanno una struttura simile a quella dei

flagelli di E. coli e Salmonella, dotati di un corpo basale, uncino e

filamento. L'unica distinzione è che il filamento è costituito da

due tipi di flagellina FlaA (riveste all'esterno il flagello a formare

come una guaina) FlaB (interna).

Flagelli degli Archaea

Costituito da un complesso proteico che forma una struttura sferoidale (tipo il pomello di una maniglia) che

si inserisce nella membrana citoplasmatica.

Non sono molti i flagelli degli Archaea studiati.

In alcuni casi è presente un uncino ma non sempre negli Archaea è distinguibile.

Andando ad analizzare la sequenza amminoacidica delle flagelline che compongono il filamento (composto

da più tipi di flagelline), queste proteine non hanno omologia con i flagelli di E.coli, Salmonella, Spirochete

ma sono proteine omologhe alle piline dei pili di tipo IV.

! I pili di tipo IV si formano da delle piline che inizialmente vengono sintetizzate con una coda idrofobica.

Questa coda idrofobica serve per inserire la proteina nella membrana citoplasmatica. Questa coda idrofobica

viene poi tagliata da una peptidasi → FlaK (che rimuove il peptide segnale delle flagelline), la pilina è

traslocata quindi all'esterno e da lì inizia ad assemblarsi per costituire il pilo.

Altra peculiarità è il fatto di essere più sottili di quelli degli eubatteri (10-12 nm).

Anche in questo caso il movimento rotatorio è orario e antiorario, l'energia è fornita dall'idrolisi di ATP.

CHEMIOTASSI

Processo migratorio innescato da un gradiente chimico di concentrazione.

I flagelli possono muoversi, ruotare in senso orario o antiorario.

! I flagelli peritrichi sono quei flagelli che partono da più punti sulla superficie della cellula batterica. Quando

questi si muovono in senso antiorario, si raccolgono in un fascio e la cellula batterica si muove in una

direzione. Quando la rotazione si inverte, il flagello si apre e la cellula batterica si riorientra nello spazio in cui

si trova.

1)

Quando la cellula batterica è in un ambiente privo del gradiente di nutriente (non ci sono molecole che

l'attraggono o la respingono) la cellula batterica si muove in maniera casuale. La cellula si muove in una

certa direzione (rotazione antioraria) a un certo punto questo movimento si inverte e la cellula può cambiare

direzione. Riprende poi la rotazione in senso antiorario e così via.

Di solito il tempo di durata dei capovolgimenti è più breve rispetto alla durata degli avanzamenti.

2)

Quando la cellula batterica è in un ambiente con gradiente di concentrazione di un nutriente , che per lei

è un attraente. In questo caso si muove con un orientamento ben preciso, nella direzione in cui è presente in

maggiore concentrazione la sostanza che l'attrae (se si trattasse di un repellente andrebbe in direzione

opposta). I movimenti da casuali diventano gli orientati, gli avanzamenti (rotazione in senso antiorario)

diventano più lunghi e i capovolgimenti meno frequenti. In un recipiente si mette una sospensione di

batteri.

Si inserisce poi nel recipiente un capillare.

Se all'interno del capillare è presente una

sostanza attraente per i batteri, dopo un po'

all'interno del capillare la densità della

popolazione batterica è maggiore rispetto a

quella presente nel recipiente.

Se nel capillare è presente un repellente, il

numero di cellule batteriche sarà inferiore

rispetto a quelle contenute nel recipiente.

Se nel capillare c'è una sostanza che non è né

repellente né attraente dopo un periodo di

tempo all'interno del capillare ci sarà una

concentrazione di batteri uguale a quella del

recipiente.

Principi della chemiotassi

Trasduzione del segnale e sistemi di regolazione a due componenti (istidine

chinasi)

Come fa una cellula batterica ad avvertire il cambiamento di una condizione ambientale e di conseguenza

attivare per esempio la sintesi di proteine che le servono per vivere in maniera più vantaggiosa in quella

condizione ambientale?

La cellula fa tutto ciò attraverso un sistema di comunicazione specifico (trasduzione del segnale) che viene

regolato da sistemi di regolazione a due componenti.

Quindi sono dei meccanismi che permettono di regolare determinati processi cellulari in risposta a varietà di

fluttuazioni ambientali.

Questi due componenti sono:

Sensore

• Regolatore della risposta

Il sensore è quella proteina che permette al batterio di rilevare un determinato segnale ambientale grazie

alla sua porzione a localizzazione più esterna.

È una proteina inserita nella membrana citoplasmatica che ha un dominio esposto all'esterno (zona

extracitoplasmatica) che interagisce con il segnale ambientale. È dotato anche di un secondo dominio

(citoplasmatico) chinasico in grado di legare ATP, idrolizzarlo e trasferire il fosfato a un residuo di istidina.

Quindi è in grado di autofosforilarsi (subisce un cambiamento conformazionale), in seguito all'interazione

con il segnale ambientale.

Una volta avvenuta l'autofosforilazione del sensore, il fosfato assieme all'istidina vengono trasferiti al

regolatore della risposta. È in virtù di questo trasferimento che avviene la trasduzione (trasmissione) del

segnale.

Il regolatore della risposta fosforilato trasmette il segnale ambientale allo specifico bersaglio. Il regolatore

della risposta fosforilato generalmente è un regolatore trascrizionale che quando è fosforilato è in grado di

legarsi ad un operatore specifico che si trova in un promotore di un gene o più geni.

Il circuito di regolazine è completato da un sistema in grado di arrestare l'effetto del segnale per essere reso

disponibile per un ciclo ulteriore.

Il check up è mediato da un enzima che è una fosfatasi : rimuove il fosfato dal regolatore della risposta.

L'attività fosfatasica è generalmente un processo più lento della fosforilazione del regolatore della risposta.

Nel momento in cui il segnale ambientale non c'è più, il regolatore della risposta fosforilato perde a mano a

mano il fosfato per azione della fosfatasi.

Il sistema quindi si spegne.

La chemiotassi ha bisogno di un chemiorecettore : questi sono espressi sulla superficie cellulare.

Esso è costituito da un complesso multiproteico di proteine MCP che si associano tra loro e interagiscono tra

loro. In E. coli sono state identificate 5 differenti MCP, e ognuna è una proteina transmembrana

Le proteine MCP sono a forma di clava (ogni clava è un dimero, si associano a due a due e ogni dimero si

associa con altri dimeri).

Methyl-accepting chemiotaxis proteins → sono proteine in grado di essere metilate.

Si inserisce nella membrana citoplasmatica, ha una parte disposta all'esterno e una parte che pesca nel

citoplasma che interagisce con le proteine CheW (adattatore → consente la corretta interazione tra MCP e

CheA) e CheA (istidina chinasi).

Il grado di metilazione influenza la conformazione di queste proteine.

In base al grado di metilazione, il chemiorecettore può trovarsi in una forma attiva (in cui l'istidina chinasi si

autofosforila) oppure una forma disattiva.

Quando l'istidina chinasi, CheA, si trova in forma attiva e quindi è in grado di autofosforilarsi il flagello ruota

in senso orario.

Quando cambia di conformazione e non si autofosforila più, il flagello ruota in senso antiorario.

La metilazione è catalizzata da una metilasi detta CheR (aggiunge gruppi metilici) . I gruppi metilici vengono

rimossi per azione di una metil esterasi detta CheB.

Il chemiorecettore cattura il segnale ambientale e trasmette al flagello il comando di ruotare in un senso o in

un altro.

Vi è quindi un adattamento del sistema per percepire qualsiasi aumento o riduzione di ligandi.

Il legame con i chemioeffettori attraenti inibisce l'autofosforilazione di CheA: quando nell'ambiente

• sono presenti chemioeffettori attraenti (= nutrienti) che interagiscono con la parte

extracitoplasmatica della proteina MCP, l'interazione tra essi imprime il cambiamento

conformazionale del sensore che porta a inibire l'autofosforilazione dell'istidina chinasi. In

conseguenza all'inibizione il flagello ruota in senso antiorario questo significa movimento

direzionato (nei confronti dell'attraente).

Quindi in presenza di una maggiore concentrazione di attraenti, il recettore assume la

conformazione inattiva.

! Nel citoplasma c'è la metilasi CheR che pian piano aggiunge gruppi metilici, anche se il

chemiorecettore è presente in conformazione inattiva. Ad un certo punto quando MCP ha raggiunto

un certo grado di metilazione, nonostante sia presente l'attraente che interagisce con MCP, cambia

conformazione, passando dallo stato inattivo allo stato attivo.

Però CheB toglie gruppi metilici, a quel punto MCP torna di nuovo in grado di legarsi con gli

attraenti e riprendere il movimento direzionato verso gli attraenti.

Questo consente la valutazione di un gradiente temporale : il batterio misura nel tempo la

presenza di un determinato attraente.

La stessa proteina di MCP può percepire attraenti e repellenti diversi.

Se non ci sono attraenti o ci sono dei repellenti , il chemiorecettore è attivo : conformazione che

• porta all'autofosforilazione dell'istidina chinasi (lega l'ATP e si fosforila).

Il fosfato viene trasferito a due diverse proteine (quindi il regolatore della risposta costituito da due

proteine): CheY (viene fosforilato da CheA); CheB (che è la metil esterasi).

Quando CheY viene fosforilato, esso va a interagire con il suo bersaglio → che sono le proteine del

rotore. In seguito a questa interazione il rotore gira in senso orario.

Contemporaneamente CheB rimuove i gruppi metilici dalle proteine MCP. Quindi diminuendo il

grado di metilazione della proteina MCP, questa cambia di conformazione e CheA diventa inattivo

(non più in grado di autofosforilarsi). Si riduce il livello di CheY fosforilato (CheY-P) e nel momento in

cui non c'è più non è più in grado di interagire con le proteine del rotore e il rotore cambia il senso

di rotazione → senso antiorario.

Quindi in assenza di attraenti o presenza di repellenti il chemiorecettore si trova nello stato attivo e

passa allo stato disattivo per azione di CheB-P.

Localizzazione proteine MCP

Questi recettori sono concentrati ai poli della cellula.

In E.coli e altre specie, i chemiorecettori sono organizzati in ampi clusters normalmente localizzati ai poli

cellulari. SPORA BATTERICA

Alcune specie microbiche come i batteri dei generi : Clostridium e Bacillus sono sporigeni : cioè in grado di

differenziarsi in una forma metabolicamente inerte (= spora) e che consente la sopravvivenza della cellula

batterica quando si trova in una condizione ambientale non sostenibile per la forma vegetativa.

Queste spore sono forma di resistenza indotta da condizioni di stress (per esempio esaurimento di nutrienti

essenziali per la crescita).

Sono strutture per la diffusione e sopravvivenza della specie in condizioni ambientali avverse.

Sono resistenti ad agenti chimici (cloroformio, etanolo, metanolo) e fisici (temperature e pH estremi, raggi

UV).

Sono metabolicamente inerti.

Nei procarioti le spore si distinguono in :

Esospore : prodotte all'esterno della cellula vegetativa (es. attinomiceti).

• Negli attinomiceti le esospore si formano dalla divisione cellulare delle ifee aeree e fanno parte del

ciclo di riproduzione.

Endospore : prodotte all'interno della cellula vegetativa (es. Bacillus subitilis).

Bacillus subtilis è il modello per eccellenza per studiare i Gram +.

In laboratorio l'intero processo di sporulazione avviene in circa 8 ore.

Si parte dalla cellula vegetativa, si ha la formazione della spora all'interno del corpo cellulare. Nel momento

in cui l'endospora è matura, la cellula madre lisa e rilascia la spora nell'ambiente.

! Il diametro della spora non supera quello della cellula madre.

La cellula madre con dentro l'endospora, prende il nome di sporangio.

Nel caso di Clostridium la spora assume una dimensione con un diametro maggiore rispetto a quello della

cellula madre, per questo gli sporangi assumono una forma definita “a mazza di tamburo”.

Le endospore si possono evidenziare mediante colorazione con verde malachite.

Procedimento :

Allestire vetrino strisciando il campione in acqua distillata.

• Fissare alla fiamma.

• Coprire i preparato con carta da blot, versare verde malachite, riscaldare fino alla comparsa dei

• vapori.

Colorare per 5 min (no essiccare).

• A vetrino freddo togliere carta e lavare con acqua (decolorazione vetrino).

• Contrastare safranina 1 min.

• Lavare con acqua.

Struttura

La spora è dotata di molteplici strati.

Si parte da un core centrale, avvolto da una membrana interna.

La membrana interna è circondata da una corteccia che si divide in due parti : corteccia della cellula

germinativa (gialla → “germ cell wall”) che diventerà la parete della cellula batterica quando germinerà.

La corteccia è circondata da una membrana esterna.

La membrana esterna è circondata da una tunica.

In alcuni casi la tunica è protetta da uno strato aggiuntivo detto esosporio (non è presente in tutte le specie

microbiche).

Scissione binaria

In condizioni ambientali favorevoli, la cellula batterica si divide per scissione

binaria. Da una cellula madre si originano due cellule figlie.

Inizia con la duplicazione del cromosoma, il corpo della cellula madre si

accresce sempre di più fino a che i due cromosomi si distanzino tra loro. A

quel punto si origina in posizione centrale un setto sul quale verranno

prodotti i componenti superficiali della cellula batterica, fino alla divisione

completa. Sporulazione

Processo di sporulazione : divisione asimmetrica

Il processo di sporulazione inizia con una divisione asimmetrica della cellula vegetativa.

Il setto si forma in prossimità di uno dei due poli e si ha generazione di due cellule con dimensioni diverse :

la parte di dimensioni maggiori della cellula vegetativa prende il nome di cellula madre, mentre la parte più

piccola della cellula prende il nome di prespora.

Prima della formazione del setto il cromosoma si replica e i due cromosomi si condensano per formare il

filamento assiale che si estende da un polo all'altro della cellula. Nella sporulazione la segregazione dei

cromosomi avviene dopo la formazione del setto.

Processo di sporulazione : inglobamento della spora

Attraverso il setto c'è un foro che tira dentro una delle due copie del cromosoma.

Una volta che parte del cromosoma è entrato nella prespora, il peptidoglicano, nella parte centrale del setto,

viene degradato e la membrana plasmatica della cellula madre in prossimità del setto si invagina, inglobando

la prespora.

Processo di sporulazione : formazione della corteccia

A questo punto avviene tra le due membrane che avvolgono la prespora, si deposita uno strato di

peptidoglicano modificato, sintetizzato dalla cellula madre, che andrà a costituire la corteccia.

In questo caso si tratta di un peptidoglicano diverso da quello della cellula vegetativa, inoltre non sono

presenti acidi teicoici e lipoteicoici.

La cellula madre in questa fase produce anche l'acido dipicolinico che sarà trasportato nella prespora e che

determina la disidratazione della prespora.

Anche l'incorporazione di Ca determina ulteriore disidratazione.

2+

Nella prespora vi è la produzione di proteine SASP.

Nella corteccia è presente il peptidoglicano, ma si tratta di un peptidoglicano modificato.

Presente solo nelle endospore batteriche.

- Nella corteccia esterna circa il 50 % dei residui di NAM sono privi della componente peptidica e al suo

posto è presente un anello lattamico a livello del NAM.

- Circa il 25 % dei residui di NAM è legato ad una sola L-alanina.

- Solo il 3% dei residui di NAM hanno una catena peptidica

coinvolta nella formazione dei legami crociati.

La corteccia si divide in due parti : una parte più esterna e una

parte più vicina alla membrana interna detta germ cell wall (che

costituirà la parete della cellula batterica durante la

germinazione).

Gli studiosi hanno visto che nella germ cell wall (strato più

interno) manca l'anello lattamico e ciò consente, durante la

germinazione, la degradazione della corteccia ma non della

parete della cellula germinativa.

Nel momento in cui la spora germina, i suoi strati di rivestimento

vengono degradati, ma viene rimossa solo quella parte di

corteccia che contiene l'anello lattamico associato al NAM perché

la degredazione è catalizzata da enzimi che riconoscono

specificatamente questa componente.

L'acido dipicolinico viene prodotto dalla cellula madre e serve per :

Facilitazione della disidratazione.

• Stabilizza gli acidi nucleici aumentandone la stabilità al calore.

• Può rappresentare fino al 15% del peso secco della spora matura.

L'acido dipicolinico è complessato agli ioni calcio, formando il dipolinato di calcio.

All'interno del core vengono prodotte le proteine SASP (Small Acid Soluble Proteins) :

Prodotte dalla prespora.

• Legame del DNA per conferire protezione all'essicazione, radiazioni ultraviolette, calore.

• Fonte di carbonio e energia durante il processo di germinazione.

Processo di sporulazione : formazione della corteccia : formazione del rivestimento esterno :

tunica e esosporio

Tunica: La tunica è uno strato proteico ricco di ponti disolfuro che circonda la membrana esterna.

• Conferisce alla spora l'aspetto rifrangente osservabile al microscopio ottico.

• Responsabile della resistenza ad agenti chimici come etanolo, cloroformio, perossido di idrogeno..

Esosporio:

Presente in alcune specie di Bacillus (B. cereus, B. anthracis) ma anche in Clostridium difficile.

• Composto da lipidi (15-18% peso secco), proteine (43-52% peso secco) e carboidrati (20-22 % peso

• secco).

È stato visto che sembra contribuire alla patogenicità.

• Conferisce ulteriore resistenza a stress chimici e fisici.

Processo di sporulazione : maturazione e rilascio della spora

Quando la spora è pronta la cellula madre lisa.

La spora rilasciata nell'ambiente, dal punto di vista metabolico, è inerte.

Può sopravvivere per periodi molto lunghi mantenendo inalterata la capacità di germinare.

Ricapitolazione :

Core

• ribosomi, DNA, etc.

◦ acido dipicolinico (fino a 15 % peso totale).

◦ 10-30 % dell'acqua presente nella cellula vegetativa.

◦ SASP (small acid-soluble spore proteins).

Cortex

• Doppio strato di peptidoglicano.

Coat

• Strato proteico ricco di ponti disolfuro.

◦ Resistenza a agenti chimici.

Esosporio

• Proteine- lipidi- polisaccaridi.

Processo di sporulazione : germinazione

Quando la spora si trova in una condizione ambientale favorevole, può germinare.

Dalla spora si ritorna alla forma vegetativa della cellula batterica.

La germinazione è associata alla capacità della spora di percepire segnali ambientali che le indicano che c'è

una condizione favorevole.

La germinazione è rimasta più difficile da caratterizzare e studiare per cui le informazioni sono un po' meno

chiare.

Parte con una fase definita di attivazione che inizia con un qualcosa che funge da segnale → ambiente

favorevole.

Successivamente segue la fase di germinazione con l'estrusione dei dipolinati di calcio e quindi la

reidratazione del core, la degradazione delle proteine SASP che facilita la ripresa dei processi metabolici.

Infine c'è la fase di esocrescita all'interno del core partono i processi metabolici per rigenerare la cellula.

COME SI COSTRUISCE UNA CELLULA

BATTERICA ?

La cellula batterica si divide per scissione binaria, per cui da una cellula madre si originano due cellule figlie.

Quindi è chiaro che la cellula madre deve avere a disposizione una quantità di materia tale da potersi

duplicare.

Per generare una nuova cellula o mantenere la propria integrità cellulare (omeostasi), una cellula deve

procurarsi materia e energia.

Due sono le domande principali :

Una cellula come si procura la materia di cui è costituita ?

• Una cellula come si procura l'energia necessaria per trasformare le molecole di partenza nelle

• molecole di cui è costituita per costruire le diverse strutture cellulari?

Questi sono i principali elementi di cui sono costituiti i batteri. Questi elementi vanno poi a costituire le

diverse macromolecole.

Per costruire una nuova cellula, la cellula madre deve procurarsi tutti questi elementi da molecole

appropriate e trasformarli nelle molecole biologiche di cui necessita (metabolismo).

Una tipica cellula batterica è costituita da diverse strutture complesse.

Queste strutture sono costituite dall'assemblaggio di pochi tipi di macromolecole.

Le macromolecole sono costituite da un numero limitato di molecole organiche semplici (circa 70),

monomeri che rappresentano i “mattoni” con cui vengono costruite tutte le macromolecole.

I monomeri sono prodotti a partire da:

Una dozzina di molecole organiche ancora più semplici (metaboliti precursori).

• Molecole inorganiche.

• Attraverso complesse reazioni metaboliche che consumano energia.

Opzioni metaboliche dei procarioti per ottenere energia

La produzione di energia metabolica si può ottenere attraverso la luce (questi organismi sono detti

fototrofi), in altri casi l'energia metabolica viene prodotta attraverso l'ossidazione di composti organici

(questi organismi sono detti chemiorganotrofi).

I batteri possono essere fototrofi, chemiorganotrofi, ma hanno anche un'altra peculiarità cioè ottenere

energia attraverso l'ossidazione di composti inorganici. (chemioinorganotrofi o chemiolitotrofi).

QUINDI :

Ottengono energia attraverso :

La luce → fototrofi

• Ossidazione di composti organici (per es. glucosio) → chemiorganotrofi.

• Ossidazione di composti inorganici (idrogeno gassoso, solfuro di idrogeno ecc.) →

• chemioinorganotrofi o chemiolitotrofi.

Questo metabolismo prende il nome anche di litotrofia o chemiolitotrofia (esclusivamente in

Bacteria e Archaea).

Eterotrofi : sovrapposizione tra le vie di approviggionamento energetico e del carbonio

(chemioeterotrofi).

Autotrofi : comprendono la maggior parte dei fototrofi (fotoautotrofi) e chemiolitotrofi

(chemiolitoautotrofi).

! I batteri patogeni fino ad ora sono tutti chemioeterotrofi.

NUTRIZIONE MICROBICA

I nutrienti sono quelle sostanze utilizzate per le biosintesi e la produzione di energia, necessari alla crescita

microbica.

I nutrienti si dividono in macronutrienti e micronutrienti.

MACRONUTRIENTI Sono così chiamati perché i microrganismi ne hanno bisogno in

• quantità relativamente grandi.

I composti che fungono da fonti di carbonio solitamente forniscono

• anche gli atomi di ossigeno e di idrogeno.

I composti che fungono da fonti di carbonio, ossigeno, e idrogeno

• sono anche fonte di elettroni (composti in forma ridotta) utilizzati per

la produzione di energia e per le reazioni di biosintesi.

L'azoto atmosferico (N può essere assimilato direttamente e ridotto

• 2)

ad ammonio (NH ) solo da alcuni batteri (cianobatteri, Rhizobium) :

4+

fissazione dell'azoto.

MICRONUTRIENTI La loro presenza è sufficiente in

• tracce, necessari in quantità

modeste.

Le tracce di contaminanti presenti

• nell'ambiente sono sufficienti per

garantire la crescita microbica.

Normalmente sono costituenti di

• enzimi e cofattori, quindi

favoriscono l'azione di catalisi e il

mantenimento della struttura

proteica.

I microrganismi necessitano di una miscela di nutrienti bilanciata .

Se la quantità di un nutriente è scarsa, la crescita microbica risulterà limitata, qualunque sia la concentrazione

degli altri nutrienti.

Assunzione di nutrienti da parte della cellula:

L'assunzione di nutrienti da parte di una cellula microbica deve essere selettiva e quindi specifica per

• i nutrienti richiesti: non è di nessun vantaggio l'introduzione di sostanze che il batterio non può

utilizzare.

Hanno certi sistemi di trasporto che devono essere in grado di trasportare i nutrienti contro un

• gradiente di concentrazione perché spesso gli habitat sono poveri di nutrienti e quindi più diluiti

rispetto al citoplasma.

I nutrienti devono essere in grado di attraversare la membrana citoplasmatica che non lascia passare

• liberamente la maggior parte delle sostanze (permeabilità selettiva)

Modalità di trasporto dei nutrienti :

Secondo gradiente (trasporto passivo) :

• Diffusione passiva.

◦ Diffusione facilitata.

Avviene attraverso canali come le purine che facilitano l'attraversamento del nutriente attraverso la

membrana citoplasmatica.

Le molecole capaci di attraversare liberamente la membrana per diffusione passiva sono poche e molto

piccole (H O, O , CO ).

2 2 2

Diffusione facilitata : processo di diffusione facilitato da proteine di canale trasportatrici denominate

permeasi (per es. acquaporine).

Nonostante il coinvolgimento di una proteina di trasporto, la diffusione facilitata è un vero processo di

diffusione: il movimento dei soluti è sostenuto dal gradiente di concentrazione tra le due facce della

membrana e non richiede energia metabolica.

! L'acqua riesce ad attraversare la membrana citoplasmatica ma in un processo piuttosto lento, le

acquaporine sono dei canali che facilitano la diffusione dell'acqua.

Contro gradiente (trasporto attivo) :

• Trasporto primario (trasportatori ABC).

◦ Trasporto secondario (mediante gradienti di protoni e di ioni Na .

+)

◦ Traslocazione di gruppo (peculiare di alcune specie microbiche).

È necessario il consumo di energia.

TRASPORTO PRIMARIO : Trasportatori ABC

Esempio di trasporto primario, per introdurre nutrienti contro gradiente di concentrazione

ABC : ATP binding cassette.

Questi trasportatori legano e idrolizzano ATP per ricavare l'energia necessaria per il trasporto del nutriente.

Spesso sono dei sistemi di trasporto specifici nei confronti di nutrienti specifici.

L'idrolisi di ATP fornisce l'energia per tirare dentro i nutrienti.

Nei Gram – il nutriente viene traghettato attraverso il periplasma da proteine periplasmatiche che lo

• legano specificatamente (PBP : periplasmic binding protein) e lo presentano al suo canale

citoplasmatico.

Nei Gram + l'equivalente della PBP è associata alla superficie esterna della membrana citoplasmatica.

• Questi tipi di trasporto sono utilizzati per il trasporto di zuccheri, amminoacidi, PO a basse

43+

• concentrazioni (PST → trasportatore che introduce il fosfato quando esso è presente nell'ambiente a

basse concentrazioni).

TRASPORTO SECONDARIO : Mediante gradienti di protoni e di ioni Na +

I nutrienti vengono trasportati sfruttando l'energia di un gradiente elettrochimico di ioni H o Na generato

+ +

pompando fuori gli ioni mediante un sistema di trasporto primario.

Simporto : trasporto simultaneo di due sostanze nella stessa direzione.

• Antiporto : trasporto simultaneo di due sostanze in direzione opposta

Simporto

I protoni sono trasportati fuori dalla membrana citoplasmatica durante il

trasporto degli elettroni nei processi di conservazione dell'energia: i protoni

sono più concentrati all'esterno.

Si genera un gradiente di protoni che produce energia elettrochimica che

può essere utilizzata per il trasporto attivo di nutrienti: il trasportatore del

nutriente trasporto anche i protoni che rientrano nella cellula (cotrasporto o

simporto).

Anche la lattosio permeasi è un esempio di simporto.

Antiporto Quindi un gradiente di protoni può fornire l'energia

per il trasporto attivo di ioni Na all'esterno della

+

cellula e generare un gradiente che fornirà un

gradiente che fornirà l'energia per il trasporto di

nutrienti.

Nutrienti trasportati mediante trasporto

secondario :

Zuccheri

• Amminoacidi

• Fosfato inorganico (Pit) : quando è presente

• in concentrazioni più elevate nell'ambiente.

Uno stesso nutriente può essere trasportato con diverse modalità che differiscono per:

- Fonte di energia (ATP, PMF).

- Affinità per il soluto trasportato (sistemi Pit e PST del fosfato).

- Meccanismi di regolazione.

Ciò evidentemente conferisce al batterio la capacità di sopravvivere meglio in un ambiente variabile.

TRASLOCAZIONE DI GRUPPO : Sistema della PhosfoTransferasi (PTS)

(modificazione chimica della molecola da trasportare)

Si trova in specie quali E.coli e Salmonella. Non si trova in tutti i procarioti (non in quelli con metabolismo

aerobi). SISTEMA ESCLUSIVO DEI BATTERI.

Questi organismi trasportano zuccheri come : glucosio, mannosio, mannitolo, fruttosio utilizzando il sistema

della PTS.

Si tratta di un sistema di trasporto che richiede la modificazione chimica della molecola da trasportare.

Il sistema PTS è costituito da tre componenti : enzima I, enzima II, proteina HPr.

L'energia è fornita dal fosfoenolpiruvato che idrolizzato trasferisce il fosfato all'enzima I, trasferito poi alla

proteina Hpr, poi alle componenti dell'enzima II, fino a che arriva all'ultimo componente dell'enzima II

associato alla membrana citoplasmatica dove poi viene trasferito al glucosio (per esempio). Il glucosio una

volta fosforilato entra dentro la cellula.

Quindi queste proteine vengono alternativamente fosforilate e defosforilate determinando un trasferimento

a cascata di un gruppo fosfato.

Le proteine EII possono essere distinte o costituire tre domini distinti (a,b,c → inserito nella membrana

citoplasmatica) della stessa proteina.

L'enzima I e la proteina HPr non sono specifiche per il trasporto del glucosio (general PTS proteins).

L'enzima II è specifico per lo zucchero che deve essere trasportato.

Trasporto del ferro

Il ferro è un elemento di vitale importanza per le cellule batteriche, perché è un componente essenziale di

proteine , quali : citocromi e proteine ferro zolfo coinvolte nel trasporto degli elettroni.

Quindi le cellule batteriche hanno evoluto dei sistemi molto efficienti, per procacciare il ferro dall'ambiente.

Il batterio è in grado di sintetizzare dei composti chimici detti siderofori, prodotti nel citoplasma e vengono

poi secreti fuori dalla cellula batterica.

Questi siderofori intercettano il ferro presente nell'ambiente, si associano allo ione ferrico, una volta che il

ferro è stato legato al sideroforo, quest'ultimo viene riconosciuto da un recettore (canale) presente sulla

membrana esterna (nei Gram -), entra nello spazio periplasmatico dove viene riconosciuto da una PBP

specifica (Periplasmic binding protein), che riconosce il sideroforo complessato con lo ione ferrico. Questo

complesso viene riconosciuto da un trasportatore ABC specifico.

! L'ambiente citoplasmatico è un ambiente riducente e quindi lo ione ferrico viene ridotto a ione ferroso.

I siderofori possono essere di diversa tipologia, diversa composizione.

Molti sono derivati dell'acido idrossamico e prendono il nome di ferrocromi. (prodotto nel citoplasma)

Gli Enterobatteri (tipo E. coli, Salmonella) possiedono siderofori che derivano da un composto aromatico, il

catecolo.

(prodotto nel citoplasma)

Ambienti marini

Negli ambienti marini dove il ferro può essere presente, ma in concentrazione molto bassa, alcune specie

microbiche hanno sviluppato un meccanismo diverso per procacciarsi il ferro e che si basa sulla produzione

di acquacheline: molecole dotate di una regione idrofobica e una regione idrofilica in grado di legare il ferro.

Sintetizzati nel citoplasma della cellula batterica e secreti all'esterno.

In virtù della loro natura chimica-fisica, una volta secrete nell'acqua, si dispongono a formare delle micelle

con le code idrofobiche al centro e le teste idrofiliche rivolte all'esterno.

Quando le micelle si sono complessate con il ferro, formano una grossa vescicola che si fonde con la

membrana delle cellule batteriche e consente l'ingresso del ferro catturato nell'ambiente.

Alcuni batteri come Lactobacillus plantarum e Borrelia burgdoferii non contengono affatto ferro che è

sostituito da Mn (manganese).

2+

COLTIVAZIONE DEI BATTERI

I batteri si possono coltivare in terreni liquidi oppure in terreni solidi (di solito distribuiti sulle piastre di petri).

Per essere efficace un terreno di coltura deve contenere tutti i nutrienti di cui un dato microrganismo ha

bisogno per crescere.

Classi di terreni di coltura

CHIMICAMENTE DEFINITI : Composti da quantità definite di composti organici e inorganici

• altamente purificati e disciolti in acqua distillata : si conoscono le concentrazioni esatte dei singoli

componenti.

TERRENI INDEFINITI (complessi) : Composti da derivati di prodotti animali o vegetali (es. caseina),

• carne, soia, estratti di lievito, qualsiasi sostanza ad elevato contenuto nutritivo : non si conosce la

composizione chimica esatta

! Peptone : prodotto derivante da latte o carne digerita che oltre a piccoli peptidi contiene grassi, metalli,

sali, vitamine e altri composti biologici.

Preparazione terreno liquido

I terreni liquidi sono definiti comunemente brodi. Si comprano i composti chimici (nutrienti), il contenuto

viene versato in un contenitore

Una volta che tutti i componenti sono disciolti, si trasferisce in una provetta e si porta a volume in modo da

avere un volume preciso.

Preparazione terreno solido

I terreni solidi contengonom oltre alle componenti nutrizionali, selettive e differenziali specifiche, agenti

solidificanti come l'agar (brodo pù agar 1.5-2%) con la funzione di gelificante.

Per far si che l'agar si disciolga nel terreno è necessario innalzare la temperatura.

I terreni solidi solitamente vengono utilizzati per isolare i microrganismi e ottenere colture pure.

Possono essere contenuti in provetta o in piastra. Per batteri sospesi in terreno liquido : è possibile

isolare ciascuna singola cellula batterica

eseguendo opportuni strisci su una piastra di

terreno solido ( =isolamento).

Esempio di co lonie batteriche derivanti da singola cellula separata dal pool

con tecnica dell'isolamento su piastra. Per eseguire queste operazioni si

utilizzano delle anse.

Alla fine si ottengono delle colonie batteriche derivanti da una singola cellula.

Le diluizioni seriali sono necessarie per ottenere un numero di colonie facilmente contabili (da 30 a 300). Il

fattore di diluizione è il reciproco della diluizione. Esempio di colonie batteriche

derivanti da una singola cellula

separata dal pool in seguito a

diluizioni seriali.

Si prendono tante provette, in ognuna delle quali c'è un volume identico di terreno (9 ml).

Prendo la provetta che contiene la soluzione batterica torbida, pesco 1 ml, e lo diluisco nei 9 ml della prima

provetta (diluizione 1 a 10).

Mescolo il tutto, poi prendo 1 ml e lo trasferisco in una seconda provetta di 9 ml (diluizione 1 a 100).

Prendo 1 ml e lo trasferisco in una terza provetta di 9 ml (diluizione 1 a 1000).

Infine 1 ml da ogni provetta e lo semino in una piastra diversa.

Le piastre vengono incubate.

Nella prima piastra ci sarà un tappeto di cellule (molto concentrate) ; man mano i batteri si diradano fino a

che riesco ad isolare le singole colonie.

Poi si contano le colonie, il numero di colonie contate si moltiplicano per il fattore di diluizione (tipo 10 alla 3)

e risalgo a quante cellule batteriche c'erano in 1 ml della mia provetta torbida.

Le colonie derivanti da singole cellule batteriche sono denominate unità formanti colonie (ufc)

Terreni di coltura : suddivisione in base alla loro funzione :

Non selettivi

• Selettivi

• Differenziali

• Selettivi e differenziali

• Arricchiti

Non selettivi

Sono quei terreni, ricchi dal punto di vista nutritivo perché contengono molti nutrienti che consentono la

crescita di molti microrganismi.

Un esempio è il BRAIN HEART INFUSION BROTH.

Terreni arricchiti e differenziali : agar sangue

Crescono Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis.

Il sangue è un nutriente che favorisce la crescita di certi microrganismi e consente di differenziarli e quindi

riconoscerli in base alle loro proprietà emolitiche.

In base all'attività emolitica si dividono in alfa, beta, gamma emoitici.

Microrganismi come Streptococcus pneumoniae, sono alfa emolitici: il colore verdognolo è dovuto

all'ossidazione dell'emoglobina per azione dei perossidi prodotti dai batteri.

Microrganismi come Streptococcus pyogenes sono beta emolitici → completa rottura dell'emoglobina e dei

globuli rossi.

Microrganismi come Enterococcus faecalis sono gamma emolitici → non sono in grado di lisare i globuli

rossi.

Terreni selettivi : Sabouraud

Favoriscono la crescita di particolari microrganismi : lieviti, Candide (Candida albicans).

Terreni selettivi e differenziali : Mac Conkey

Selettivo per gli enterobatteri : cristal violetto e sali biliari favoriscono la crescita degli enterobatteri Gram – e

inibiscono la crescita dei Gram +.

Differenziale : la degradazione del lattosio produce acido che determina il viraggio dl colore.

Indicatore di pH : rosso neutro.

Terreni selettivi e differenziali : Mannitol Salt Agar (MSA)

Selettivo : perché favorisce la crescita degli stafilococchi

Differenziale : perché distinguiamo gli stafilococchi fermentanti il mannitolo (S. aureus) dai non fermentanti

(S. epidermidis).

Oltre il mannitolo è presente un indicatore fenolico rosso e 7.5% cloruro di sodio.

Se l'organismo è in grado di fermentare il mannitolo , i batteri si colorano di giallo, altrimenti non lo

diventano.

Morfologia delle cellule batteriche

Quando le colonie crescono su una piastra di terreno solido possono avere diverse morfologie.

La morfologia delle colonie dipende dal tipo di organismo, condizioni di coltura, nutrienti forniti ecc.

! Specie batteriche diverse presentano colonie con caratteristiche morfologiche diverse.

CRESCITA DEI BATTERI

Ciclo cellulare : sequenza completa di eventi compresi tra la formazione di una nuova cellula e la

successiva divisione cellulare.

La scissione binaria è un tipo di riproduzione asessuata in cui una cellula madre si divide simmetricamente

in due cellule figlie più piccole di eguali dimensioni.

Nei procarioti la scissione binaria assicura la crescita di una popolazione batterica, cioè l’aumento del numero

di cellule e il mantenimento della specie nel tempo.

Nella maggior parte dei procarioti, una cellula continua a crescere finché non si divide per scissione binaria in

due cellule figlie più piccole, geneticamente identiche alla cellula madre.

Esse sono pertanto dei cloni e l’unica fonte di variabilità che ci si può aspettare da una generazione alla

successiva è quella derivata da eventuali errori non corretti insorti durante la duplicazione del DNA.

Quando una cellula madre si divide in due cellule figlie si dice che è avvenuta una generazione.

Il tempo necessario a un batterio per svolgere una generazione è variabile e dipende da vari fattori

nutrizionali e genetici.

La separazione delle due cellule figlie avviene attraverso la formazione nella cellula madre di un setto,

derivato dall’introflessione della membrana plasmatica e della parete cellulare e che si estende da direzioni

opposte verso il centro della cellula.

Ogni cellula figlia riceve quantità sufficienti di vari composti organici e composti inorganici e di

macromolecole, in modo da poter vivere autonomamente.

Poco prima che avvenga la scissione binaria, contemporaneamente all’accrescimento della cellula madre, il

DNA si duplica, rimanendo ancorato alla membrana plasmatica.

Grazie al setto le due molecole di DNA vengono separate e distribuite nelle cellule figlie.

La formazione del setto di divisione dipende dalla generazione dell'anello Z che definisce il piano di divdione

cellulare.

L'anello Z è costituito da filamenti della proteina FtsZ polimerizzata che nell'insieme formano un reticolo

che si dispone ad anello.

Le proteine necessarie alla scissione binaria

La divisione cellulare necessita di alcune importanti proteine, chiamate Fts, proteine filamentose sensibili alla

temperatura (in riferimento alle caratteristiche di batteri mutanti nei geni che codificano per queste proteine).

Le proteine Fts formano un apparato di divisione chiamato divisoma che promuove la sintesi del setto di

divisione.

Tra di esse, FtsZ forma un anello appena al di sotto della membrana plasmatica in corrispondenza del centro

della cellula e richiama altre proteine.

! FtsZ ha analogie strutturali con la tubilina, presente in Bacteria e Archaea.

La replicazione del DNA avviene prima della formazione dell'anello di proteine FtsZ.

Reclutamento delle proteine del divisoma

Le proteine del divisoma stabilizzano l'anello Z e ri-orientano le proteine per la sintesi degli involucri cellulari

per la formazione del setto di divisione.

In una cellula di Escherichia Coli, circa 10000 molecole di FtsZ polimerizzeranno per formare un anello

completo capace poi di richiamare altre proteine della divisione cellulare, quali FtsA e la ZipA.

La prima è un enzima che idrolizza l'ATP, generando così l'energia per l'assemblaggio di molte proteine del

divisoma.

ZipA è, invece, una proteina d'ancoraggio che lega le proteine dell'anello FtsZ alla membrana citoplasmatica.

Il divisoma contiene anche proteine: FtsI dirige la costruzione della parete e quindi la sintesi di

peptidoglicano, mentre FtsK si occupa della ripartizione dei due cromosomi alle cellule figlie.

Altra proteina importante per il setto è FtsQ, nei cui mutanti non si ha neanche l'inizio della formazione del

setto.

Ruolo delle proteine del divisoma

! Associazione del divisoma con proteine coinvolte nella biosintesi degli involucri cellulari e nei processi di

separazione delle cellule figlie.

In E.coli la duplicazione del cromosoma avviene in circa 40 min.

La formazione del setto di divisione e la conseguente separazione delle due cellule figlie avviene in circa 20

min. → TOT 60 MIN.

Escherichia coli può completare il suo ciclo cellulare anche in 20 min : come possono bastare 20 min se ne

occorrono sempre 40 per la replicazione del DNA??

→ Coordinazione tra replicazione del DNA e divisione cellulare

Quando la velocità di crescita è elevata (20-25 min, mentre il DNA si replica ogni 40 min), prima della

divisione cellulare, si avvia un nuovo ciclo di replicazione del DNA quando ancora non è stato completato il

ciclo precedente.

Un nuovo ciclo di replicazione inizia prima che si completi il ciclo precedente.

Le cellule figlie ereditano un cromosoma in cui il processo di divisione è già avviato.

Come si misura la crescita microbica ?

Ovvero come si determina l'andamento della crescita della poplazione di una determinata specie batterica in

una coltura in laboratorio?

Qualsiasi esperimento che abbia come oggetto di studio un microrganismo richiede che tale

• microrganismo sia prodotto in grande quantità.

Per tale motivo è importante conoscere le sue caratteristiche durante la crescita.

• Coltura chiusa (batch → sistema chiuso) di una popolazione batterica

I batteri inoculati in un terreno replicandosi aumentano di massa rendendo torbido il terreno.

La coltura in batch è un sistema chiuso, in quanto all’inizio della coltura vengono forniti tutti i nutrienti

necessari alla crescita cellulare (detti nel loro complesso terreno di coltura) senza aggiunte successive. La

cinetica di crescita è caratterizzata da quattro fasi:

- fase di latenza, durante la quale le cellule si adattano al terreno, perciò non si ha un incremento della

biomassa (massa complessiva delle cellule);

- fase di crescita esponenziale, nella quale le cellule si dividono molto rapidamente, secondo appunto un

x

andamento esponenziale del tipo y= 2 , dove y è il numero di cellule e x il numero di generazioni;

- fase stazionaria, durante la quale la crescita rallenta man mano che i nutrienti scarseggiano, fino ad

arrestarsi;

fase di letalità, nella quale la scarsità di nutrienti è tale da causare la diminuzione della biomassa,

– poichè muoiono più cellule di quelle che si generano, determinando la fine della coltura.

Caratteristiche :

Volume fisso di terreno di coltura

– Composizione dl terreno varia a causa del metabolismo delle cellule batteriche in crescita (consumo

– di nutrienti, secrezione di sostanze di scarto).

Fase di latenza

Si ha latenza quando:

l'inoculo proviene da una coltura in stazionaria ed è introdotto in un terreno uguale a quello di

– provenienza (ripresa metabolica)

l'inoculo contiene cellule danneggiate (ripara danno)

– l'inoculo proviene da un terreno ricco ed è introdotto in un mezzo povero.

Fase di adattamento dell'inoculo alle nuove condizioni di crescita:

↑ dimensioni cellule

↑ enzimi specifici per i nuovi metaboliti

↑ sintesi RNA e proteine

il contenuto in DNA rimane costante

fase finale, inizio processi divisionali.

Non si ha latenza quando:

L'inoculo, in fase esponenziale, viene trasferito in un terreno uguale a quello di provenienza e incubato nelle

stesse condizioni.

Fase esponenziale (log)

Tutte le cellule sono in divisione per cui il loro numero aumenta in modo esponenziale.

Crescita bilanciata : relazione fra n° di cellule e contenuto dei vari componenti cellulari (DNA, RNA, proteine).

Rallentamento crescita in fase finale.

L'inclinazione della curva dipenderà sia dalle caratteristiche genetiche del ceppo che dalle condizioni di

coltura.

Le cellule sono in divisione e dividono con un tasso caratteristico del ceppo batterico a quelle particolari

condizioni. Il tempo di generazione può essere determinato sperimentalmente contando il numero di cellule

a vari punti lungo la curva.

Situazione ottimale per caratterizzare il ceppo batterico.

La scala logaritmica permette di valutare meglio il tempo di generazione

! 1ml di coltura batterica in fase esponenziale contiene 10 10 ufc.

6 – 8

Fase stazionaria

L'ambiente inizia ad essere ostile (deplezione nutrienti, presenza di prodotti di scarto, etc.)

Le cellule morte vengono sostituite

I batteri sporigeni danno avvio alla sporulazione.

Alcuni organismi producono metaboliti secondari.

Durata variabile in funzione del microrganismo

Le cellule subiscono cambiamenti morfologici (es. dimensioni minori) e funzionali (es. maggiroe resistenza a

vari tipi di stress).

Fase di declino (morte)

Peggioramento delle condizioni presenti in stazionaria.

Morte cellulare con (+ - veloce) o senza lisi.

Andamento strettamente dipendente dalla specie.

In laboratorio, dopo alcune ore che la cellula batterica è in fase stazionaria, come in Bacillus subitilis, produce

angospore → inizia la differenziazione della spora. Molti microrganismi proprio in questa fase producono

antibiotici.

Molti batteri tendono a lisare (pneumococchi) perché inducono le autolisine (enzimi che rimodellano il

peptidoglicano per consentire l'ingresso delle catene di peptidoglicano neosintetizzato) che cominciano la

fase di morte.

Come si determina il numero di cellule batteriche presenti in un campione biologico?

Conta vitale

Determinazione del numero di cellule di un campione capace di formare colonie su un terreno agarizzato (ufc

= unità formanti colonia)

Piastramento in superficie

• Piastramento per incusione

Nel piastramento in superficie, un volume noto di solito 0, 1 ml o meno, di una coltura opportunamente

diluita viene distribuito sulla superficie di una piastra di terreno agarizzato con una spatola di vetro sterile. La

piastra viene incubata fino alla comparsa delle colonie, che vengono quindi contate. E’ importante che la

superficie della piastra sia piuttosto asciutta in modo che il liquido si adsorba.

Solitamente si evita di usare volumi maggiori di 0, 1 ml per evitare che il liquido in eccesso non si adsorba e

possa provocare la fusione di colonie diverse rendendo difficile il conteggio.

Nel piastramento per inclusione, un volume noto (di solito 0,1?1,0 ml) di coltura viene pipettato in una

capsula petri sterile; viene poi aggiunto il terreno agarizzato fuso e il tutto viene mescolato facendo ruotare

gentilmente la piastra sul piano del tavolo. In entrambe le tecniche è importante che il numero di colonie che

si sviluppano su una piastra non sia troppo elevato, poiché un eccessivo affollamento Impedisce ad alcune

cellule di formare colonie e il conteggio sarebbe quindi sottostimato. Inoltre è anche essenziale che il numero

di colonie non sia troppo piccolo. altrimenti la significatività. statistica del numero di cellule così calcolato

sarebbe troppo bassa. La pratica corrente, che è quella statisticamente più valida, consiste nel contare le

colonie solo nelle piastre che contengono un numero di colonie compreso tra 30 e 300.

Se piastro 1ml o 0,1 ml direttamente da una coltura in fase esponenziale, la superficie della piastra

– risulterà interamente ricoperta dai batteri.

Per contare le cellule vitali presenti in 1 ml di coltura (titolazione) è necessario eseguire delle

– diluizioni seriali.

Il numero di cellule batteriche si determina attraverso la conta vitale facendo diluizioni seriali → prendo

beuta, a intervalli di tempo prelevo un aliquota, faccio diluizioni seriali e le piastro su piastre di petri (con

terreno agarizzato).

Normalmente le cellule batteriche si prendono in fase esponenziale.

La conta totale delle cellule batteriche

Conta diretta al microscopio

• campioni essiccati su un vetrino e colorati

◦ campioni sospesi in liquido (camera di conta Petroff-Hausser)

Misure di torbidità

C'è un sistema che permette di stabilire in tempo reale il fatto che i batteri sono presenti in fase esponenziale

→ si va a rilevare la torbidità della cultura → i batteri inoculati in un terreno si replicano e quindi lo rendono

torbido.

Una sospensione cellulare appare torbida perchè ogni cellula riflette e disperde (diffonde) la luce.

> N° cellule presenti > la luce riflessa > torbidità.

La torbidità si può misurare con :

Colorimetro

– Spettrofotometro

→ Strumenti che fanno passare la luce attraverso una sospensione celulare e misurano la quantità di luce non

riflessa che riemerge.

Man mano che le cellule batteriche aumentano di massa la provetta diventa torbida e la quantità di luce che

viene rilevata è inferiore → all'aumentare della massa batterica c'è una diminuzione della quantità di luce

rilevata.

SPETTROFOTOMETRO

Lo spettrofotometro è uno strumento dotato di una lente, un prisma, che scompone la luce, un filtro che

lascia passare solo la luce di una determinata lunghezza d'onda (normalmente la torbidità dei batteri viene

misurata alla lunghezza d'onda di 600 nm → nel campo del visibile) poi il detectur → cioè la lettura. Il tutto

viene colpito da una sorgente di luce.

Nello spettrofotometro la luce viene diffratta da un prisma e viene selezionato un raggio di una determinata

lunghezza d'onda.

COLORIMETRO

Il colorimetro usa un filtro ad ampia banda e il raggio di luce monocromatica viene creato facendo

passare la luce attraverso un filtro colorato.

Per ottenere un numero che aumenti all'aumentare della massa della coltura si misura la torbidità utilizzando

come unità di misura la densità ottica o assorbanza.

Ottengo un valore che man mano che aumenta la torbidità aumenta.

CURVA DI CRESCITA (coltura in batch)

Posso calcolare una curva di crescita in base alla densità ottica.

La curva verde è la curva di crescita della coltura disegnata allegendo la densità ottica.

La curva in rosso è la curva di crescita della popolazione batterica misurata andando a contare le cellule.

CHEMOSTATO

È possibile avere delle culture continue usando il chemostato. È uno strumento con cui posso regolare la

quantità di terreno fresco che metto e eliminare poi il terreno dove sono cresciuti i batteri quindi posso

regolare una serie di parametri e fare in modo per esempio che le condizioni di coltura siano sempre le

stesse.

Questo permette di far sì che le cellule batteriche crescano sempre in fase esponenziale.

Colture in continuo (sistema aperto)

– Variando la velocità di diluizione e la concentrazione di un nutriente si può controllare la densità di

– popolazione e la velocità di crescita.

Permette di studiare una coltura stabilizzata in una particolare fase di crescita.

– Utilizzato molto per studi di fisiologia microbica perchè permette di ottenere condizioni di crescita

– riproducibili. BIOFILM

In natura i microrganismi vivono in comunità microbiche che prendono il nome di biofilm.

Caratteristiche :

Sono comunità microbiche avvolte da una matrice extracellulare prodotta dai microrganismi

• (protezione ambientale).

Costituite da una stessa specie microbica (es. nei siti di infezione) o da specie diverse (es. in natura).

• In stretto contatto con la superficie colonizzata che può essere biotica (tessuti) o abiotica (plastica,

• metalli)

Formazione

1. La superficie è colonizzata da cellule planctoniche.

Le cellule aderiscono, inizialmente possono aderire in maniera aspecifica poi può diventare

2. irreversibile mediata da fattori di adesione (costitutivi o indotti) → il batterio può indurre la sintesi

delle adesine necessarie all'ancoraggio.

Una volta stabilita l'adesione, il batterio prende contatto con la superficie, il flagello non serve più e

3. quindi avviene la repressione della biosintesi del flagello.

Il batterio inizia a moltiplicarsi formando microcolonie → in questa fase i batteri cominciano a

produrre materiale extracellulare di natura polisaccaridica che va a costituire la matrice nella quale

loro sono immersi (che fa da schermo protettivo).

4. Crescita e formazione del biofilm maturo.

All'interno del biofilm possono formarsi delle rotture meccaniche per produzione di enzimi

5. degradativi o induzione di profagi, che vanno a rompere la matrice che si è formata e quindi

all'interno del biofilm si formano come delle cavità.

! il biofilm non è mai una pellicola compatta ma all'interno della matrice possono esserci delle

aperture/canali.

La placca dentale è un biofilm : la placca dentale si forma per associazione di microrganismi di specie

diverse che vanno a costituire un biofilm.

Generalmente i primi microrganismi che formano la placca dentale sono streptococchi orali : nella saliva

sono presenti delle glicoproteine, gli streptococchi possiedono delle adesine che interagiscono con queste

glicoproteine e permettono di aderire al dentro.

Sopra la superficie di streptococchi orali sono espresse molte altre proteine che vengono riconosciute da

adesine di altre specie microbiche presenti nell'ambiente.

I batteri secernono materiale extracellulare (generalmente di natura polisaccaridica) ma possono anche

secernere DNA.

A questo punto i batteri svolgono il loro metabolismo, consumano ossigeno creando un ambiente anossico

che quindi potrà essere colonizzato anche da batteri con metabolismo anaerobio.

Col tempo la matrice extracellulare può calcificarsi → formazione del tartaro.

! Nell'ambiente anossico vive lo Streptococcus mutans, agente eziologico della carie. Fa venire la carie perché

durante la fermentazione produce acido lattico che va a corrodere la superficie del dente.

Il lisozima della saliva contiene il numero di batteri.

Vantaggi del biofilm

Resistenza ad agenti esterni:

• Essiccamento

◦ Shock termico

◦ Trattamento con detergenti

◦ Trattamento con antimicrobici

◦ Sistemi di difesa dell'ospite

◦ Maggiore frequenza di eventi di scambio genico orizzontale.

Forma di resistenza che consente alla cellula di rimanere in uno stato vegetativo e continuare a

• moltiplicarsi.

Il biofilm è un sistema dinamico, i batteri che ne fanno parte vanno incontro a cambiamenti del loro stato

metabolico.

L'interno del biofilm non è una struttura compatta ma ci sono canali/apertura per favorire l'entrata di

nutrienti e l'uscita di sostanze di scarto.

I biofilm rappresentano un problema in medicina perché tendono a formarsi nei dispositivi medici installati

nei pazienti (cateteri, protesi, pacemakers).

I microrganismi più comunemente associati alla formazione di biofilm nei dispositivi medici sono

stafilococchi (principalmente S. aureus e S. epidermidis, P. aeruginosa).

QUORUM SENSING

E' un meccanismo di comunicazione tre cellule batteriche.

Le cellule batteriche presenti in una comunità riescono a produrre dei segnali, che vengono poi intercettati,

che permettono alla singola cellula batterica di capire che in quell'ambiente ci sono altre cellule.

Generalmente è un sistema di comunicazione tra microrganismi della stessa specie ma anche di specie

diverse.

È un sistema di comunicazione ubiquitario.

Svolge un ruolo fondamentale in importanti processi biologici :

Sviluppo della competenza genetica (sintesi delle proteine per l'uptake del DNA esogeno →

• trasformazione)

Patogenesi (sintesi di proteine che favoriscono la patogenesi)

• Produzione di antibiotici

• Biofilm (sintesi dei polisaccaridi extracellulari.

QS (modello Gram -)

I Gram – producono in maniera costitutiva (sempre) delle molecole che prendono il nome di autoinduttori

(molecole segnale) : molecola chimica che viene generata nel citoplasma e secreta all'esterno.

Questa molecola può essere rilasciata nell'ambiente extracellulare ma anche rientrare nella cellula batterica.

Quando le cellule batteriche sono presenti in basso numero, queste molecole (autoinduttori) saranno molto

diluite.

Man mano che le cellule batteriche si moltiplicano, aumentando di numero, aumenterà anche la

concentrazione di autoinduttori che si trovano all'esterno e quindi rientrano nella cellula batterica.

Quando all'interno del citoplasma queste molecole segnale superano una certa concentrazione soglia, queste

interagiranno e si legheranno con proteine (attivatori trascrizionali).

Di solito l'interazione tra attivatore trascrizionale e autoinduttore determina il cambiamento di

conformazione dell'attivatore trascrizionale.

In virtù di questo cambiamento, l'attivatore trascrizionale dimerizza e va a legarsi alla sequenza operatore

del promotore di un gene bersaglio.

Di solito le sequenze operatore sono caratterizzate dalla presenza di sequenze palindromiche che vengono

riconosciute dal dimero.

È un fenomeno che avviene contemporaneamente in tutte le cellule batteriche presenti nella coltura.

QUINDI : il quorum sensing permette di regolare la trascrizione di una serie di geni in maniera dipendente

dalla concentrazione batterica.

! Molti patogeni producono per esempio adesine, tossine solo quando sono presenti in numero elevato.

Natura chimica dell'autoinduttore dei Gram -

Sono acil-omoserin-lattone (perché posseggono un omoserin lattone) e da un acido grasso a cui possono

essere legati eventuali sostituenti chimici.

La loro produzione è finalizzata esclusivamente alla funzione di molecola segnale per la comunicazione

intercellulare.

La porzione idrofobica è necessaria per facilitare la diffusione attraverso la membrana citoplasmatica.

Il gruppo lattonico è coinvolto nell'interazione con il regolatore della risposta.

QS (modello Gram+)

Il meccanismo di QS per i Gram + è leggermente diverso rispetto a quello di Gram +.

Gli autoinduttori possono essere dei:

g - butirrolattoni (streptomiceti).

• Peptidi di dimensioni variabili, chiamati feromoni (nella maggior parte dei Gram +).

• I feromoni sono sintetizzati come precursori che vengono poi modificati.

Questo è il locus del cromosoma di S. aureus in cui sono codificati i geni responsabili del meccanismo QS

denominato AgrD.

Ci sono 4 geni che servono per il processo di QS.

agrD codifica per una piccola proteina, che una volta prodotta viene processata in modo da rilasciare il

peptide. Il peptide va incontro poi a modificazioni post-traduzionali → si viene a creare un ponte tra la

cisteina e la metionina tramite un atomo di zolfo.

Una volta che il peptide è stato modificato, rappresenta l'autoinduttore che viene prodotto e modificato

all'interno della cellula batterica (citoplasma) e poi rilasciato all'esterno.

Man mano che aumenta la densità della popolazione batterica, aumenta la concentrazione di autoinduttore

nello spazio esterno (extracitoplasmatico).

Quando la concentrazione di autoinduttore presente nello spazio extracitoplasmatico supera una certa

concentrazione, si va a legare ad una proteina che è localizzata sulla membrana citoplasmatica del batterio

Gram+.

Questa proteina di membrana è una istidina chinasi (agrC), che in seguito a questa interazione si

autofosforila. Trasferisce poi il fosfato al regolatore della risposta (agrA) che è il fattore trascrizionale che va

ad attivare il gene bersaglio.

In S. aureus i geni bersaglio sono delle proteine (proteasi) che servono per idrolizzare la matrice

extracitoplasmatica sottostante al tessuto epiteliale. Creano un varco nel tessuto attraverso il quale il batterio

passa.

DIFFERENZA TRA IL QS NEI GRAM – E NEI GRAM +

Nel Gram – sono dei acil-omoserin-lattone che possono essere prodotti nel citoplasma, secreti

• all'esterno e poi rientrano.

In alcuni casi possono (Pseudomonas aeruginosa) essere secreti per gemmazione della membrana

esterna attraverso delle vescicole e rientrano per fusione di queste vescicole con membrana esterna.

Nei Gram + viene prodotto l'autoinduttore, viene modificato, fuoriesce attraverso un canale,

• localizzato nella parete formato da proteine agrD, rilasciato nello spazio extracitoplasmatico.

Quando supera una certa concentrazione interagisce con l'istinda china (agrC) che si autofosforila e

trasferisce il suo fosfato ad agrA (regolatore della risposta) che è un fattore trascrizionale che va ad

attivare l'espressione dei geni bersaglio.

BIOFILM

Il QS è un sistema attraverso cui le cellule batteriche possono comunicare tra di loro e capire quante cellule ci

sono nell'ambiente (meccanismi specie-specifici), ma i batteri possono essere anche di specie diverse

(meccanismi interspecie) → il che vuol dire che l'autoinduttore prodotto da una specie microbica può

interagire con il sensore o regolatore della risposta di un'altra specie microbica.

Nei biofilm possono capitare queste situazioni → che vanno per esempio a regolare la produzione di enzimi

idrolitici responsabili della degradazione della matrice extracitoplasmatica e quindi formazione di canali che

attraversano l'interno del biofilm e sono importanti perché permettono il passaggio di nutrienti anche negli

strati più profondi.

ESEMPI DI QS

Il sistema di QS è stato identificato per la prima volta nel batterio marino Vibrio fischeri (Gram - ) un

simbionte di un calamaro chiamato Euprymna scolopes.

Questo calamaro ha un organo (organo della luce). Il Vibrio fischeri colonizza questo organo della luce e

comincia a moltiplicarsi (contemporaneamente produce autoinduttore). Quando la concentrazione di

autoinduttore supera una certa soglia, l'autoinduttore entra nel citoplasma e determina la dimerizzazione di

luxR fattore trascrizionale che attiva la trascrizione di una serie di proteine (proteine responsabili della

bioluminescenza) che formano il complesso della luciferasi e quindi catalizzazione produzione di luce .

Qual è il vantaggio?

Si tratta di un batterio che va in giro di notte per procacciarsi il cibo. Soprattutto quando c'è la luna piena,

questo calamaro crea un'ombra che può attivare possibili predatori.

Grazie alla illuminazione creata da Vibrio fischeri camuffa l'ombra del calamaro e può spaventare i predatori.

Quindi è un sistema di simbiosi → il batterio ha il vantaggio di colonizzare un habitat in cui può trovare

nutrienti; per il calamaro il vantaggio è la protezione dall'azione di eventuali predatori.

Di giorno il calamaro espelle l'organo della luce, dormendo lo rigenera e quindi viene nuovamente

colonizzato dai batteri.

Un esempio di QS nei Gram + si trova in B. subtilis e va a regolare la competenza genetica per la

trasformazione.

La trasformazione è la capacità che i batteri hanno di internalizzare del DNA esogeno.

B. subitilis è uno di quei batteri che può catturare dall'ambiente esterno del DNA e introdurlo dentro di sé.

Lo stato fisiologico della competenza si ritrova in diverse specie microbiche:

In Haemophilus influenzae si sviluppa quando la cellula arresta la crescita.

• In N. gonorrhoeae la competenza è costitutiva → produce sempre tutte le proteine necessarie per

• legare e internalizzare il DNA esogeno.

In B. subtilis si sviluppa all'inizio della fase stazionaria e la maggiore % di trasformanti si genera dopo

• due ore.

In generale è uno stato fisiologico associato a condizioni di stress ambientale.

Modello dell'apparato proteico responsabile del legame e dell'internalizzazione del DNA esogeno (a

singolo filamento)

Rappresentazione schematica di un pezzo di superficie di N. gonorrhoeae.

Il DNA esogeno viene riconosciuto da una proteine che lo lega ma lega solo il DNA di N. gonorrhoeae perché

è caratterizzato dalla ripetizione di una sequenza nucleotidica specifica di 10-11 paia di basi ripetuta tante

volte nel genoma e che viene riconosciuta dalla proteina esposta sulla superficie della cellula batterica.

Questa sequenza viene detta sequenza dus (DNA uptake sequence) → è necessaria l'interazione tra la

sequenza e la proteina che è associata ad un canale che attraversa la membrana esterna consentendo il

passaggio del DNA esogeno.

Il DNA passa nello spazio periplasmatico trova una proteina ComE (che lega il DNA) e presenta il Dna a un

secondo canale ComA che attraversa la membrana citoplasmatica. Ci sono delle nucleasi che tagliano il DNA,

degradano un filamento e l'altro filamento entra nella cellula.

B. subtilis è in grado di introdurre qualsiasi tipo di DNA. C'è una struttura, pseudopilo che assomiglia ai pili

di tipo IV, che interagisce con il DNA. Il pilo si disassembla creando spazio e portando il DNA in prossimità

della membrana citoplasmatica in cui è presente ComeA che lega il DNA e lo presenta al canale ComeC

inserito nella membrana citoplasmatica. Qui c'è una nucleasi che taglia il DNA, uno dei due filamenti viene

degradato e l'altro entra dentro la cellula. In entrambi i modelli è coinvolto un

apparato denominato pseudopilo che ha

analogie strutturali con i pili di tipo IV.

Induzione dello stato fisiologico di competenza in B. subtilis (batterio naturalmente

trasformabile)

In B. subtilis l'induzione della competenza avviene mediante un processo di QS.

Le cellule cominciano a diventare naturalmente competenti per la trasformazione genetica in fase stazionaria

(quando c'è la maggiore densità di popolazione batterica).

Sono necessarie una serie di proteine codificate dai geni Com che codificano per l'apparato in grado di

legare e internalizzare il DNA.

Tutti questi geni sono sotto il controllo di uno stesso fattore trascrizionale → ComK. In assenza dello stato di

competenza ComK è degradato dal proteosoma (complesso proteico che serve per degradare le proteine).

La proteina MecA è un adattatore che serve per indirizzare ComK al proteasoma → ComK viene degradato

! In laboratorio questo stato viene indotto quando la coltura è

in fase stazionaria.

Il proteosoma di B. subtilis è costituito da due oligomeri (composti dalle proteine ClpC e ClpP) formano due

anelli che interagiscono l'uno con l'altro. La proteina da degradare viene portata in prossimità del

proteasomia da adattatori, in questo caso specifico da MecA, MecA lega ComK e la indirizza al proteasoma

dove verrà degradato.

La competenza di B. subtili s è indotta da quorum sensing

In laboratorio si sviluppa quando B. subtilis cresce in un terreno povero di nutrienti e quindi quando la

coltura entra in fase stazionaria: quello è il momento in cui c'è anche la maggiore densità di popolazione.

Per cui durante la crescita B. subtilis si moltiplica e secerne il feromone ComX all'esterno.

Man mano che la popolazione cellulare aumenta di densità, la concentrazione di ComX nel mezzo di coltura

aumenta. Quando supera una certa soglia interagisce con ComP (proteina di membrana) che è un istidina

chinasi che in seguito all'interazione con ComX si autofosforila e trasferisce poi il fosfato a un regolatore

della risposta che è un fattore trascrizionale che va ad attivare la trascrizione del gene ComS e avviene poi la

traduzione della proteina ComS.

ComS ha un'affinità per MecA (adattatore) maggiore rispetto a ComK.

Quindi ComS si lega a MecA e ComK viene rilasciato nel citoplasma. A questo punto è ComS che viene

degradata.

ComK essendo stato rilasciato è in grado di legarsi alle sequenze operatore localizzate nei promotori dei geni

Com (geni che codificano per le proteine responsabili dell'internalizzazione del DNA esogeno).

Qual è il vantaggio? Cioè che la cellula lo produca (ComK) sempre invece che produrla al momento? Perché

così la risposta è più veloce.

ComEC è una delle proteine,

prodotte dai geni Com che si inserisce nella membrana citoplasmatica per formare un canale (attraverso il

quale passerà il DNA)

Vicino a ComEC c'è ComEA proteina di membrana con un dominio transmembrana e un dominio

extracitoplasmatico che lega il DNA esogeno.

Lì vicino c'è una nucleasi (NucA)che taglia il DNA legato a ComEA, quindi si genera un'estremità libera che è

presentata al canale ComEC. Uno dei due filamenti viene degradato e l'altro filamento viene introdotto nel

citoplasma passando per ComEC.

Per tirare il DNA dentro la cellula è necessaria energia → la proteina ComEFA idrolizza ATP.

Una volta che il DNA è stato introdotto può essere fissato nel genoma mediante ricombinazione in

corrispondenza delle zone di omologia se si tratta del DNA della stessa specie.

Sono tutti geni (Com) che possiedono una stessa sequenza operatore che viene riconosciuta da ComK e

permette l'attivazione della trascrizione di quei geni.


PAGINE

137

PESO

13.31 MB

AUTORE

Olgap01

PUBBLICATO

6 mesi fa


DETTAGLI
Esame: MIcrobiologia
Corso di laurea: Corso di laurea in biologia
SSD:
Università: Padova - Unipd
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Olgap01 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di MIcrobiologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Padova - Unipd o del prof Provvedi Roberta.

Acquista con carta o conto PayPal

Scarica il file tutte le volte che vuoi

Paga con un conto PayPal per usufruire della garanzia Soddisfatto o rimborsato

Recensioni
Ti è piaciuto questo appunto? Valutalo!

Altri appunti di Corso di laurea in biologia

Appunti per l'esame di Fondamenti di Biologia
Appunto
Appunti sulla Cellula, Esame di Fondamenti di Biologia
Appunto
Appunti su Tessuti, Esame di Fondamenti di biologia
Appunto
Appunti esame Fisiologia generale
Appunto