Esame Anatomia patologica

Anatomia patologica

L'anatomia patologica è una disciplina che crea un ponte d'unione fra la medicina clinica e la scienza di base in quanto funzionalmente si colloca nell'ambito della medicina diagnostica di laboratorio e rappresenta una tappa fondamentale nella diagnostica clinica e nella preparazione del medico e del biotecnologo. Negli ultimi dieci anni si sono sviluppate diverse nuove metodiche e tecnologie in grado di effettuare una valutazione diagnostica e la formulazione della prognosi nei singoli pazienti. Quindi, si è sempre più affermato il concetto che il reperto morfologico debba essere integrato con il dato clinico ed interpretato su basi funzionali.

Principali attività del medico patologo

• Surgical pathology è l'analisi diagnostica effettuata su campioni chirurgici inviati dalle sale operatorie (solitamente si tratta di piccole biopsie); per evitare degli errori è necessario che il campione chirurgico sia etichettato, registrato con tutti i dati del paziente e preparato in seguito al prelievo. Ad esempio, in caso di neoplasia, è necessario, in seguito all'espianto del tumore, effettuare dei prelievi bioptici alla periferia della lesione per valutare l'estensione del tumore in modo che essi possano essere conservati all'interno di contenitori, fissati in formalina e poi inviati al patologo per l'osservazione al microscopio in modo da eseguire una diagnosi.

• Diagnosi estemporanea è la valutazione di una lesione al microscopio mentre il paziente è ancora sul tavolo operatorio, che permette di fornire delle informazioni sulla natura della malattia e sulla sua estensione in modo da programmare in maniera accurata l'intervento e di risparmiare al paziente delle amputazioni non necessarie. La diagnosi effettuata con questa metodica è generica. Questa analisi è condotta grazie all'utilizzo del criostato per eseguire delle sezioni del tessuto che successivamente sono colorate attraverso tecniche specifiche. Ad esempio, la colorazione con ematossilina-eosina è utilizzata per verificare se ai margini della lesione operatoria sono presenti dei residui tumorali oppure per classificare una neoplasia.

• Analisi citologica per valutare le alterazioni nucleari e citoplasmatiche presenti nelle singole cellule in modo da porle in relazione ai processi patologici presenti nel tessuto da cui esse derivano per eseguire una diagnosi definitiva. Questa è una tecnica semplice, rapida ed economica ed è utilizzata nello screening dei tumori, come il pap test per la diagnosi dei tumori della cervice uterina e gli agoaspirati per la diagnosi dei tumori della tiroide.

• Autopsia è l'attività di riscontro diagnostico con finalità anatomo-cliniche che è necessaria in caso di morte improvvisa (cadaveri senza assistenza medica trasportati in ospedale, decessi avvenuti in ospedali, case di cura, cliniche universitarie) oppure in caso di morte legale nell'ambito di una consulenza tecnica o una perizia per raccogliere e selezionare dei dati utilizzabili come prove in riferimento alle norme giuridiche o amministrative disattese. In questo caso è affidata al medico legale dell'autorità giudiziaria. Generalmente, le autopsie sono effettuate raramente in quanto attualmente le tecniche di imaging pre-operatorio permettono di eseguire diagnosi abbastanza accurate. Tuttavia, rimangono importanti nella definizione dei casi complessi e nel percorso formativo degli studenti di medicina. Possono essere eseguite su richiesta del medico curante quando sussiste il dubbio sulla causa di morte.

• Necroscopia consiste nell'osservazione del cadavere nel periodo compreso fra il decesso e l'inizio della decomposizione per constatarne la morte. Era molto utilizzata per la diagnosi delle morti apparenti dovute all'assunzione di alcuni farmaci.

• Trapianti, in particolare un collegio di medici (composto da un anatomopatologo, un anestesista ed un neurologo assistito da un tecnico di neurofisiologia) effettua una valutazione cerebrale ed anestesiologica del paziente in caso di morte cerebrale per capire se il paziente sia veramente morto e se l'attività dei possibili organi da donare sia stata compromessa. Ad esempio, non possono essere trapiantati organi affetti da un tumore.

• Creazione ed amministrazione delle banche dei tessuti.

• Accertamento della morte cerebrale.

All'interno dell'anatomia patologica si sono sviluppate delle branche autonome specialistiche come la cardiopatologia, la neuropatologia, l'emolinfopatologia, la dermatopatologia e la nefropatologia che hanno subito una profonda evoluzione e che richiedono l'utilizzo di metodiche aggiuntive e la formazione di patologi dedicati.

Diagnosi di morte

La diagnosi di morte deve essere eseguita attenendosi alle regole tecniche della semiotica tanatologica tenendo presenti le disposizioni di legge in materia di decessi. Questa tecnica può essere effettuata a scopo clinico quando il decesso è avvenuto in ospedale oppure nel proprio domicilio per terminare il trattamento terapeutico e le forme di assistenza clinica, per autorizzare il trasporto della salma alle sale mortuarie, per effettuare un riscontro diagnostico e per adottare eventuali provvedimenti igienici in caso di morte da malattia contagiosa (è competenza del medico curante). A scopo legale, serve per la denuncia al sindaco delle cause di morte e per la dichiarazione della morte all'ufficiale di stato civile in modo da registrare il decesso, autorizzare la sepoltura della salma e permettere l'esecuzione delle conseguenze giuridiche (successioni, trapasso di proprietà, modifica dello stato civile del coniuge e reversibilità o rendite ad aventi diritto). Oppure a scopo di trapianti in seguito all'accertamento della morte cardiaca e cerebrale per permettere il prelievo degli organi in tempo utile.

L'accertamento della morte cardiaca è effettuato tramite l'esame clinico diretto della rilevazione del silenzio ascoltatorio dei toni cardiaci, dell'assenza dei polsi arteriosi, dell'impossibilità di misurare la pressione arteriosa e dell'immobilità dell'ombra cardiaca alla scopia associata all'arresto della respirazione valutabile mediante l'immobilità del torace, il silenzio ascoltatorio e l'immobilità del diaframma alla radioscopia. Inoltre, tale accertamento può essere eseguito anche mediante l'ausilio strumentale dell'elettrocardiogramma che deve persistere isoelettrico per almeno 20 minuti e mantenersi tale anche dopo la stimolazione meccanica o farmacologica del cuore. Questo rappresenta un metodo estremamente affidabile per la diagnosi di morte in fase precoce e viene definito elettrotanatogramma.

Nota bene: il metodo elettrocardiografico è sufficiente per la diagnosi di morte nei casi ordinari della pratica clinica in quanto un arresto cardiaco della durata di 20 minuti garantisce la morte del tessuto nervoso per anossia. Non è invece sufficiente da solo per procedere ad un trapianto.

La morte cerebrale rappresenta l'arresto totale e definitivo dell'attività cerebrale con sopravvivenza delle funzioni vegetative condizionata dalle manovre di rianimazione, determinata dalla necrosi massiva dell'encefalo in seguito a lesioni primitive dovute a traumi cranio-cerebrali, ad emorragie ed a tumori cerebrali. In particolare, in seguito alla morte dell'intero tessuto cerebrale (compresi i centri bulbari), si verifica la cessazione della respirazione spontanea ed il silenzio assoluto dell'attività elettrica cerebrale, mentre si mantiene spontaneamente solo l'attività cardiaca. Questa condizione di morte "dissociata" è resa possibile dalle tecniche rianimatorie che consentono ai soggetti in pieno coma depassé (caratterizzato dall'assenza di attività vegetativa) di esplicare a tempo indefinito le proprie funzioni vegetative come il mantenimento del colorito, del polso, della temperatura corporea, del metabolismo, della digestione e della diuresi fisiologici.

Le regole tecniche che permettono di valutare una morte cerebrale sono l'accertamento di uno stato di coma profondo accompagnato da atonia muscolare, areflessia tendinea dei muscoli scheletrici innervati dai nervi cranici, indifferenza dei riflessi plantari e da midriasi paralitica con assenza del riflesso corneale e del riflesso pupillare alla luce, l'assenza della respirazione spontanea dopo una sospensione di 2 minuti di quella artificiale, l'assenza di attività elettrica cerebrale spontanea e provocata dal dolore, dalla luce lampeggiante, dal rumore e da sostanze convulsivanti (EEG piatto). Inoltre, le condizioni che garantiscono la realtà della morte cerebrale ed escludono i temporanei arresti dell'attività encefalo-elettrica sono:

• Carattere primitivo della lesione cerebrale (esclusione delle lesioni secondarie da barbiturici o da monossido di carbonio in cui è difficile il controllo dell'irreversibilità del danno nervoso).
• Assenza e mancata persistenza di segni clinici ed elettrici per un periodo di almeno 6 ore in cui il medico esegue dei controlli neurologici e del silenzio respiratorio ad intervalli regolari non superiori ad un'ora ed un elettroencefalogramma per periodi di 30 minuti a distanza di 3 ore.
• Assenza di effetti dovuti alla somministrazione di farmaci depressivi del sistema nervoso centrale o all'ipotermia indotta artificialmente.
• Presenza di una pressione arteriosa non inferiore a 100 mmHg.

Nota bene: l'ora del decesso del paziente in caso di morte cerebrale è quella all'inizio del periodo delle 6 ore di valutazione.

La citopatologia

La citopatologia studia le alterazioni nucleari e citoplasmatiche presenti nelle singole cellule in modo da porle in relazione ai processi patologici presenti nel tessuto da cui esse derivano. Le principali metodiche di prelievo delle cellule da un tessuto sono:

• L'esfoliazione naturale, con cui è possibile analizzare le cellule presenti nella saliva e nelle secrezioni cervico-vaginali.
• La spazzolatura, in cui è possibile analizzare le cellule recuperate per strofinamento o mediante lavaggio delle mucose bronchiali, esofago-gastrointestinali e cervicali. Solitamente, i reperti da spazzolatura sono più ricchi in cellule.
• La citocentrifugazione o centrifugazione su gradiente, in cui sono analizzate le cellule presenti nei liquidi fisiologici (liquor cefalo-rachidiano, urine, essudati pleurici, pericardici ed effusioni peritoneali).
• L'agoaspirato con ago sottile, in cui le cellule sono aspirate da lesioni superficiali (mammella, ghiandole salivari, tiroide e linfonodi) oppure da lesioni profonde previo controllo ecoguidato (polmone, rene, fegato e pancreas).

Nota bene: la tecnica dell'agoaspirato permette di ottenere microscopici frustoli di tessuto utilizzabili nella valutazione della citologia e dell'architettura istologica, ponendosi come una tecnica a ponte tra la citologia classica e l'istopatologia.

In seguito al recupero delle cellule è necessario allestire un vetrino mediante il metodo di Papanicolau, in cui i prelievi sono strisciati su un vetrino porta-oggetto, fissati entro 10 minuti con alcool al 95% o con un'analoga soluzione fissativa e poi colorati con ematossilina (evidenzia i nuclei in blu), Orange G (evidenzia il citoplasma ricco di citocheratina in arancione) e con una miscela di eosina e verde luce (evidenzia il citoplasma acidofilo con sfumature giallo-rosa ed il citoplasma basofilo con sfumature dal blu pallido al blu-verde), oppure mediante il metodo di Wright-Giemsa, in cui le cellule sono strisciate su un vetrino, lasciate essiccare all'aria e colorate con la colorazione Diff-Quick a base di eosina e tiazina (permette una maggiore rapidità).

In un esame citologico è necessario valutare l'adeguatezza del prelievo (presenza di cellule e mantenimento delle caratteristiche citologiche), contare le cellule presenti, valutare la presenza di detriti, di materiale ematico, di materiale necrotico e di cellule infiammatorie ed infine analizzare le caratteristiche nucleari (forniscono un parametro fondamentale per la distinzione fra cellule benigne e cellule maligne) e le caratteristiche citoplasmatiche (forniscono informazioni sulla maturazione e sulla differenziazione) delle cellule presenti, quali la forma del nucleo ed il rapporto nucleo/citoplasma. In base alle caratteristiche citologiche principali, le cellule possono essere classificate in normali, reattive, degenerate, displastiche (sono cellule in graduale transizione dallo stato normale a quello neoplastico) e cellule neoplastiche (sono cellule frequentemente aggregate in piani sovrapposti con spiccato pleiomorfismo, con atipie nucleari, con presenza di numerose mitosi, con nucleoli prominenti e angolati, con un rapporto nucleo/citoplasma molto elevato, con frammentazione citoplasmatica e con una differenziazione anormale del citoplasma).

Nota bene: per definire correttamente la natura neoplastica è necessario che coesistano più dettagli citologici contemporaneamente.

L'istopatologia

Il tessuto che arriva al laboratorio di anatomia patologica è accompagnato da una richiesta che indica l'anagrafica del paziente, la sua storia clinica, il suo sospetto clinico, la sede di origine del tessuto ed il nome dell'istituzione e del medico inviante in modo che ad esso possa essere attribuito un numero identificativo (computerizzazione dell'anagrafica del paziente) per rendere possibile in ciascuna fase la rintracciabilità del tessuto e dell'operatore che ha eseguito o concorso ad eseguire ogni fase. La prima analisi eseguita all'interno del laboratorio è un esame macroscopico che consiste in una descrizione accurata del tessuto per quanto riguarda il colore, la presenza di coaguli o di emorragie, della durezza del campione per l'eventuale presenza di calcificazioni, le dimensioni del campione e la presenza di una capsula fibrosa (evidenziabile con inchiostro di china). In seguito, dal tessuto sono prelevate delle aree significative che devono essere poste in cellette di plastica contenenti una sostanza fissativa. In particolare, la fase di allestimento del campione prevede:

• Fissazione del tessuto in modo da arrestare immediatamente i fenomeni vitali e mantenerli inalterati durante le successive fasi di processazione. Questa è una fase critica dell'allestimento dei preparati in quanto un tessuto fissato o processato in maniera non adeguata presenta un'enorme varietà di artefatti che ne limitano l'interpretazione microscopica oppure causa la distruzione della struttura istologica o la rende irriconoscibile. Il principale agente fissativo utilizzato è la formaldeide, un gas incolore molto solubile in acqua che è commercializzato come formalina, cioè una soluzione acquosa di formaldeide in concentrazione 40%. La forma aldeidica agisce lentamente, le sue soluzioni acide o troppo concentrate possono causare interferenze con le strutture istologiche e comportare danni alla morfologia del tessuto. Il fissativo più utilizzato è la formalina di Policard, una soluzione al 10% con l'aggiunta di una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%.

  Nota bene: oggigiorno, si tende a ridurre l'utilizzo della formalina con altri fissativi in quanto è stato scoperto essere cancerogena. Per l'uso in microscopia è necessario che la formalina sia fresca, che abbia una concentrazione compresa fra il 4% ed il 10% e che sia tamponata a pH 7.0-7.6.

• Risciacquo vigoroso del tessuto in acqua per eliminare l'eccesso di fissativo che potrebbe causare artefatti di colorazione.

• Disidratazione del tessuto attraverso il passaggio in una serie di alcool a concentrazione progressivamente crescente (dal 25% al 100%) per tempi di permanenza variabili da 15 minuti ad un'ora a seconda delle dimensioni del campione.

• Chiarificazione del tessuto in un liquido diafanizzante solubile nel mezzo di inclusione. Le principali sostanze utilizzate in questa fase sono lo xilene (utilizzato per le procedure di routine) ed altri prodotti di origine naturale costituiti da miscele di solventi clorurati stabilizzati.

  Nota bene: le miscele di solventi clorurati stabilizzati non sono tossiche, sono poco volatili, ininfiammabili e prive dell'odore pungente caratteristico dei solventi aromatici.

• Infiltrazione del tessuto che consiste nella permanenza del campione chiarificato all'interno di un mezzo di inclusione fuso per un periodo sufficientemente lungo per consentirne la penetrazione negli interstizi più profondi. Il principale mezzo di inclusione è la paraffina, una miscela di idrocarburi alifatici molto maneggevole ed economica. Successivamente, il mezzo di inclusione è sostituito da concentrazioni crescenti di alcool ed infine da agenti diafanizzanti in modo da trasformare i tessuti in una massa omogenea in modo che non incontri differenze di consistenza durante la fase di taglio.

• Taglio al microtomo (a slitta o a rotazione) per ottenere delle sezioni con uno spessore di 2-7 μm che sono raccolte su un vetrino portaoggetti e fatte essiccare mediante incubazione per una notte a 37°C oppure per un'ora a 60°C in modo che possano essere conservate a temperatura ambiente.

• Deparaffinazione e reidratazione dei preparati inclusi attraverso delle immersioni sequenziali dalla durata di 2-5 minuti ciascuna in solventi organici capaci di sciogliere la paraffina e di reidratare progressivamente le sezioni di tessuto (in quanto i principali coloranti utilizzati sono a base acquosa).

• Colorazione della sezione con tecniche particolari e specifiche; la colorazione istopatologica più utilizzata è la colorazione ematossilina-eosina, che consente di evidenziare la maggior parte delle strutture tissutali. In particolare, l'ematossilina è un colorante basico che colora in blu i nuclei, mentre l'eosina è un colorante acido che colora in rosa il citoplasma.