Enzimologia - riassunto lezioni

ENZIMI REDOXdeidrogenasi a NADH e NADPH

Quelli che fanno il 90% delle trasformazioni, la cui limitazione è il costo dei cofattori (1g NAD ridotto costa 250 euro e se voglio fare una mole di etanolo da acetaldeide mi serve una mole di NAD che sono quasi 660g). Devo trovare un sistema per rigenerare i cofattori nel processo e sono solitamente due:

1. Accoppiamento di più reazioni enzimatiche
2. Accoppio una reazione enzimatica che riduce il NADH o NADPH usato.

Rigenerazione elettrochimica: gli elettroni per la riduzione avviene dalla corrente anziché da un enzima. La riduzione di cofattori pirimidinici è problematica perché gli elettroni arrivano uno alla volta e la reazione più probabile è che il radicale che si forma reagisca con se stesso e dimerizzi. L'obiettivo è enzimi con substrati a basso costo. FDH necessita come agente rigenerante la CO2 che evapora dal sistema. GLDH è l'unico che funziona sia con NADH che con NADPH.

e il sistema di rigenerazione, come anche il substrato, non costa tanto, ma ha bassa attività. Sono comunque tutti enzimi costosi, intracellulari e quindi usati immobilizzati in sistemi multifasici (posso spostare l'equilibrio ragionando sulla diversa solubilità in sistemi micellari, emulsioni...). Anche in questo caso la presenza di acqua in quantità adeguata rappresenta un fattore critico per mantenere la struttura dell'enzima e, pertanto, la sua funzionalità. - ossidasi: enzimi attivati dalla presenza di ossigeno, divise in ossidasi che liberano acqua ossigenata, diossigenasi che legano i due atomi di ossigeno e mono-ossigenasi che legano uno dei due atomi di ossigeno e l'altro lo usano per liberare una molecola di acqua. Distinguiamo: - laccasi: sono ossidasi a rame interessanti per la produzione e conservazione del vino e del tè istantaneo in cui devo impedire la formazione di composti insolubili in granelli attraverso stabilizzazione.elimina le sostanze che potrebbero polimerizzare. - tirosinasi, che sono ossidasi a ferro non-eme - glucoso-ossidasi che sono flavin-ossidasi - cyt-P450 che sono mono-ossigenasi ad eme di rilevanza fisiologica e farmacologica - xantina-ossidasi è molto complessa e ricca di cofattori, coinvolta nell'escrezione delle purine e svolge azione anti-microbica per la produzione di acqua ossigenata nei globuli di grasso del latte. Dal monofenolo ottengo difenolo e poi i chinoni, che sono molto reattivi e sono responsabili dell'annerimento di certi alimenti. Sono enzimi che possono guastare in negativo l'alimento e possono evitarlo: - fermando la reazione - ossidasi che agiscono sui fenoli sono quelle a metalli e quindi se uso chelanti (forte come EDTA o naturale come acido citrico) che sottraggono il metallo (es. rame) evito l'azione dell'enzima. - prendendo gli intermedi delle prime fasi della reazione e li trasformo in qualcosa d'altro. - L'acqua ossigenata

è utile anche per formare legami disolfuro, utili per modificare ad esempio la tenacità di una farina, senza aggiungere fisicamente nulla.

13. SVILUPPO DI UN KIT ENZIMATICO

IL CASO DEL METANOLO

A partire dal 1985 il metanolo venne usato in vino ad uso domestico e quindi a contatto con persona, portando anche a cecità.

Per il controllo era necessario un controllo diretto, effettuabile anche da personale non specializzato, come un controllo enzimatico.

Difficoltà intrinseche erano: variabilità del materiale da analizzare, quantità ignota dell’analita, rapporto analita/interferenti variabile, conservazione e stabilità del prodotto e contenimento dei costi.

Il limite legale è 158,4 mg/L per i vini bianchi (0,2 ml per 100 ml di alcool) e 198 mg/L per i vini rossi (0.25 ml per 100 ml di alcool), quindi un tipico vino al 12% di alcool etilico (2,6 M EtOH) contiene al massimo 6 mM di metanolo.

Nei distillati il limite inferiore è ad 1 g

su 100 mL di alcol anidro, quindi una grappa al 40% di alcol (circa 9M EtOH)contiene max 4 g/L metanolo (circa 125 mM MeOH)Per la sua quantificazione si utilizza la conversione da metanolo a formaldeide, poi formiato e CO2 in presenza diNADH a dare colorazione dark blue alla soluzione, attraverso la formazione di tetrazani.Alcool deidrogenasi Converte etanolo + NAD+ in acetaldeide + NADH + H+ CH3CH2OH + NAD+ -> CH3CHO + NADH + H+ Disponibile a basso costo da molti microrganismi è caratterizzata da elevata attività. Km values: MeOH 5 mM, EtOH 1 mM. Problema: le alcool deidrogenasi hanno problema di affinità, ossia sono 5 volte più affini per l'etanolo che per il metanolo (si vede dalla km) e quindi non posso usare questo enzima in un vino perché lavorerebbe solo sull'etanolo. Metanolo ossidasi Converte il metanolo + ossigeno + acqua in formaldeide + acqua ossigenata CH3OH + O2 + H2O -> HCHO + H2O2 Flavoproteina da

lieviti metilotrofi (candida spp) caratterizzata da bassa attività. Km values: MeOH 0,1 mM e EtOH 1 M

Acqua ossigenata troppo poca per utilizzo diretto e quindi va eliminata con catalasi. Questo enzima è estremamente affine per il metanolo, ma l'acqua ossigenata non è sufficiente per avere una colorazione utile, quindi anche questa non può essere utilizzata.

Formaldeide deidrogenasi

Converte formaldeide + NAD+ in formiato e NADH+

HCHO+ NAD+ H 2 O→ HCOO+ NADH H

È un enzima fungino costoso, con elevata attività. Km: HCOH 0,002 mM

Utilizzata con la metanolo-ossidasi, dopo l'eliminazione dell'acqua ossigenata con catalasi.

Lipoato deidrogenasi (diaforasi)

Converte il NADH con il tetrazolo in NAD+ + tetrazani colorati, ossia è quella che permette di ottenere la colorazione.

Flavoproteina da mitocondri di cuore bovino ad elevatissima attività. Km: NADH 0,005 mM, NBT 2nM (da solo), PMS (fenazina metasolfato che

aiuta la reazione) 0,1 mMOTTIMIZZAZIONE CONDIZIONI DI REAZIONE

Operazioni preliminare

• Diluizione e decolorazione del campione (decolorazione con filtrazione su carbone attivo)

Set up operativo

• Definire le concentrazioni ottimali di ciascun enzima (metanolo ossidasi, formaldeide dh, catalasi, lipoatodh) e substrato (metanolo, NAD+ TB e PMS)

Per misurare la quantità ottimale di lipoato dh misuro la formazione di formazano a 650nm

Per misurare la quantità di formaldeide dh misuro la quantità di NADH formata a 340nm

PREPARAZIONE DEL KIT

Nel processo di liofilizzazione della miscela è diventato tutto blu.

Provando a liofilizzare a parte si capisce che nel kit, avendo due enzimi flavinici, con flavina nella forma ossidata (laquale ossida il substrato per ridursi e poi viene riossidata dall’ossigeno).

La ri-ossidazione della flavina può avvenire con ossigeno a formare acqua ossigenata, oppure l’ossigeno prende unsolo elettrone, a formare anione superossido.

Il quale può comportarsi sia da ossidante che da riducente, andando a ridurre il composto NBT che dà il colore alla miscela. Per risolvere si mette un enzima in grado di rimuovere il superossido, ossia la super-ossido-dismutasi che trasforma l'anione superossido in acqua ossigenata e ossigeno.

KIT FINALE operazioni:

• Soluzione di riferimento (standard) con 0,01% di metanolo ricostituzioni degli enzimi con acqua
• Una fiala con enzimi metanolo ossidasi, formaldeide dh e diaforasi filtrare su carbone attivo per rimuovere il colore
• Altra fiala con NAD+, PMS, NBT, catalasi, super-ossido-dismutasi aggiungere i reagenti
• Pipette di plastica e contenitori di plastica comparare la colorazione con lo standard

PROVE DI MERCATO

Prove di attività, di inattivazione, resistenza alle Temperature ecc. - Pro

Nel frattempo era uscito due kit di un'azienda concorrente, uno che dava colorazione giallo debolissimo e l'altro che funzionava bene ma necessitava di un passaggio di

distillazione per separare dal vino il metanolo (ildistillatore era nel kit).- ControPrimo problema è la brevettabilità del kit che funzionava meglio. La legge europea impedisce la brevettabilità di enzimi e quindi i brevetti coprono solo i passaggi per l'ottenimento del kit finale. È brevettabile solo quello che ha uno scopo fisico (nel caso del kit il pezzo di cartoncino che teneva alto il filtro con carboni attivi).Altro problema è trovare i canali per vendere i kit: le farmacie o i consorzi agrari.I consorzi non prevedevano la conservazione in frigorifero e le farmacie volevano un profitto del 1000% nel senso che ricaricavano troppo il costo del prodotto, oppure ricaricavano meno, ma a patto di avere l'esclusiva per la vendita.Nel 1986 è stata imposta una tassa sul metanolo e quindi il kit non ha mai lasciato il laboratorio.

14. IMMOBILIZZAZIONE DI PROTEINE ANTIMICROBICHE

Sono divisi in due famiglie:

batteriocine:

tossine

Le proteine antibatteriche che impediscono la crescita dei competitori, di solito sono quelle senza attività enzimatica. Normalmente attaccano il legame N-acetil-muramato e N-acetil-d-glucosammina dei residui del peptidoglicano nella parete dei microrganismi.

MODALITÀ DI AZIONE

Formazione di pori attraverso la membrana: la formazione di questi pori determina la dissipazione del potenziale di membrana, e il microrganismo non è più in grado di sfruttarlo per provvedere a procedimenti metabolici indispensabili. La dissipazione del potenziale di membrana è misurata con sonde chimiche come carboxyfluorescin diacetate succinimidyl ester.

Penetrazione e legame con molecole intercellulari: attacco del peptidoglicano nella parete cellulare. Questi peptidi in generale sono molto basici (a pH cellulare sono carichi positivamente) e molto idrofobici quindi si dispongono nella membrana, formando dei buchi con la parete tra cui possono passare protoni o altre sostanze.

molecole.

SACCACINA (peptide antimicrobico ad azione mista)

Alcune proteine hanno sia attività di lisi (quella enzimatica) sia la capacità di formare i pori che dissipano il potenziale a cavallo della membrana, indispensabile per il funzionamento del batterio.
Uno è la saccacina, ma sono tutte comunque piccole e stabili.
Sono interessanti perché in grado di uccidere la lysteria monocytogenes, contaminante alimentare grave.
La saccacina si mangia i componenti del peptidoglicano della parete e forma pori sulla parete del batterio e me ne accorgo misurando il rilascio dei singoli componenti (rottura dei legami glucosidici dell'n-acetil muramico e n-acetilglucosammina del peptidoglicano).
Saccacina spacca le pareti e buca le membrane, ma costa di più perché il microrganismo che la fa (lactobacillu