Enzimologia - riassunto lezioni

Enzimologia

Catalisi enzimatica

Termodinamica: Un enzima non sposta l'equilibrio di una reazione, ma abbrevia il tempo in cui la reazione avviene, senza provocare trasformazioni che non sarebbero accadute in sua assenza. Data una costante di equilibrio K, la resa teorica (massima) di una reazione monomolecolare vale sempre:

eq( )K eq resa = moli S * 1 + K

L'equilibrio di una reazione può essere modificato solo intervenendo su parametri che influenzano la stabilità termodinamica di reagenti e prodotto, o la loro concentrazione. Ad esempio, la resa di conversione di glucosio in fruttosio varia in base alla T.

Cinetica: La velocità di una reazione si misura in quantità di prodotto formato in unità di tempo. In una reazione di conversione, la velocità è condizionata dalla costante di velocità e dalla concentrazione dei reagenti. A parità di concentrazione iniziale di reagenti, la velocità è solo funzione della costante di velocità, la quale aumenta per la presenza dell'enzima, il quale diminuisce l'energia di attivazione.

Significato e misura dell'attività enzimatica

Misura della velocità di una reazione:

• Misurare la quantità di prodotto formato nell'unità di tempo = Δv P/Δt.
• Misurare la quantità di substrato scomparso nell'unità di tempo = -Δv S/Δt.

Quando possibile, misuro la velocità iniziale, prima che vi siano variazioni apprezzabili dalla linearità, ossia cerco di ottenere la tangente alle curve cinetiche.

Misure continue

Colorimetrici (con substrati naturali o sintetici):

La scomparsa o l'aumento di assorbanza può essere seguito in continuo dal momento di aggiunta dell'enzima attraverso spettrofotometri, preferibilmente a doppio raggio, collegati con registratori potenziometrici.

Vantaggi:

• Non richiede prelievi, né l'arresto della reazione.
• Si presta alla quantificazione di processi catalitici rapidi, riducendo a zero l'errore manuale.

Variazione di pH: Le reazioni enzimatiche portano al rilascio di acidi o di basi, che se ne può monitorare il decorso misurando la variazione di pH e paragonando la variazione indotta dall'enzima con quella conseguente all'aggiunta di una quantità nota di acido o base, che funge da "standard interno" per i successivi calcoli. Vantaggio è l'utilizzo anche su sospensioni ricche in solidi o su emulsioni, dove non si possono usare metodi spettrofotometrici. La velocità di idrolisi è espressa in moli di H⁺ prodotti nell'unità di tempo e viene quantificata utilizzando una proporzione con l'aumento di pH conseguente all'aggiunta di una quantità nota di una base forte.

Elettrochimica: Scomparsa di ossigeno con elettrodo di Clark. L'elettrodo di vetro del pH-metro è un sensore potenziometrico che misura una tensione. L'elettrodo di Clark è invece un sensore amperometrico, che misura la corrente generata dalla reazione dell'ossigeno sulla superficie dell'elettrodo e quindi la sua concentrazione. Un esempio nel controllo della glicemia, la reazione è catalizzata dalla glucosio-ossidasi, che consuma una mole di ossigeno per mole di glucosio. L'enzima è messo in un sottile gel tra due membrane semipermeabili, sopra un elettrodo di oro platinato. Glucosio e ossigeno diffondono nel gel e l'ossigeno viene consumato proporzionalmente alla quantità di glucosio. La scomparsa di ossigeno viene misurata dall'elettrodo e il software nel sensore dà il valore della glicemia.

Accoppiando reazioni enzimatiche: Si accoppia la reazione enzimatica di interesse con altri enzimi o loro substrati, che trasformano i prodotti della reazione in composti misurabili. Ad esempio, l'enzima β-galattosidasi converte il lattosio in galattosio e glucosio, ma la reazione non produce materiale facilmente individuabile, utilizzo quindi una esochinasi + ATP per formare glucosio-6P + ADP e poi utilizzo glucosio-6P-deidrogenasi con NADP a formare 6P-gluconato + NADPH + H⁺. È necessario che enzimi e substrati siano presenti in quantità sufficienti e la velocità con cui aumenta l'assorbanza per formazione di NADPH è proporzionale all'attività della β-galattosidasi.

Tornando all'enzima glucosio-ossidasi, possono misurare l'acqua ossigenata prodotta dall'enzima ricorrendo ad enzimi accoppiati, per valutare la glicemia. L'enzima perossidasi usa l'acqua ossigenata per ossidare il luminol in una reazione che porta all'emissione di luce, la quale viene tradotta in un segnale letto sullo strumento o inviato allo smartphone. È necessario sostituire il bio-sensore ad ogni misura.

Misure discontinue (stop and sample)

• Prelevo n aliquote dalla miscela di incubazione a tempi definiti dal momento dell'aggiunta di enzima.
• Blocco la reazione a tempi diversi per ogni aliquota, mediante inattivazione dell'enzima.
• Misuro la quantità di prodotto formato per ogni aliquota.

La quantità formata e/o consumata si potrebbe determinare in funzione della carica, mediante HPLC o per TLC (cromatografia su strato sottile).

Svantaggi:

• La quantificazione è laboriosa.
• Ci possono essere errori di manualità.
• Richiede notevoli quantità di campione.
• Si presta poco a studi cinetici in quanto troppo laborioso e soggetto ad errori.

Esempi di misura di attività proteolitica

• Peptidi o aa rilasciati: Misuro l'aumento di amminogruppi reattivi presenti in soluzione.
• Insolubilizzazione proteine intatte: Precipitando con agenti (es. acido tricoloacetico) le proteine intatte, mentre i peptidi rimangono in soluzione e danno assorbimento UV.
• Proteine marcate: Proteine a cui è stato legato covalentemente un colorante e trattate in modo da essere insolubili. Le proteasi staccano peptidi insolubili con il colorante attaccato e si misura la quantità di colore presente in soluzione.

Turnover number, TN prodotto/(moli enzima)*(1/tempo)

Legge di Lambert-Beer: A = εcL

Dove:

• A = assorbanza
• C = concentrazione sostanza mg/ml
• ε = coefficiente di estinzione molare ml/(mg*cm)
• L = larghezza cuvetta (1cm)

Misura della quantità di substrato tramite reazioni enzimatiche

Si avvale della capacità degli enzimi di riconoscere il substrato: azione specifica e regolabile

• Selettività di azione:
• Selettività di posizione di reazione: I gruppi chimici del sito attivo agiscono solo su gruppi del substrato a diretto contatto con essi.

Stereoselettività: L'enzima lega solo un solo stereoisomero. Ad esempio, glucosio e galattosio sono indistinguibili dal punto di vista della reattività chimica, ma l'enzima gluc-ossidasi attacca solo il glucosio.

• Selettività di substrato: L'enzima agisce solo su quel composto che ha i requisiti strutturali idonei a legarsi con il sito attivo dell'enzima.
• Regioselettività: Un enzima attacca in una posizione specifica del substrato. Ad esempio, un esochinasi e glucochinasi attaccano un fosfato all'ossidrile in posizione 6 dei glucidi, ma non quelli in 2, 3, 4 (quello in 1 è un ossidrile alcolico).
• Selettività di reazione: I gruppi chimici presenti nel sito attivo, in base alla loro struttura e posizione, possono facilitare solo un particolare tipo di reazione. Ad esempio, un enzima che catalizza un'idrolisi non potrà catalizzare un'ossidoriduzione o una isomerizzazione ecc.

Gli enzimi e i cofattori per questa analisi sono sempre forniti in un unico corredo, che costituisce un kit enzimatico.

Esempio: Test di misurazione glucosio / fruttosio / saccarosio. È un dosaggio sequenziale che permette di valutare la natura degli zuccheri in un sistema complesso, come un succo di frutta. Richiede: β-Fruttosidasi, Esochinasi (HK), Fosfoglucosio Isomerasi (PGI) e Glucosio-6-Fosfato Deidrogenasi (G6PDH). Il NADPH prodotto dall'azione di G6PDH viene misurato a 340 nm.

1. L'esochinasi fosforila sia il glucosio che il fruttosio presenti a dare glu-6P e fruttosio-6P.
2. La glucosio-6P-dh ossida il glucosio-6P a dare gluconato-6P e NADPH, con aumento di assorbanza, che indica la quantità di glucosio.
3. Aggiungo la fosfo-gluco-isomerasi, la quale converte il fruttosio-6P in glucosio-6P.
4. Ora la glucosio-6P-dh già presente produce altro gluconato e NADPH, con aumento di assorbanza che indica la quantità di fruttosio.
5. Aggiungo la β-fruttosidasi che mi converte il saccarosio in d-glucosio e d-fruttosio.
6. L'enzima esochinasi già presente converte il glucosio e fruttosio in glucosio-6P e fruttosio-6P.
7. La fosfo-frutto-isomerasi converte il fruttosio-6P in glucosio-6P.
8. La glucosio-6P-dh converte tutto il glucosio in gluconato e NADPH, con aumento dell'assorbanza che indica il doppio del saccarosio.

Il formalismo di Michaelis-Menten e il suo significato

Assumendo che la dissociazione del prodotto abbia Keq molto grande e che la concentrazione di enzima sia trascurabile rispetto alla concentrazione di substrato, le velocità della reazione dipendono dal turnover number (moli prodotto/moli enzima)*(1/tempo) e dalla concentrazione di ES (specie cataliticamente attiva).

La formazione di ES è espressa dalla costante di dissociazione:

[ ] [ ] [ ]= + =[ /[S ])Etot ES E ES](1+ Kd

Relazione di Michaelis-Menten:

[ES ]/[ ]=1/(1+ /[ ]/([S]+Etot Kd S])=[S Kd)

Da cui, se Etot=ES allora l'enzima lavora al massimo della velocità (Vmax).

La velocità effettiva sarà pari al rapporto per il turnover number:

( ) ( )[ ] [ ] [ ] [ ]( ) ( )=Etot∗TN ∗ / + =Vmax∗ / +V S S Kd S S Kd

La concentrazione di substrato a cui la velocità della reazione è metà di quella massima (Km, per ciascuna concentrazione di E) è sempre la stessa. L'integrazione indefinita dell'equazione di Michaelis-Menten:

[ ][ ]= /X P S, supponendo 0

( )[ ] [ ]∗TNt∗ E Km∗ So[ ] ( )= ∗ ∗ln +[S X−K 1−x →V t=2,3 log P]0 m max [ ]V Ss

La formula non considera i fattori termodinamici, ma ci permette di calcolare, per esempio, la quantità di enzima E, necessaria per arrivare in un certo t alla conversione X (=P/So) desiderata, conoscendo il valore Km, la concentrazione di substrato iniziale So e la capacità catalitica dell'enzima TN, in un volume Vs.

Fattori che influenzano l'attività enzimatica:

• Concentrazione S
• Presenza di inibitori e/o
• pH (attività e stabilità)
• Forza ionica (e tipo di Sali)
• Affettori - Temperatura

Per tutti occorre distinguere gli effetti: reversibili (facilmente/difficilmente), influenzano solo attività, irreversibili (causano inattivazione).

Linearizzazione dell'equazione di MeM:

1. Grafico dei doppi reciproci: Km * 11 Vmax 1 = mx + q = + Y → v Vmax[S]
2. Grafico [S]/v vs [S]: [ ]S 1 Km[ ]= ∗ + Sv Vmax Vmax
3. Grafico v vs v/[S]: -Km∗v= +v Vmax. [ ]S

Inibizione enzimatica: tipologia e significati pratici, effetti del pH e della forza ionica

Inibitori competitivi: L'inibitore si lega all'enzima, formando un complesso inattivo [EI], in competizione con ES. Assumendo Ki come costante di dissociazione di EI, in presenza di un inibitore competitivo Km aumenta di un valore pari a (1+([I]/Ki)). Questo tipo di inibizione è meno sensibile quando si è in presenza di alte concentrazioni di substrato.

]Vmax[S=v ( )[ ]I +[Km 1+ S]Ki

Inibitori acompetitivi: L'inibitore si lega dopo che l'enzima ha legato il suo substrato, in un sito diverso dal sito catalitico, formando un complesso inattivo ESI. L'inibitore può essere diverso dal substrato (a differenza di quelli competitivi). Si traduce nella simultanea diminuzione di Km e Vmax, che diminuiscono di un valore pari a (1+([I]/Ki)). La formazione del complesso ESI sposta verso destra l'equilibrio di formazione di ES e l'effetto di inibizione è più facilmente avvertibile ad alte concentrazioni di substrato.

[S]Vmax=v ( ) ( )[ ] [ ]I I+[Km 1+ S] 1+Ki Ki

Inibitori non competitivi: L'inibitore si lega ad un sito indipendente da quello cui si lega il substrato, diminuendo la [E] e quella di [ES] e Vmax diminuisce di un valore pari a (1+([I]/Ki)).

]Vmax[S=v ( )[ ]I]Km+[S 1+ Ki

Effetto del pH sulla catalisi enzimatica: "pH-optimum" è, di solito, più alto in enzimi da batteri che non in enzimi di origine fungina. Non considerando gli effetti del pH sulla stabilità della struttura proteica dell'enzima, perché l'enzima sia attivo devono essere simultaneamente presenti gruppi carichi sulle catene laterali di amminoacidi, e questi rispondono in modo diverso al cambiamento di pH. Inoltre, il pH può avere effetti sulla carica del substrato, del prodotto o dell'inibitore, con possibili effetti sull'interazione con l'enzima. L'interazione è massima quando la Km è minima. Il pH quindi influenza la Vmax.

Misure di stabilità

Denaturanti fisici:

• Radiazioni ionizzanti: Il principio è la rottura omolitica dell'acqua, con generazione di radicali reattivi che provocano danno alle macromolecole.
• Sforzi di taglio o deformazione meccanica: L'azione denaturante degli sforzi di taglio ha maggiore effetto quando i legami sono indeboliti da fattori come pH, presenza di interfacce, agenti chelanti e T. Le sorgenti di shear force sono pompe ad alta velocità di rotazione (centrifughe), e gli effetti di laminazione indotti dall'attraversamento di sezioni idrauliche ridotte.
• Trattamenti che influenzano la struttura dell'acqua: (T, alte P, congelamento) L'acqua perde la sua capacità strutturante e viene a mancare la spinta entropica alla formazione di legami idrofobici. L'uso di alte pressioni permette di evitare interazioni covalenti nelle catene laterali di aa.

Denaturanti chimici o chimico/fisici:

• pH: Valori estremi di pH portano ad alterare irreversibilmente le interazioni ioniche nella proteina.
• Caotropi (uree, ioni guanidinio): Funzionano a concentrazioni elevate disturbando la struttura dell'acqua ed eliminando la capacità strutturante.
• Detergenti: Stabilizzano le strutture disavvolte della proteina inglobando le regioni idrofobiche esposte.
• Reattivi specifici (es. metalli pesanti, formaldeide): I metalli pesanti hanno elevata tiofiicità, quindi si legano irreversibilmente alle funzioni -SH sulle cisteine. Formaldeide reagisce con le funzioni amminiche (lisina) formando basi di Schiff.
• Agenti ossidanti (perborato, acqua ossigenata): Hanno come bersaglio le cisteine, ossidandole e producendo legami disolfuro, oppure trasformando la funzione tioetere -S-CH₃ nella metionina in funzioni sulfossido (-SO-CH₃) o sulfone (-SO₂-CH₃).
• Solventi miscibili e immiscibili con acqua: I solventi miscibili (es. acetone, etanolo, propanolo, acetonitrile) diminuiscono la spinta entropica dell'acqua e alterano le interazioni ioniche. I solventi immiscibili e interfacce possono denaturare la proteina, favorendo l'esposizione del suo core idrofobico.

Modalità per stabilizzare un enzima

Interventi sull'intorno chimico-fisico:

• Rimozione acqua: Liofilizzazione, aggiunta di sali, aggiunta di cosoluti polari come zuccheri o polialcoli. La liofilizzazione è un metodo molto costoso e sconsigliato su grandi volumi, mentre i cosoluti formano legami H.

Interventi sulla proteina:

• Aggiunta substrato/inibitori competitivi: Aiuta a stabilizzare dalla denaturazione per azione di denaturanti chimici o fisici.
• Aggiunta di cofattori o agenti strutturanti: Si ha irrigidimento della struttura attorno al sito attivo, con effetto simile al precedente.
• Modificazione covalente (grafting): Legame covalente di molecole in grado di bloccare l'acqua nell'intorno della proteina.

Interventi su elementi di degradazione biologica:

• Prevenzione proteolisi e autolisi: Mediante conservazione a basse temperature o diluzione con proteine inerti, le quali possono abbassare la quantità di acqua libera. Ad esempio, β-galattosidasi sono tenute in presenza di sieroproteine, mentre le amilasi sono diluite con farina.
• Prevenzione crescita microrganismi: La rimozione dell'acqua impedisce la crescita microbica, importante negli enzimi ad uso alimentare, ove non è consentito l'uso di battericidi o fungicidi chimici.

Determinazione sperimentale della stabilità enzimatica

Significato principale: Prevedere come si comporterà la proteina anche in condizioni non verificabili sperimentalmente.

1. Si misura, in condizioni ottimali, l'attività dell'enzima non trattato.
2. Si procede ad incubazione alla T richiesta e si effettua nuovamente la misura dell'attività dopo un t noto.
3. Si misura ulteriormente l'attività, sempre in condizioni ottimali, dopo un'ulteriore incubazione.

( )A At−Kt ' t=e =−k→ ln ’ t

La perdita di attività è un evento descritto dall'equazione A Ao0(linearizzato) dove k' è la costante di velocità apparente della reazione di scomparsa dell'enzima.