Enzimologia e proteine, Biochimica

Derivazione dell'equazione di Michaelis-Menten

Continuiamo con l'enzimologia e deriviamo l'equazione di Michaelis-Menten a partire dai principi primi. Questa dimostrazione presenterà un'ulteriore approssimazione, da sommare alle altre approssimazioni apportate sullo schema generale di Michaelis-Menten e+s=es=e+p, funziona con gli enzimi a doppio substrato, funziona a doppio complesso attivato, funziona sempre.

Assunzioni dell'equazione

Un'ulteriore assunzione da aggiungere è che la velocità di reazione osservata, il consumo di substrato in unità di tempo, deve essere uguale alla seconda costante cinetica per es, cioè la velocità che osserviamo sia di primo ordine e dipendente dalla concentrazione di es. Perché questa è un'assunzione? È valida solo nello stato stazionario, quello in cui la concentrazione del complesso es è costante.

In questa equazione cinetica, si suppone che le costanti cinetiche k1 e k-1 siano talmente veloci da poter considerare la prima parte della reazione all'equilibrio immediato, cioè c'è sempre es e man mano che viene consumato si riforma per legge di azione di massa; questo sarà vero solo nella situazione di stato stazionario, in cui es deve rimanere costante.

Utilizziamo poi la definizione di km e introduciamo la definizione di enzima totale, una quantità nota (per misurare la km è necessario conoscere la concentrazione dell'enzima), quindi Etot= e+es.

Derivazione dell'equazione

Da queste relazioni possiamo ricavare l'equazione di Michaelis-Menten. Dalla definizione di km metto in evidenza e (enzima libero) che diventa uguale a Km per es fratto s; ricavato il valore di e in funzione di km ed es, lo sostituisco nell'equazione precedente enzima totale uguale ad e più es e si ottiene quindi enzima totale uguale ad s più km per s su es; l'enzima totale sarà ora in funzione di es e di km.

A questo punto si mette in evidenza es e quindi et è uguale ad es (1+km/s); mi metto es in evidenza nell'espressione e ottengo es in funzione di et; questi passaggi sono importanti per eliminare le variabili incognite (es non può essere nota, bisogna esprimerla in funzione, avendo quindi a disposizione es in funzione di et (costante) e Km (costante), s è la nostra variabile indipendente, quindi es diventa noto).

A questo punto si utilizza l'equazione semplificata, V=k2 per es, in cui es dovrebbe essere costante, ma non si ha un valore di es, sostituiamo quello che ci siamo ricavati prima, es = et/ (1+km/s) e otteniamo una espressione di V velocità in funzione di K2 costante, et costante, Km costante ed es variabile indipendente e si ottiene l'equazione di Michaelis-Mente, basta riarrangiarlo, eliminando la doppia frazione e ottenendo un'espressione più familiare, V uguale K2 per et (tutti e due costanti) o s più moltiplicato s fratto s più km; questa è l'equazione di Michaelis Menten che nella sua forma standard si può riarrangiare raggruppando le due costanti, il prodotto di et è una costante, quantità nota a priori, il prodotto di k2 per et è Vmax, la velocità massima che l'enzima può raggiungere, sostituita nell'espressione diventa V=Vmax per s fratto s+Km, equazione omografica iperbolica che dà l'andamento noto come cinetica enzimatica di Michaelis-Menten.

Ricapitolazione dei presupposti

Ricapitolando, l'equazione di Michaelis-Menten pone come presupposti:

• Schema di reazione semplice a un substrato
• Assunzione dello stato stazionario (il complesso es deve rimanere costante nel tempo) e quindi la velocità osservata è proporzionale solo alla seconda costante cinetica, perché la prima parte dell'equazione rimane costante.

Ecco l'equazione. V in funzione di s e due parametri Km e Vmax, due parametri fondamentali che definiscono l'attività di un enzima. Mettendo in grafico l'equazione omografica in funzione della variabile indipendente concentrazione di substrato s, otteniamo una forma iperboloide passante per il centro dalla quale anche graficamente è possibile determinare Km e Vmax. Vmax sarà l'asintoto dell'equazione per s che tende all'infinito.

Definizioni importanti

Km è (costante di equilibrio si misura in M) la concentrazione di substrato alla quale la velocità osservata sarà la metà della velocità massima. Ricapitoliamo le definizioni importanti: Km è la costante di dissociazione del complesso es, ha come unità di misura la M (molarità) e corrisponde alla concentrazione di substrato alla quale la velocità osservata è un mezzo della velocità massima; negli enzimi a più substrati è presente una Km per ogni substrato, una ossidasi avrà una Km per l'ossigeno e una Km per il substrato da ossidare; la Km, come tutte le costanti di equilibrio, dipende dalla temperatura (ma se la reazione enzimatica coinvolge dei protoni, un equilibrio acido base, andrà definito anche un valore di pH, però dipende sempre dalla temperatura e non sempre dal pH); la costante Vmax (corrisponde all'...