Enzimologia - cinetica enzimatica

Cioè, dalla velocità di sintesi del complesso ES quindi, K [E][S], la velocità che cos’è? È

1

rappresentata dalla costante moltiplicata la concentrazione del substrato; quindi la velocità di sintesi

di ES è uguale a K per [E][S] che sono i reagenti di questa reazione, meno le altre velocità di

1

decomposizione; quindi K [ES] che descrive la reazione inversa che da ES porta ad E + S, meno

2

[ES] che invece descrive la reazione di decomposizione di ES in E + P; quindi, velocità di

ancora K 3

formazione meno la velocità di decomposizione deve essere uguale a zero, cioè deve essere costante.

Motivo per cui riarrangiando si può scrivere questa relazione matematica in questa maniera:

Come procediamo? Scrivendo l’equazione di velocità di formazione del prodotto come funzione della

concentrazione di ES; cioè, la velocità di questa reazione può essere vista come la variazione della

concentrazione del prodotto nel tempo e quindi K [ES]. Che cosa stiamo dicendo con questa

3

relazione? Stiamo parlando del punto di inizio da cui partire per poter ottenere un’equazione di

velocità che venga incontro alle nostre esigenze; perché di fatto già lo sappiamo a cosa è uguale la

velocità di questa reazione, a K [ES]; perché? Perché in base a tutto quello che abbiamo detto ora

3

date le due parti della reazione quale delle due parti è la più lenta? Quella che porta alla formazione

di ES o quella che porta alla decomposizione di ES? La più lenta qual è, che quindi sarà quella

responsabile della velocità complessiva della reazione? È la seconda; ci troviamo in presenza di

concentrazioni elevate di substrato, molto maggiori rispetto a quelle dell’enzima; la prima parte della

reazione è molto più veloce, quanto meno più veloce della seconda parte; motivo per cui la velocità

[ES].

della reazione complessiva è uguale alla velocità della seconda parte della reazione, quindi, K 3

Noi stiamo partendo da questa equazione di velocità, cioè questa è già un’equazione di velocità in cui

diciamo che la velocità della nostra reazione complessiva è K [ES]; solo che questa equazione scritta

3

in questa maniera non ci serve a niente, noi abbiamo bisogno di descriverla diversamente la velocità

in modo tale da avere parametri cinetici che descrivano l’enzima e quindi la reazione. Partendo da

questa relazione che noi già conosciamo, cominciamo a modificarla, in che modo? Prima abbiamo

scritto l’equazione di conservazione di massa per l’enzima [E ]=[ES]+[E]; allora, dividiamo la

tot

nostra equazione per l’equazione di conservazione di massa per l’enzima e quindi avremo:

A questo punto avremo un ulteriore equazione di velocità ma che ancora una volta non soddisfa le

nostre richieste; andiamo avanti…

Prima partendo da questo presupposto eravamo arrivati a questa equazione:

Questa stessa equazione possiamo riscriverla in quest’altra maniera

Perché stiamo facendo tutti questi passaggi separati l’uno dall’altro? Perché ci servono dopo a mettere

tutto quanto insieme; per ora abbiamo già integrato nell’equazione della velocità in nostro possesso,

l’equazione di conservazione di massa per l’enzima; adesso stiamo per integrare una nuova modalità

di espressione della concentrazione del complesso enzima-substrato; perché se abbiamo ottenuto ciò

Es diventa

Se [ES] è uguale al rapporto fra le costanti per [E][S], possiamo andare a sostituire questo valore di

[ES] nell’equazione di prima (6), ottenendo:

Ripetiamo; abbiamo detto che noi partiamo dalla nostra equazione di velocità, ovvero V = K [ES],

o 3

come abbiamo modificato questa equazione di velocità? Abbiamo, innanzitutto, introdotto l’enzima

attraverso l’equazione di conservazione di massa dell’enzima, andando a dividere i numeratore per

questa equazione di conservazione di massa per l’enzima; cosa abbiamo fatto subito dopo? Abbiamo

sostituito alla concentrazione di ES quello che abbiamo calcolato partendo dall’ipotesi dello stato

stazionario; noi ci troviamo in queste condizioni quando effettuiamo le nostre misurazioni, quindi

sarà vero che ES sarà uguale a

Quindi possiamo sostituire questa all’equazione di prima, in cui già avevamo introdotto l’enzima;

otteniamo questa:

Dividiamo numeratore e denominatore per [E] e otteniamo: al

A questo punto cosa facciamo? Semplici riarrangiamenti; portiamo la concentrazione di E tot

secondo membro dell’equazione; l’aggiustiamo in base a ciò che ci serve, noi vogliamo un equazione

sarà uguale a:

di velocità, quindi V 0

Noi sappiamo anche che nelle nostre condizioni la concentrazione di substrato è molto maggiore di

quella dell’enzima; [E ]=[ES] quindi possiamo dire che K [E ] è equivalente a K [ES]; ma quando

tot 3 tot 3

è vero questo, di che tipo di velocità stiamo parlando? Velocità massima; quindi, cominciamo ad

avere un primo parametro cinetico e a descriverlo; che cos’è la velocità massima? È quel valore di

velocità iniziale (ricordiamo, che questo stiamo facendo: misurazioni di velocità iniziale) che si può

misurare quando la concentrazione di substrato è saturante, cioè è molto maggiore dell’enzima,

fosse uguale alla concentrazione del

motivo per cui potevamo assumere che la concentrazione di E tot

complesso ES; quindi, possiamo dire che K [ES] è la velocità massima nelle nostre condizioni.

3

Allora, andiamo a sostituire V laddove prima c’era K [E ]; perché:

max 3 tot

e otteniamo:

Sostituiamo V max

La nostra equazione sta iniziando a prender forma; facciamo ulteriori riarrangiamenti matematici,

dividiamo numeratore e denominatore per K /K + K , effettuiamo delle semplificazioni e quello

1 2 3

che otteniamo è V 0:

Immaginiamo per semplicità di dare a questo insieme di costanti un unico nome, K ; la nostra

m

equazione si trasforma così in quella che conosciamo bene come equazione di Michaelis-Mendel,

anche se bisogna ricordare che questa l’abbiamo ottenuta partendo dalle assunzioni di Briggs e

Haldane; quindi, di fatto entrambi gli scienziati sono giunti alla stessa equazione, ma la grande

differenza sta proprio nel concetto di considerare, per Briggs e Haldane, K uguale a

m

E V pari a :

0

Questo è un caso semplice; nel caso di reazioni più complesse, cioè nel caso in cui abbiamo la

formazione di più intermedi prima di avere il prodotto e quindi abbiamo più costanti, la K descritta

m

da Briggs e Haldane terrà conto di tutte le costanti.

Passiamo a Michaelis-Mendel, qual è la differenza? Eravamo partiti dalla variazione del complesso

enzima-substarto nel tempo che era uguale alla velocità di composizione meno le velocità di

decomposizione, nel caso di Michaelis-Mendel abbiamo solo una velocità di decomposizione e quindi

avremo che K [E][S]= K [ES]; cioè non compare K [ES] come succedeva prima per Briggs e

1 2 3

Haldane. Se partiamo da questo e andiamo a fare gli stessi riarrangiamenti di prima (guardare la slide

n°26 della sesta e settima lezione), abbiamo di nuovo l’equazione di prima in cui abbiamo diviso tutto

per l’equazione di conservazione di massa per l’enzima ([E ]=[ES]+[E]); l’unica differenza riguarda

tot

questo aspetto qui, che la [ES] che ci andremo a calcolare non terrà più conto di K , abbiamo solo il

3

/K :

rapporto di K 1 2

La K la ritroviamo sotto, perché ad un certo punto viene considerata la velocità complessiva della

3

reazione che è K [ES]; questo per descrivere completamente la reazione si deve considerare, quindi

3

il K compare ma a questo livello, ottendendo:

3

Completando il nostro percorso e come avevamo preannunciato prima, l’unica grande differenza è

in relazione alle altre costanti; perché di

data dall’assenza nella nostra equazione del parametro K 3

fatto K c’è ma compreso nel concetto di V , esattamente per come c’eravamo arrivati prima.

3 max

Quello che cambia è questo:

Infatti proprio per mettere in evidenza questa equazione da quella di Briggs e Haldane, non viene

chiamata più K ma K , cioè costante di specificità; perché K è un modo per racchiudere tutte le

m s s

costanti, ma le costanti chi sono? K /K ; vedremo tra un po’ perché questo rapporto corrisponde alla

2 1

costante di specificità; di fatto abbiamo visto qual è la differenza partendo da assunzioni differenti.

Ricordiamo questa relazione:

Partendo dalle assunzioni di Michaelis-Mendel avevamo scritto:

Viene a mancare K [ES]; cosa vuol dire questo? Che se riarrangiamo questa relazione portando [ES]

3

al denominatore del secondo membro, otteniamo:

Questa qui che cos’è, se non una costante di dissociazione e quindi di specificità?!

Cioè, quella costante che descrive la capacità che ha ES di dissociarsi in E ed S o al contrario, la

capacità di E ed S di dare ES; questa è la ragione per cui nel caso di Michaelis-Mendel per

convenzione invece di parlare di K si parla di K ; perché di fatto sono due concetti differenti.

m s

Soltanto se partiamo dalle assunzioni di Michaelis-Mendel è possibile dire che la K indica l’affinità

m

dell’enzima per il substrato; questo è il motivo per cui bisogna stare attenti quando si deve dare la

, bisogna tener conto di quali assunzioni si facciano, perché se partiamo da quelle

definizione di K m

di Briggs e Haldane che abbiamo detto essere quelle più reali, viene meno questo concetto, perché

interviene un K che nulla ha a che fare con questo rapporto.

3

Facciamo delle considerazioni generali sull’equazione cinetica ottenuta…

Partiamo da entrambe le assunzioni, quest’equazione

Rappresenta, chiaramente, un’equazione che descrive una curva che altro non è se non un’iperbole

rettangolare; in cui sull’asse delle ordinate abbiamo V e sull’asse delle ascisse la concentrazione del

0

substrato.

Che cosa succede per concentrazioni del substrato molto minori della K ? Stiamo andando a vedere

m

se l’equazione che abbiamo ottenuto veramente descrive quello che noi vediamo nei nostri

esperimenti; cioè, se è un’espressione fedele, che veramente ci può parlare di ciò che accade

sperimentalmente e quindi nelle cellule. Allora, facciamo d