Entomologia applicata

Utilizzo di metodi molecolari per l'identificazione di taxa

Introduzione alla tassonomia molecolare

Tassonomia: è il processo di nominare e classificare gli organismi in gruppi all’interno di un sistema gerarchico, sulla base di similarità e differenze.

Gruppo monofiletico: si intende un gruppo formato dall’antenato comune e tutti i componenti derivati.

Gruppo parafiletico: si intende un gruppo formato dall’antenato comune ma con l’esclusione di uno dei componenti discendenti (es: crostacei).

Gruppo polifiletico: si intende un gruppo al cui interno non vi è un antenato comune.

Carolus Linnaeus (botanico svedese), il padre dell’attuale sistema di classificazione degli organismi e della nomenclatura binomia (Johan Christian Fabricius). Implicazioni in diversi campi, non solo scientifici.

DNA: è un acido nucleico che contiene le informazioni genetiche necessarie alla biosintesi di RNA e proteine, molecole indispensabili per lo sviluppo ed il corretto funzionamento della maggior parte degli organismi viventi.

DNA taxonomy: L’uso di una metodologia che usa il DNA per identificare gli organismi.

DNA barcoding: un approccio standardizzato per identificare gli organismi utilizzando una sequenza di DNA chiamata DNA barcode (una piccola sequenza di DNA, presa da una regione riconosciuta come standard, e usata per identificare le specie).

Perché DNA taxonomy?

• Definire un metodo di riferimento e oggettivo per identificare gli organismi e risolvere i potenziali problemi legati agli “approcci tradizionali” che si basano sulla morfologia.
• Identificazione degli organismi anche su campioni parziali o stadi di sviluppo, dove la morfologia sia poco informativa: provare a risolvere “l’impedimento della tassonomia”.

Approccio "tradizionale" nella tassonomia entomologica

Basata principalmente sulla morfologia esterna. La specie è l’unica categoria linneana che la maggior parte dei sistematici (biologi in generale) riconosce come naturale. Una specie per evolvere deve includere individui che non si conformano completamente alla definizione.

Concetto biologico di specie (BSC): un insieme di popolazioni interfeconde in condizioni naturali e riproduttivamente isolate da altre analoghe (Mayr, 1942). La specie intesa come una comunità riproduttiva: flusso genico tra individui e popolazioni (è il processo naturale che consente di identificare un’entità “reale”).

• Instauratosi l’isolamento riproduttivo si determinerà divergenza fenetica.
• Ribaltamento della relazione causa-effetto: “due popolazioni sono morfologicamente simili perché appartengono alla stessa specie biologica”.
• Quindi le differenze morfologiche costituiscono l’elemento di conoscenza attraverso cui inferire l’esistenza di un isolamento riproduttivo.

Concetto morfologico di specie (fenetico, MSC): inteso come la versione operazionale del BSC. L’effettiva esistenza dell’isolamento riproduttivo deve essere dedotta da un’accurata analisi dei tratti morfologici. La tassonomia numerica (1960) riprende questo concetto, indicando con il termine di specie l’insieme di organismi sufficientemente distinti sul piano fenetico.

• Ogni concetto usa informazioni relative a caratteri per delineare i confini con le specie, e la maggior parte di queste informazioni è di tipo morfologico (Cracraft, 2000).

Svantaggi

• È soggettivo, è lo specialista che decide.
• Problema della variabilità intraspecifica.
• Non univocità degli approcci analitici adottati.
• Specie criptiche: differiscono sul piano genetico, non su quello morfologico (apparentemente).

Concetto ecologico di specie: gruppo di organismi simili (o meno) fenotipicamente che occupano differenti nicchie ecologiche. Legato al BSC, implica un vantaggio selettivo per l’incrocio degli individui che occupano la stessa nicchia. L’integrità delle specie è mantenuta dalla selezione per l’adattamento a nicchie diverse, non dall’isolamento riproduttivo.

• Difficile adozione per le specie i cui semaforonti occupano nicchie ecologiche diverse.
• Definizione di nicchia ecologica non definita univocamente: iperspazio concettuale definito dagli n fattori biotici/abiotici che influenzano l’esistenza di un organismo/specie in un ecosistema.

In definitiva ha senso rispondere alla domanda “cos’è una specie?” e cercare (se esiste) una definizione univoca? Una specie è considerata tale se è un tassonomo competente a deciderlo (D. Raup). Attualmente, specie considerata come un "fenomeno diversificato" che può essere caratterizzato, morfologicamente, geneticamente, ecologicamente piuttosto che definito nel suo complesso.

Approccio "molecolare" nella tassonomia entomologica

La tassonomia molecolare unisce il BSC, MSC e anche il concetto filogenetico di specie. PSC considera i gruppi monofiletici come le uniche entità reali del processo evolutivo/speciazione: risultato di un'analisi filogenetica.

Breve storia:

• 1977: idea
• 1996: primo studio sul DNA metabarcoding
• 2003: uso del termine DNA barcoding
• Il presente ed il futuro: DNA barcoding, Metabarcoding, eDNA metabarcoding

L’idea della tassonomia molecolare parte dal 1977 quando uno scienziato ha utilizzato delle sequenze 16s per identificare delle specie. Nel 1996 Giovannoni ha fatto dei lavori di metabarcoding sul batterio plancton. Nel 2003 vengono usate delle sequenze di C1, questo per capire se si potevano utilizzare dei “caratteri” per discriminare le varie tipologie di uccelli.

Aree di applicazione

Applicazioni della DNA taxonomy:

• Sicurezza alimentare e applicazioni mediche e veterinarie
• Biomonitoraggio: DNA barcoding per identificare organismi da quarantena (programmi della protezione delle colture), e biomonitoraggio di insetti dannosi alle orticole
• Conservazione della biodiversità: ecosistemi marini, di acqua dolce e terrestri. Caratterizzazione della dieta.

DNA barcodes: sono regioni di marcatori genici, possibilmente corte, usate per l’identificazione tassonomica di organismi. Deve essere sufficientemente variabile da poter discriminare tra specie.

DNA barcoding vs DNA metabarcoding (DNA target degradato):

• Caratteristiche dei primers:
  • Regioni di annealing molto conservate all’interno del gruppo
  • Regioni di annealing non conservate all’esterno del gruppo (uso dei blocking primers)

Se stiamo confrontando un insieme di individui che fanno parte, ad esempio, della dorifora e degli scoiattoli, la distanza interspecifica sarà logicamente enorme! Se invece prendiamo delle specie che stanno filogeneticamente vicini avremo pochissima distanza interspecifica.

Per identificare un organismo bisogna seguire questi punti:

• Raccolta dei campioni
• Estrazione DNA, solitamente si estrae solo da zampa, per ridurre la contaminazione di batteri. Qualche contaminazione nell’emolinfa c’è ma sono minori rispetto al corpo.
• PCR
• Sequenziamento Sanger
• Controllo degli elettroferogrammi, contaminazioni (bisogna essere sicuri che non ci siano contaminazioni), numts (indica i geni che attualmente sono nel nucleo ma che sono di origine mitocondriale)
• Comparazione con database di riferimento
• Identificazione

Mutazioni del DNA possono essere sinonime o non sinonime. Quelle non sinonime fanno cambiare il codone e quindi mi ritrovo delle mutazioni sull’aminoacido.

L’evoluzione del DNA metabarcoding:

DNA metabarcoding: È un metodo rapido per identificare simultaneamente gli organismi presenti in un campione (suolo, acqua) partendo dal DNA estratto da una comunità di organismi o eDNA. Combina due tecnologie ossia il DNA taxonomy e high-throughput DNA sequencing (HTS) platforms.

eDNA: (environmental DNA) miscela di DNA genomico proveniente dai diversi organismi presenti nel campione ambientale. DNA estratto da campioni ambientali con lo scopo ti ottenere l’informazione tassonomica e funzionale più comprensiva.

• DNA intercellulare deriva da procarioti e/o eucarioti che vivono nei campioni ambientali.
• DNA extracellulare deriva dalle cellule di organismi morti (è degradato da agenti chimici e fisici).
• Il problema del eDNA è che trova anche il DNA di specie magari non più presenti! Quindi il DNA extracellulare sarebbe da eliminare se si stanno cercando specie vive! In base agli obiettivi che ci poniamo dobbiamo cercare di utilizzare il DNA che più ci interessa.

Che tipo di marcatore genetico si usa? Dipende dagli scopi e dagli organismi target:

• Batteri: 165 rRNA
• Funghi: Internal transcribed spacer 1 and 2 (ITS1, ITS2) e altri specifici di ciascun gruppo. Si possono amplificare entrambe o solo 1 delle 2.
• Piante: ribulose-bisphosphate carboxylase (rbcL) e la maturase K (matK), ma anche psbA-trnH/ITS intergenic region
• Animali:
  • COX1 che sono geni mitocondriali del citocromo
  • 18S rRNA o il mitocondriale 12SrRNA/165 rRNA. Metodo utilizzato in particolare quando non si sa bene cosa trovare, (oppure es: distinguere il gruppo di metazoi o la famiglia di nematodi pericolosi presenti nel campione) e permette di ottenere dei prodotti non troppo precisi.
  • Per alcuni artropodi mt 12S rRNA e 16S rRNA

Serve un database di sequenze di riferimento ben fatto, che deve essere sviluppato pian piano, è fondamentale un coinvolgimento tra i vari specialisti in modo da raccogliere più informazioni possibili. Sviluppo di un dataset:

• Quanti organismi → minimo 3-5 individui per specie da diverse località dell’areale
• Quale markers → facilmente disponibile nei campioni biologici, deve identificare correttamente le specie: diversità intraspecifica < diversità interspecifica

Sequenze di organismi cospecifici sono sempre più simili di quelle di specie differenti:

1. Allineamento del dataset di riferimento: marker cox1, controllo reading frame su sequenza amminoacidica
2. • Approcci basati sulla distanza nucleotidica K2P: si stima il valore soglia intra- inter- specifica
   • Regola empirica “ten-fold rule” →
   • Soglia ottimale min[Σ(errore 1+2)]
   • E1 (+)= individui co-specifici presentano una distanza nucleotidica (K2P) maggiore alla soglia.
   • E2 (-)= individui di specie diverse che hanno tra loro una distanza nucleotidica (K2P) inferiore alla soglia.
3. Automated Barcoding Gap ABGD: ogni esemplare presenta come “geneticamente più simili” gli esemplari cospecifici? Massimo numero di gruppi (i.e. specie) tale che la distanza nucleotidica di 2 sequenze (appartenenti a 2 gruppi diversi) sia sempre > della distanza soglia stimata.
4. Analisi di identità (similarità) di sequenza (e.g. BLAST): diversi parametri da considerare: coverage, evalue, identità di sequenza.
5. Modelli che applicano il concetto filogenetico di specie: identificano la soglia inter- intra-specie sulla base dell’albero filogenetico inferito su singolo marcatore

GMYC: Modellizza lungo l’albero il processo Birth-Death (tra le specie) e processo di coalescenza (intra specie).

bPTP: Approccio Bayesiano che modellizza il tasso di speciazione utilizzando il numero di sostituzioni.

P(H |E) =⇒ teorema di Bayes
P(E|H ) =⇒ funzione di verosimiglianza

Le specie risultano essere monofiletiche?

L’evoluzione del DNA metabarcoding

Un passo indietro… come possiamo definire una sequenza di DNA?

Una sequenza di DNA “S” è un insieme ordinato di n caratteri (s) che rappresentano nucleotide o amminoacidi.

• DNA è composto da 4 nucleotidi o basi (A, C, G, T)
• RNA è composto da 4 nucleotidi (A, C, G, U)
• Le proteine sono composte da 20 amminoacidi

Noi siamo interessati a stimare la similarità di sequenza tra due sequenze. Com’è definita la similarità di sequenza?

Similarità: misura quantitativa che indica quanto due 2 sequenze di nucleotidi o di proteine sono simili tra loro.

• Il numero di nucleotidi corrispondenti dopo l'allineamento?
• L'ammontare delle informazioni condivise?
• La “distanza" tra le due sequenze in una metrica?

Assumiamo di avere 2 sequenze…
La 1ª è lunga 42 nucleotidi e la 2ª è lunga 60 nucleotidi. Dopo il loro allineamento, 40 siti sono identici. Possiamo dire che 40/42=95% della sequenza 1 è “spiegata” dalla seq 2, mentre ~67% della seq 2 è “spiegata” dalla seq 1.

Il 67% viene fuori perché abbiamo in totale 60 nucleotidi e quindi 40/60 fa 67%.

Identità di sequenza (misura della similarità di sequenza): è il numero di residui identici presenti in un allineamento, diviso per il numero totale di posizioni allineate, escludendo le posizioni con il gap.

BLAST [Basic Local Alignment Search Tool]: Serve per confrontare le diverse sequenze, solitamente possiamo confrontare o proteine o nucleotidi. Abbiamo anche delle “ibride” come delle sequenze aminoacidiche “blastata” su sequenze nucleotidiche che codificano proteine e viceversa.

EMBOSS: La codon table è importantissima perché in base agli organismi ci sono differenze. Nel nostro caso sono insetti quindi selezioniamo invertebrate mitochondrial e facciamo submit. Ci viene poi fuori la sequenza aminoacidica con indicati gli stop codon segnati con *. Se abbiamo settato 6 frame di lettura le prime 3 sono forward la 4, 5 e 6 sono reverse.

Campionamento, stima e monitoraggio della diversità entomologica in un agroecosistema

Alcune definizioni utili per il campionamento:

• Habitat: si riferisce all’ambiente in cui vive una specie animale e vegetale (in senso autoecologico).
• Areale: area di distribuzione di una specie
• Stazione: luogo geografico in cui una specie è presente
• Nicchia ecologica: concetto che fa riferimento non solo allo spazio fisico in cui vive una specie, ma anche al ruolo funzionale che essa svolge in rapporto alle altre specie e alle caratteristiche dell’ecosistema.

Gli insetti sono presenti ovunque data la loro estrema variabilità. Gli insetti sono “i crostacei” che hanno colonizzato le terre emerse. Esoscheletro degli scorpioni brilla se irraggiato con gli UV.

Biodiversità funzionale: componente importante della IPM in quanto questa BD riesce a tenere sotto una determinata soglia la popolazione dei pests.

Pianificazione del Campionamento:

• Scopi: elenco faunistico, biodiversità specifica associata ad un ecosistema, presenza /assenza di un pest e densità/numerosità della sua popolazione
• Taxa a cui si è interessati (ecologia) —> fitofagi, detritivori, predatori, insetti acquatici
• Tempo a disposizione e risorse economiche

Strumenti di campionamento

I metodi di campionamento possono essere suddivisi in due categorie:

• Diretti: si ottengono informazioni di tipo qualitativo (es: assenza o presenza di un taxa). Usato per scopi faunistico-ecologici. Il risultato dipende dall'esperienza dell'operatore e i dati non sono utilizzabili per analisi statistiche se non a livello di comunità (es: 0,1).
• Indiretti: si ottengono informazioni di tipo semi-quantitativo /quantitativo. Usato per test di ipotesi/monitoraggio di pest nell'agrosistema. Si tende a rendere nulla l'esperienza dell'operatore (standardizzazione delle analisi) ed è possibile analizzare mediante tecniche statistiche i dati analizzati.

Strumenti a disposizione per il campionamento: spesso gli strumenti utilizzati sono gli stessi, cambia solo il metodo d'uso.

• Retino da sfalcio: costituito da un manico + bocca romboidale (struttura metallo rigida, diametro 30-40cm). Il particolare modo d’utilizzo fa sì che occorra avere delle superfici piatte e non circolari.
  • L’operatore, prestando attenzione di tenersi di fronte il sole può iniziare a “falciare” il terreno. È necessario che la propria ombra non venga proiettata innanzi perché gli insetti metterebbero in atto un particolare comportamento antipredatorio che renderebbe meno proficua la cattura. La tanatosi, ossia il farsi cadere e mostrarsi morti, è una strategia che gli insetti utilizzano in caso di presenza di un possibile predatore.
  • Gli insetti immobili a terra sono più difficili da catturare con un retino falciatore e la stima che verrebbe eseguita risulterebbe sottodimensionata rispetto la popolazione.
• Retino per farfalle: manico metallo, la rete è costruita in materiale sintetico. La struttura permette di essere smontata per agevolarne il trasporto. Utilizzato per la cattura di coleotteri, lepidotteri… (simile a quello da sfalcio ma con manico molto più lungo).
• Retino per artropodi acquatici: utilizzato per la cattura di artropodi che vivono in ambiente acquatico, ha le maglie costituite da materiale alquanto resistente. Al fondo della rete si trova un contenitore in plexiglass che può venire sormontato per la raccolta degli insetti.
• Nasse con esca: utilizzate con esca a base di carne o pesce, servono per la cattura di grossi insetti.
• Ombrello entomologico: di semplice fattura (simile ad un ombrello appoggiato al suolo e privato dei bastoncini), viene posto alla base degli arbusti, degli alberi.
  • L’operatore si pone al di sotto della vegetazione e provoca la caduta degli animali presenti su di essa.
  • Solitamente la tanatosi viene messa in atto anche in questo frangente dagli insetti i quali cadono sul telo. A questo punto l’operatore può prelevare gli animali con un aspiratore.
• Selezionatore di Berlese: metodo di estrazione dinamico. Sfrutta la reazione di fuga della fauna del suolo dalla luce e dell'essiccamento provocato da una fonte luminosa. Gli organismi che presentano per lo più fototassia negativa, si dirigono verso il fondo cadendo nell’imbuto al fondo del quale si trova un contenitore di raccolta. Usato molto per QBSar, acari/collemboli.