Ecologia del Microbiota umano - Domande

Ecologia del Microbiota Umano (2020/2021) Simone Guglielmetti

Domande

ceppo?

Cosa è un

Un ceppo è l’insieme di tutte le cellule microbiche teoricamente originate da una cellula

progenitrice, quindi sono cellule che hanno idealmente un identico patrimonio genetico.

Ogni specie possiede un ceppo type, ossia un ceppo di riferimento che riassume in sé tutte le

caratteristiche genotipiche e fenotipiche dei ceppi della specie che rappresenta. Il ceppo type è

utilizzato per l’identi cazione tassonomica di un ceppo batterico: sono valutate le caratteristiche

genotipiche e fenotipiche del ceppo che si sta studiando e poi sono confrontate con quelle del

ceppo type, con il ne di attribuirgli un genere e una specie.

specie?

Cosa è una

La specie in microbiologia è de nita attraverso regole arbitrarie. La specie è l’insieme di ceppi

similarità

isolati in habitat diversi e in tempi diversi che hanno tre caratteristiche: 1) un’elevata

fenotipica (metabolismo energetico, morfologia, tipologia di molecole prodotte, etc.) e almeno

omologia genetica

una proprietà distintiva nei confronti delle altre specie; 2) un’elevata

omologia logenetica

(riassociazione molecolare DNA/DNA > 70%); 3) un’elevata (la sequenza

di geni che codi cano per il 16S RNA hanno omologia > 98%). clock”?

Perché il gene che codi ca per il 16S rRNA è chiamato “molecular

Il gene che codi ca il 16S rRNA è posseduto da tutti i batteri ed è fondamentale per la sintesi

proteica, dato che è un rRNA che costituisce la subunità minore (30S) dei ribosomi. Per svolgere

la sua funzione (riconoscere l’mRNA e tradurlo) il 16S rRNA deve assumere una struttura

tridimensionale chiamata stem-loop o a forcina. Se una mutazione modi casse anche solo un

nucleotide nel 16S rRNA questo non riuscirebbe ad assumere la struttura tridimensionale e quindi

non potrebbe svolgere la sua funzione. Di conseguenza il gene che codi ca per il 16S rRNA (che

fa parte dell’operone ribosomiale) non muta facilmente, poiché se subisse una mutazione questa

non sarebbe trasferita alla progenie poiché l’individuo morirebbe. Per questo motivo il gene 16S

rRNA è un gene altamente conservato.

I geni hanno predisposizioni di erenti ad accettare le mutazioni: i geni che codi cano per funzioni

fondamentali per la vita accettano di cilmente le mutazioni, mentre i geni che codi cano per

funzioni non fondamentali le accettano più facilmente. Il gene che codi ca per il 16S rRNA è

regioni conservate,

costituito da tre diverse regioni: 1) chiamate anche “panbatteriche”, che

regioni semiconservate,

hanno la stessa sequenza in tutti i batteri; 2) che hanno la stessa

regioni variabili,

sequenza tra batteri dello stesso taxon (es. genere); 3) che hanno la stessa

sequenza tra batteri che appartengono alla stessa specie.

Perciò il gene che codi ca per il 16S rRNA può essere utilizzato come orologio molecolare, ossia

stabilire le distanze logenetiche (evolutive) tra i diversi gruppi tassonomici batterici.

per In

particolare possono essere analizzate le regioni variabili per distinguere diversi generi e specie.

PCR?

Cosa è la Chain Reaction

La PCR (Polymerase = reazione a catena della polimerasi) è una riproduzione in

vitro della duplicazione del DNA. La PCR ha lo scopo di ampli care i frammenti nucleici dei quali

si conoscono le sequenze nucleotidiche iniziali e nali (in questo caso il 16S rRNA). Per e ettuare

la PCR servono: DNA stampo (template), primer panbatterico (oligonucleotidi), DNA polimerasi

(es. Taq polimerasi), desossiribonucleotidi (dNTP), termociclizzatore.

denaturazione,

La PCR avviene in tre fasi: 1) a 94-96°C permette la separazione della doppia

appaiamento

elica di DNA; 2) (annealing), a 45-65°C (in funzione della temperatura di melting del

estensione,

primer) permette il legame del primer con il DNA stampo; 3) a 72°C permette la

sintesi del DNA da parte della polimerasi.

Il primer panbatterico permette di ampli care una speci ca regione del gene 16S rRNA (tra la valle

V3 e V4) che comprende regioni variabili. Il primer panbatterico è comune a tutti i batteri.

Spiegare la teoria olobiontica e cosa è l’ologenoma umano

La teoria olobiontica è stata teorizzata da Lynn Magulis e sostiene che l’essere (organismi

è un olobionte.

superiori) Questo signi ca che gli organismi superiori non sono solo l’insieme

delle cellule che li compongono, ma sono l’unione tra le cellule dell’organismo e tutte le cellule

microbiche commensali e simbiotiche che vivono a contatto con l’organismo. L’olobionte è quindi

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Ecologia del Microbiota Umano (2020/2021) Simone Guglielmetti

superorganismo non scindibile,

un ossia l’organismo superiore non è in grado di svilupparsi e

funzionare in assenza del microbiota. L’ambiente ha agito attraverso le pressioni selettive, sia

sull’ospite che sul microbiota, determinando il processo di evoluzione dell’intero complesso,

l’olobionte.

L’ologenoma è l’insieme delle informazioni genetiche dell’ospite e del microbiota.

microbiota microbioma?

Cosa sono il e il

microbiota

Il è l’insieme dei microrganismi che vivono in un habitat.

microbioma

Il può avere due possibili signi cati: 1) le informazioni genetiche dei microrganismi

che fanno parte di un microbiota; 2) l’intero habitat, ossia i microrganismi, i loro genomi, i loro

prodotti e l’ambiente.

microbiomica metagenomica?

Cosa sono la e la

microbiomica

La studia il microbiota di un habitat e fornisce informazioni riguardanti quali

microrganismi sono presenti e in quali proporzioni. La microbiomica è condotta attraverso il 16S

rRNA gene pro ling, che prevede l’ampli cazione e il sequenziamento di una regione del gene che

codi ca per il 16S rRNA.

metagenomica

La studia il genoma di tutti i microrganismi presenti in un habitat e fornisce

informazioni riguardanti quali geni sono presenti (quindi le loro funzioni putative) e la loro

abbondanza. La metagenomica è condotta attraverso metagenome shotgun sequencing, che

prevede la rottura in piccoli frammenti del DNA, il sequenziamento e l’attribuzione di una funzione

putativa.

In cosa consiste il 16S rRNA gene pro ling?

Il 16S rRNA gene pro ling ha l’obiettivo di identi care quali e quanti batteri sono presenti in un

campione, quindi studia il microbiota.

Per prima cosa si deve prelevare il campione, estrarre il DNA, puri care e ampli care tramite PCR.

Si è sicuri di ampli care solo genoma batterico perché si utilizza un primer panbatterico che ad

una regione speci ca del gene che codi ca per il 16S rRNA. Dalla PCR si ottengono gli ampliconi,

tutti della stessa lunghezza ma con sequenze nucleotidiche di erenti. Gli ampliconi sono

sequenziati con tecnologie di sequenziamento next-gen. Le sequenze ottenute sono chiamate

read. Le read sono gestite come delle pipeline, ossia delle procedure bioinformatiche e statistiche

che permettono di assegnare ad ogni read un nome tassonomico. Le pipeline raggruppano le

Taxonomic Unit).

read con similarità del 97% in OTU (Operational Le pipeline prendono una

sequenza rappresentativa di ogni OTU e le confrontano con sequenze presenti in speci ci

database. Al termine di questa operazione si ottiene la OTU table, ossia una tabella in cui ogni

OTU ha una designazione tassonomica e un dato di abbondanza espresso in numero di read che

la costituiscono.

Il 16S rRNA gene pro ling solitamente fornisce informazioni no al genere del batterio non alla

specie poiché le OTU sono formate da read che hanno similarità del 97%, mentre un individuo

per appartenere ad una specie deve avere omologia logenetica maggiore del 98%. Oltretutto

quando si inseriscono le read rappresentative delle OTU nel databse questo fornisce risultati di

similarità con più specie.

In cosa consiste il metagenome shotgun sequencing?

Il metagenome shotgun sequencing ha l’obiettivo di identi care quali geni sono presenti nel

campione e quali funzioni biologiche hanno, quindi permette di studiare il microbioma.

Per prima cosa si preleva il campione, si estrae il DNA, si puri ca e si e ettua una fase di shotgun,

ossia di frammentazione meccanica del genoma presente nel campione. Lo shotgun permette di

ottenere dei frammenti piccoli, circa 100 pb. I frammenti sono sequenziati tramite le tecnologie di

sequenziamento next-gen, ottenendo le short reads. Le short read sono gestite come delle

pipeline, ossia delle procedure bioinformatiche e statistiche che permettono di assegnare ad ogni

read una funzione biologica. Le read subiscono una fase di assembling, ossia il software compara

tutte le read no a trovare delle uguaglianze e le ri-assembla formando una sequenza chiamata

consensus contig. Il contig rappresenta la sequenza precedentemente rotta con lo shotgun. I

conting ottenuti sono sottoposti ad annotation (annotazione funzionale), ossia gli viene attribuito

un signi cato biologico. Il signi cato biologico è attribuito attraverso le ORF (Open Reading

Frame) che permettono di capire quale regione del conting potenzialmente corrisponde ad un

gene. Il software confronta i geni ottenuti con quelli presenti nel database e fornisce una tabella in

cui sono presenti i pathway metabolici da cui derivano i geni e l’abbondanza di ogni gene in

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Ecologia del Microbiota Umano (2020/2021) Simone Guglielmetti

termini di numero di read. È possibile stabilire per i geni dei livelli come i livelli tassonomici,

utilizzando per esempio i livelli KEGG (es. livello 1 metabolismo, livello 2 catabolismo energetico,

livello 3 glicolisi, etc.).

OTU

Cosa sono le e che signi cato hanno?

Operational Taxonomic Unit,

Le OTU sono le ossia delle unità tassonomiche ttizie create per un

ne pratico raggruppando le sequenze del gene che codi ca per il 16S rRNA usando una soglia di

similarità del 97%.

Le OTU servono per assegnare un nome tassonomico alle read di batteri appartenenti allo stesso

genere o livelli tassonomici superiori e per identi carne la quantità, ossia per capire la proporzione

dei vari batteri presenti all’interno del campione.

read?

Cosa sono le

La read è una sequenza nucleotidica unica corrispondente ad un frammento di DNA sequenziato.

Quindi le read si ottengono dal sequenziamento degli ampliconi (nel caso del 16S rRNA gene

pro ling) e dei frammenti di DNA (nel caso dello shotgun sequencing).

Cosa sono richness, eveness e abbondanza relativa?

richness

La è la misura del numero di unità tassonomiche diverse presenti in un habitat.

eveness

La è la misura della distribuzione dell’abbondanza relativa delle unità tassonomiche.

relativa

L’abbondanza è la misura del numero di ciascuna unità tassonomica rispetto al numero

totale.

Queste sono le tre componenti che permettono di descrivere la biodiversità di un microbiota.

curve di rarefazione?

Cosa è l’alfa-diversità e cosa sono le

L’alfa-diversità esprime la diversità intra-campione e può essere descritta attraverso degli indici

che tengono conto in modo di erente della richness e della eveness, e attraverso le curve di

rarefazione. chao-1,

Gli indici che descrivono l’alfa diversità sono: 1) tiene conto solo della richness

Shannon Simpson,

tassonomica del campione; 2) e tengono conto sia della richness che della

Faith’s PD,

eveness dl campioe; 3) tiene conto della richness e del rapporto logenetico tra le

unità tassonomiche.

rarefazione

La è una tecnica per valutare la ricchezza tassonomica dai risultati di diversi

campionamenti di un ecosistema ed è basata sulla costruzione delle curve di rarefazione.

curve di rarefazione

Le sono un diagramma del numero di unità tassonomiche diverse in

funzione del numero di individui. Le curve di rarefazione inizialmente crescono velocemente,

poiché si trovano molte specie, ma poi raggiungono un plateu poiché sono ancora da campionare

le specie più rare. Gli ecosistemi composti da poche specie sono facilmente saturabili, mentre

quelli composti da più specie necessitano di più tempo per la saturazione.

Le curve di rarefazione hanno anche la funzione di mostrare se l’analisi di microbiomica è stata in

grado di rappresentare tutta la biodiversità del microbiota, ossia se la profondità del

sequenziamento è su ciente per saturare la diversità del campione. Un microbiota composto da

molte unità tassonomiche necessita di un numero alto di reads per la sua descrizione.

beta-diversità?

Cosa è la

La beta-diversità descrive la diversità inter-campione, ossia descrive le di erenze o similitudini

esistenti nella composizione tassonomica di due ecosistemi microbici. La beta-diversità è

algoritmi non logenetici,

determinata utilizzando due categorie di algoritmi: 1) che non tengono

conto della distanza logenetica tra i gruppi tassonomici, e comprendono l’analisi delle

algoritmi logenetici,

componenti principali (PCA) e l’analisi delle coordinate principali (PoCA); 2)

che tengono conto della distanza logenetica tra i gruppi tassonomici, il più utilizzato è UniFrac.

UniFrac può essere unweighted, ossia non considera l’abbondanza relativa del taxon (considera

solo la presenza e assenza) e weighted, ossia considera sia la presenza o assenza del taxon che

la sua abbondanza relativa.

caratteristiche generali dei microbiota

Quali sono le associati all’uomo?

elevata variabilità tra i diversi siti del corpo

I microbiota associati all’uomo presentano una

(sono nicchia speci ci): ogni habitat associato al copro umano possiede dei taxa speci ci e varia

molto anche la biodiversità. 3

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Ecologia del Microbiota Umano (2020/2021) Simone Guglielmetti

inter-soggetto è maggiore della variabilità intra-soggetto nel tempo,

La variabilità ossia il

microbiota di due individui di erenti varia di più rispetto al microbiota di un singolo individuo nel

tempo. Questo suggerisce che l’unicità del proprio microbiota è stabile nel tempo e che questa

stabilità sia associata alla salute. stabilità funzionale,

L’ultima caratteristica dei microbiota associati all’uomo è la ossia è elevato il

numero di taxa che si devono perde/perturbare prima che sia persa/perturbata la funzionalità

dell’ecosistema. Questo signi ca che il microbiota mantiene le sue funzioni nonostante le

perturbazioni. La grande variabilità a livello tassonomico non è rispecchiata a livello funzionale.

ridondanza funzionale,

Questa caratteristica è collegata alla ossia diversi batteri

metabolicamente attivi sono in grado di svolgere le stesse funzioni all’intero di individui di erenti

(microrganismi di erenti sono in grado di svolgere le stesse funzioni).

stabilità di un ecosistema microbico

Descrivere la

Le comunità microbiche che risiedono in un ecosistema associato all’uomo sono costantemente

sottoposte a perturbazioni. Nonostante questo gli ecosistemi microbici sono in uno stato di

equilibrio. Gli stati di equilibrio stabili che possono raggiungere gli ecosistemi sono limitati e

possono essere eubiotici e disbiotici. Alcuni ecosistemi microbici possono assumere degli stati di

equilibrio instabili o di transizione, per esempio in conseguenza allo stato siologico dell’ospite,

oppure in conseguenza ad una perturbazione.

perturbazioni

Le sono degli eventi esterni che provocano una netta pressione selettiva

pulse perturbation,

sull’ecosistema microbico. Le perturbazioni possono essere di due tipi: 1) press

ossia perturbazioni presenti per un periodo di tempo limitato (es. ciclo di antibiotico); 2)

perturbation, ossia perturbazioni presenti per un periodo di tempo prolungato (es. cambiamento

permanente della dieta).

ecosistema stabile

Un può essere de nito se, in seguito ad una perturbazione, mantiene o

ritorna allo stato iniziale (sia in termini di stabilità tassonomica che funzionale). Perciò un

ecosistema microbico può modi carsi nel tempo ( uttuare) ma ritorna al suo stato iniziale se non

stabilità

ha subito una grave perturbazione. Per questo motivo la stabilità del microbiota è una

dinamica.

ecosistema resistente

Un microbico è se, durante una perturbazione, è in grado di rimanere

resiliente

invariato; è de nito se, in seguito ad una perturbazione drastica, è in grado recuperare

la sua composizione tassonomica o funzionale iniziale. ecosystem service,

Lo stato di equilibrio stabile eubiotico è anche chiamato questo termine

descrive i vantaggi del mutualismo microbiota-ospite per i suoi membri individuali. In particolare,

solitamente si parla dei vantaggi generati dal microbiota per l’sopite.

disbiosi,

Lo stato di equilibrio stabile disbiotico è chiamato questo termine descrive uno stato

della comunità microbica che è stata alterata e che ha un rapporto causale con uno stato di

disfunzione o malattia. Un microbiota disbiotico è correlato ad una bassa biodiversità.

microbiota cutaneo

Descrivere il in termini di alfa e beta-diversità alfa-diverso,

Il microbiota cutaneo è uno dei microbiota associati al corpo umano più ossia è

costituito da molti taxa batterici poiché è a diretto contatto con l’ambiente. In particolare, le fosse

antecubitali (interno del gomito), essendo una zona umida, sono particolarmente adatte alla

crescita di microrganismi, in particolare di quelli ambientali.

La super cie cutanea si può distinguere in tre aree principali in funzione delle loro caratte