Dosaggi ormonali

Materiali biologici su cui effettuare analisi qualitative e quantitative

1. Neonati

2. Bambini

3. Maschi adulti

4. Femmine adulte

5. Gravidanza

6. Popolazione geriatrica

Materiali biologici:

• Sangue
• Urine
• Feci
• Liquido sinoviale
• Liquor
• Liquido amniotico
• Latte
• Liquido seminale
• Lacrime
• Sudore
• Succo gastrico
• Saliva
• Succo duodenale
• Biopsie villi coriali
• Liquidi biologici speciali (ascitico, pleurico, bronchiale, intestinale, peritoneale)

Metodologie altamente sensibili e specifiche per concentrazioni ormonali:

10^-10 - 10^-7 M-12

Struttura chimica

Attendibilità di un metodo analitico:

Precisione: Capacità di dare valori concordanti durante una serie di misure sullo stesso campione. L'imprecisione di un dato analitico si quantifica attraverso:

SD: deviazione standard media

CV% = SD/ x 100

Accuratezza: Capacità di dare valori vicini al "valore vero" di concentrazione dell'analita.

Specificità: Capacità di distinguere tra

l'analita e sostanze interferenti. E' uno dei fattori che determina l'accuratezza.

SENSIBILITA' Capacità di determinare piccole quantità di analita nel fluido biologico in esame. Il limite di rivelabilità si indica come il doppio della SD del bianco o come S/N =5.

imprecisa inaccurata precisa accurata

Valore vero

Classificazione dei metodi analitici

Metodi definitivi: Metodi che, per le loro caratteristiche intrinseche, hanno fonti di inaccuratezza nulle. (GC/MS)

Metodi di riferimento: Metodi che hanno fonti di inaccuratezza trascurabili rispetto alla imprecisione e vengono validati per confronto con i metodi definitivi

Metodi di routine: Metodi che hanno caratteristiche di facilità, velocità di esecuzione e costi compatibili con l'uso routinario e sono routine validati per confronto con i metodi di riferimento

I diversi tipi di metodi analitici

Metodi di tipo Sfruttano peculiari caratteristiche

chimico-fisiche dell'analita per determinarne la concentrazione

Necessitano di appropriati sistemi di purificazione del campione biologico

Metodi

• Sfruttano la specificità della reazione antigene-anticorpo per il riconoscimento dell'analita nel fluido biologico
• Sfruttano l'elevata sensibilità ottenibile mediante l'uso di opportuni marcatori (radionuclidi, enzimi, sostanze fluorescenti) per determinarne la concentrazione
• Misurano l'attività biologica dell'ormone e non la sua concentrazione (binding assay, radioreceptor assay)

Metodi di tipo chimico-fisico

• Sfruttano peculiari caratteristiche chimico-fisiche dell'analita per determinarne la concentrazione
• Assorbanza ad una determinata lunghezza d'onda
• Colorazione
• Fluorescenza dell'analita
• Reattività dell'analita (ossidazione, capacità di formare derivati facilmente rivelabili)

Necessitano di appropriati

Sistemi di purificazione del campione biologico ed è indispensabile l'uso di standard

Standard per la curva di calibrazione (analita puro)

Standard interno (molecola con caratteristiche chimico-fisiche molto simili all'analita)

Dosaggio di steroidi in GC/MS/ID

La tecnica in gas-cromatografia/spettometria di massa in diluizione isotopica è quella più utilizzata per lo sviluppo di metodi definitivi per piccole molecole.

Questa tecnica presenta infatti caratteristiche di notevole specificità. Il detector è uno spettrometro di massa ed ogni molecola possiede un suo specifico spettro di massa: informazioni sul peso molecolare e sulla struttura chimica dell'analita.

Sensibilità dovuta alla tecnica S.I.M. (selected ion monitoring) nella quale lo spettrometro è focalizzato su un singolo ione caratteristico dell'analita.

Precisione dovute alla possibilità di utilizzare come standard interno l'analita stesso marcato con

isotopi stabili

ACCURATEZZA

Gas-cromatografo spettrometro di massa

Sistema di iniezione

Sistema di separazione

GC SCAN

Spettro di massa

Sorgente SIMionica

Analizzatore quadrupolare

Sistema di Selected Ion Chromatogram

rivelazione degli ioni Total Ion Chromatogram

Confronto (analisi di regressione) tra metodo RIA e metodo GC/MS per la misura del testosterone

R=0.89

Esiste una certa discrepanza tra i due metodi (risultati con vari RIA sono in media del 46% superiori a quelli con GC-MS)

Tajeb et al, 2003

Metodi immunochimici

Sfruttano la specificità della reazione antigene-anticorpo per il riconoscimento dell'analita nel fluido biologico

Sfruttano l'elevata sensibilità ottenibile mediante l'uso di opportuni marcatori per determinarne la concentrazione

Radionuclidi RIA

Enzimi EIA

Sostanze fluorescenti FIA

Sostanze chemiluminescenti CLIA

Marcatura sull'anticorpo

Marcatura sull'antigene

Anticorpi

Gli anticorpi sono proteine della classe delle immunoglobuline.

La classe più comunemente usata è quella delle immunoglobuline G: IgG. Essi vengono prodotti dalle cellule del sistema immunitario di un organismo in risposta alla somministrazione di sostanze estranee. Reagiscono legando in maniera specifica la sostanza e "sequestrandola".

Porzione variabile responsabile del riconoscimento dell'antigene

Porzione costante tipica di ciascun gruppo di immunoglobuline

Sono immunogene le sostanze con peso molecolare superiore a 5.000 (peptidi, proteine)

Le sostanze a basso peso molecolare per essere rese immunogene devono essere coniugate a proteine

Anticorpi policlonali

Anticorpi monoclonali

Caratteristiche degli anticorpi monoclonali

Vantaggi

• Specificità e affinità note e costanti

Svantaggi

• Potrebbero essere troppo specifici: difficoltà nel legare forme diverse dell'antigene

E' possibile

selezionare l'anticorpo Non sempre reagiscono con lacon la specificità desiderata proteina APuò essere prodotto in quantità Non formano precipitato in seguitoillimitata ed è semplice da purificare al legame con l'antigeneSono sufficienti piccole quantità di Tecniche di produzione piùantigene, anche impuro, per la loro sofisticateproduzione MarcatureIRMA RIA Il marcatore può essere unisotopo radiattivo inseritonell'antigene o nell'anticorpoH ; I3 125Questi metodi si sono sviluppatia partire dagli anni '60 e sonoancora oggi utilizzati.Il maggior problema è l'uso disostanze radiattiveELISA EIA Successivamente si sonosviluppati metodi in cui ilmarcatore è un enzima chereagisce con un substrato inEnzyme Enzyme Substrate+ grado di cambiare colore o+ emettere luce.Substrate Fosfatasi alcalinaPerossidasi horseradishB-galattosidasiMarcatureIl marcatore può essere una

molecola fluorescente

chemiluminescente

Metodi immunochimici competitivi

Nei metodi competitivi l'analita (antigene) viene misurato sfruttando la sua capacità di competere con l'antigene marcato nel legame con l'anticorpo.

In questo tipo di dosaggio maggiore è la concentrazione dell'antigene da dosare e minore sarà la quantità di antigene marcato che si legherà all'anticorpo.

Pertanto il segnale risulta inversamente proporzionale alla concentrazione dell'antigene da dosare.

Esempio TSH: questa sensibilità può non bastare per gli ipertiroidismi