Dosaggi enzimatici - Biochimica

AD INTERVALLI DI TEMPO

ENZIMA REAZIONE 

+ La reazione viene bloccata con

IN

SUBSTRATO acido, denaturanti delle proteine,

CORSO dell’enzima

calore, inibitori

 Il prodotto di reazione viene

quantificato con vari metodi

P-X metodi colorimetrici

a

2 FASE

a

1 FASE X

 Quantificazione con HPLC

E + S E + P

1 1 E Trasformazione in un composto

2 quantificabile colorimetricamente o in

altro modo (metodo accoppiato)

Metodi radioisotopici

METODI DIRETTI E INDIRETTI

 Metodi diretti applicabili quando:

- Il substrato o il prodotto hanno caratteristiche misurabili

- Si misura direttamente una caratteristica fisica associata

alla molecola

 Metodi indiretti consentono la misurazione della

concentrazione di [S] o [P] solo in seguito ad una reazione

chimica addizionale che determina la formazione di un

prodotto misurabile (es. colorimetrico)

I dosaggi accoppiati sono un esempio di saggio indiretto

METODI ACCOPPIATI



 Se una reazione A B catalizzata da E non è

1

apprezzabile con alcun metodo strumentale, è possibile

utilizzare una reazione enzimatica ausiliaria

 Le due o più reazioni enzimatiche accoppiate devono

possedere degli intermedi di reazione comuni

 Gli enzimi ausiliari (E2) devono essere purificati e la

reazione ausiliaria non deve essere limitante: V deve

m

essere grande e K piccola

m

 L’enzima oggetto di indagine (E1) deve essere presente in

quantità limitante

E + S ---> E + P (prodotto non rivelabile)

1 1

E + P ---> E + Q (prodotto rivelabile, colorato)

2 2 –

METODI ACCOPPIATI Esempio Glucocinasi

1° glucosio + ATP G6P + ADP

reazione GCK

 Problema: prodotti non rivelabili. Dovrei bloccare la reazione con

acido e separare i prodotti per cromatografia (molto indaginoso)

 Soluzione: è possibile accoppiare una seconda reazione (ausiliaria)

che trasformi un prodotto (intermedio) della reazione 1

2° G6P + NADP+ 6P-gluconato + NADPH

G6PDH

reazione

 l’enzima

G6PDH è ausiliario. La reazione può essere seguita

facilmente tramite assorbimento della luce a 340 nm da parte di

NADPH.

 Reazione ausiliaria non limitante: eccesso di reagenti

PRECAUZIONI NEI SAGGI ENZIMATICI

 Substrati, tamponi, ecc. di alta purezza

 Anche la preparazione enzimatica non deve contenere

composti che interferiscono col saggio

 L’enzima dovrebbe essere stabile

 Controllo di pH e temperatura

 nell’intervallo

La velocità deve essere costante

considerato (v )

0

 Reazioni accoppiate: enzima ausiliario puro e non

limitante, se possibile con K piccola e K alta

m cat

 Escludere/valutare la presenza di reazioni non

enzimatiche

METODICHE DI DOSAGGIO

 dell’attività

Metodi più utilizzati per il dosaggio

enzimatica:

- Spettrofotometrici (cromofori)

- Fluorimetrici (fluorofori)

- Luminometrici (fotoni)

- Radioisotopici (radiazioni)

- Immunochimici (anticorpi specifici)

– ATTIVITA’

TEST DEL LATTATO FISICA

 dell’intensità

La produzione di lattato è funzione del

lavoro muscolare

 Entro determinate velocità di corsa, il lattato viene

utilizzato da altre fibre muscolari, dal cuore e riconvertito

in glucosio dal fegato – ATTIVITA’

TEST DEL LATTATO FISICA

 Produzione massiccia dalle fibre bianche o veloci

che hanno un potere glicolitico anaerobico maggiore

 La quantità di acido lattico è inversamente

proporzionale al grado di allenamento

 In Medicina dello Sport, il test del lattato ematico è

una variabile da monitorare tanto quanto la

frequenza cardiaca

 l’ottimizzazione

Fornisce informazioni utili per del

programma di allenamento, studiato sulla base

delle caratteristiche metaboliche e funzionali

dell’atleta – ATTIVITA’

TEST DEL LATTATO FISICA

– ATTIVITA’

TEST DEL LATTATO FISICA

 Attività intense: la velocità di produzione del lattato

supera quella di riutilizzo con conseguente accumulo

dell’attività

plasmatico che porta ad un rallentamento

 La misurazione del lattato mediante prelievo di una

dell’orecchio

goccia di sangue dal lobo consente di

individuare la frequenza cardiaca in cui si raggiunge il

punto critico e il lattato si accumula

 ‘velocità

Tale velocità è detta di soglia’

– ATTIVITA’

TEST DEL LATTATO FISICA

 Misurare il lattato durante un test incrementale è il

modo migliore per valutare il livello di performance e

l’allenamento

programmare

 Se si affronta una corsa ad un ritmo troppo intenso, il

lattato prodotto non è metabolizzato e si accumula nel

sangue provocando acidosi

 L’atleta sarà costretto a interrompere lo sforzo o ridurne

l’intensità fino a che il metabolita tossico viene rimosso

 L’intensità di esercizio associata ad accumulo di lattato

viene definita soglia anaerobica

– ATTIVITA’

TEST DI MADER FISICA

 Concentrazione ematica di lattato è circa 0.8-1.0

mmol/l a riposo

 Soglia aerobica: 2 mmol/l (o aumento 0.5 mmol/l),

prevalentemente lipolitica (dimagrimento)

 Soglia anaerobica: 4 mmol/l (o aumento 2.0

mmol/l), 80-85% della frequenza cardiaca massima

 Soglia = sforzo fisico, espresso in velocità, watt,

frequenza cardiaca, al quale i muscoli producono 2 o

4 mmol/l di lattato

 Individuazione del ritmo di allenamento personale

– ATTIVITA’ FISICA

TEST DI MADER

4 mmol/l

2 mmol/l – ATTIVITA’

TEST DEL LATTATO FISICA

 Il test del lattato per misurare la soglia aerobica si può

misurare sia sul campo che in laboratorio

 In laboratorio generalmente si utilizza il tapis roulant

 Entrambe le misurazioni offrono vantaggi e svantaggi

– ATTIVITA’

TEST DEL LATTATO FISICA

 Regole da rispettare prima del test:

1. Non effettuare allenamenti intensi il giorno prima

2. Alimentazione adeguata

3. Riscaldamento precedente

4. Ergometro adeguato allo sport praticato