Domande e risposte di Biochimica delle trasformazioni alimentari

Proteine

Limiti dei metodi per quantificare le proteine in un campione

- Kjeldahl non distingue l’azoto proteico dall’azoto non proteico, non è veloce, non è automatizzabile, richiede l’uso di reagenti pericolosi come l’acido solforico e la soda e richiede fattori di conversione specifici per il materiale alimentare analizzato.

- Dumas è costoso e non distingue l’azoto proteico da quello non proteico e richiede fattori di conversione specifici per il materiale alimentare analizzato.

- Spettroscopia NIR precisione e accuratezza <5%, necessità di uno strumento specifico per il materiale alimentare in esame, necessità di far ruotare lo strumento in caso di un campione solido eterogeneo perché il fascio di radiazioni è molto sottile e potrebbe non investire tutte le superfici del campione, producendo quindi un risultato falsato.

- Spettroscopia UV il campione deve essere necessariamente in soluzione, la risposta dipende dalla composizione della proteina (il metodo sfrutta la capacità dei doppietti elettronici degli aa aromatici e dei legami peptidici di assorbire la luce UV con un picco rispettivamente a 280 e 220 nm), lo strumento è sensibile alla presenza di interferenti e si potrebbero verificare delle sovrapposizioni tra gli spettri di assorbimento delle proteine e degli anelli eterociclici degli acidi nucleici (picco simile).

Su cosa si basano i dosaggi delle proteine che utilizzano dye-binding?

Il metodo dye-binding si basa sulla capacità di alcuni coloranti come il blu di Coomassie di cambiare il proprio spettro di assorbimento (shift ipercromico) quando legati ad una proteina mediante interazioni idrofobiche. In particolare, questo colorante passa dal verde al blu (molto intenso). Il dosaggio è insensibile alle interferenze, se non alla presenza di micelle di detergente che potrebbero nascondere al loro interno delle porzioni idrofobiche con cui il colorante andrebbe a interagire, sovrastimando il risultato. Per ovviare a questo inconveniente, si lavora in ambiente acido e in presenza di MetOH, anche per migliorare la solubilità del colorante stesso.

Vantaggi dei metodi per analisi alimentari basati su NIR

Uno dei vantaggi principali della spettroscopia NIR è che le analisi possono essere condotte sia in trasmittanza sia in riflettanza: quindi si può investire il campione con un fascio di radiazioni che vengono poi separate nelle diverse componenti una volta emerse dal campione oppure si può scomporre il fascio prima di inviarlo sul campione, per poi quantificare la luce riflessa. Inoltre, questi metodi consentono di analizzare simultaneamente le diverse componenti di una miscela, senza la necessità di preparare il campione né utilizzare alcun tipo di reagente, solvente o gas. Sono infine metodi non distruttivi che non producono alcuno scarto e sono applicabili a campioni solidi, liquidi o semi-liquidi.

Implementare una semplice ed economica strategia sperimentale per seguire la maturazione di una caciotta

Seguire la maturazione di un formaggio come la caciotta significa seguire gli eventi proteolitici che interessano il formaggio. A questo scopo, si può sfruttare la capacità di un agente caotropo come il TCA di far precipitare selettivamente proteine e peptidi di dimensioni via via più piccole, al crescere della propria concentrazione. Per questo tipo di analisi, si aggiunge il 15% di TCA per dedurre agevolmente la quantità di peptidi che si sono formati durante la maturazione del formaggio in esame. Usando il TCA, si riescono quindi a separare le proteine dagli altri componenti solubili, dai peptidi e dagli altri composti azotati di piccole dimensioni, al fine di poter poi quantificare le proteine con un metodo basato sull’azoto totale.

Come si può capire se una proteina analizzata con SDS-page ha formato ponti S-S?

Si possono usare B-mercaptoetanolo, DDT (però costa di più) o le fosfine per rompere i S-S: se a seguito di una seconda corsa elettroforetica una banda che si era separata poco si è separata nettamente in 2 bande, significa che precedentemente erano 2 peptidi uniti da un S-S.

Elencare i tipi di cromatografia di affinità

La cromatografia di affinità si basa sulla capacità delle proteine di stabilire delle interazioni specifiche con la matrice cromatografica che è sempre polare (agarosio) e dotata di pori molto grandi (per non discriminare le proteine in base alle loro dimensioni). Tuttavia, si distinguono diversi tipi di cromatografia di affinità in base al supporto che viene montato sulla matrice:

• Supporti generici AMP e coloranti (sepharose blue/nichel-NTA/arsenico)
• Composti metallici e HIS-tagged protein (imidazolo)
• Scambio di disolfuri
• Anticorpi

Quali metodi si possono usare per sapere se in un succo di frutta sono ancora presenti proteine allergeniche?

Per individuare eventuali proteine allergeniche in succo di frutta, si possono sfruttare i dosaggi immunochimici quantitativi:

• Dot-blot
• Western-blot
• Elisa sandwich

Perché le proteasi –SH dipendenti non funzionano in presenza di agenti ossidanti?

Un gruppo –SH in presenza di un agente ossidante formerà un legame S-S con un altro gruppo –SH libero e la formazione di un ponte disolfuro non consente il funzionamento dell’enzima.

Quali informazioni forniscono le misure di solubilità differenziale?

Le misure di solubilità differenziale forniscono informazioni circa lo stato di aggregazione delle proteine in un determinato sistema, dove possono interagire mediante legami ionici, idrofobici o ponti disolfuro: quindi, consentono di capire quali interazioni stabilizzano il sistema.

Perché l’adsorbimento su una resina idrofobica richiede alte concentrazioni saline?

L’adsorbimento di una proteina su una resina idrofobica richiede alte concentrazioni saline (alta forza ionica), al fine di favorire la rimozione dell’acqua di solvatazione che normalmente ricopre le regioni idrofobiche esposte dalle proteine, ovvero creare una situazione di competizione per il legame con la matrice idrofobica tra gli ioni e le proteine de-solvatate.

Su quale combinazione di metodologie si basa l’approccio proteomico?

L’approccio proteomico si basa su una prima separazione delle proteine mediante IEF (in base alla loro carica), seguita dall’elettroforesi 2D che consente la separazione esclusivamente in base al PM delle proteine. Dopodiché, si effettua un’analisi dell’immagine per trasformare le informazioni del tracciato elettroforetico in dati quantitativi:

• Si isolano le specie di interesse per riduzione e alchilazione.
• Si disidrata il campione e lo si idrolizza con tripsina ad alta specificità di taglio.
• Incubazione.
• Si estraggono i peptidi e li si analizza mediante spettroscopia di massa per scoprire la sequenza della proteina di partenza.

Amido

Quali meccanismi sono implicati nella retrogradazione dell’amido?

La retrogradazione è il processo tale per cui nell’amido gelatinizzato una parte delle catene di amilosio che sono passate in soluzione tornano ad interagire tra loro mediante legami H, per effetto degli scambi di acqua con le proteine presenti nel medesimo sistema. Infatti, durante il raffreddamento che segue il riscaldamento idrotermico, le proteine tornano a solvatarsi sottraendo acqua all’amido che in parte riacquisisce quindi la propria struttura cristallina. Questo processo comporta un ulteriore aumento della viscosità della soluzione, proprio per effetto della ricostituzione – seppur parziale – della struttura cristallina.

Cosa differenzia B- e a-amilasi?

Le a-amilasi sono endoenzimi che idrolizzano i legami a-1,4 all’interno della catena lineare di amilosio, da cui si staccano le destrine. Le B-amilasi sono invece esoenzimi che idrolizzano i legami a-1,4 a partire dall’estremità non riducente della macromolecola, da cui si liberano unità di maltosio (2Glu).

Perché si aggiunge idrossido di Ca prima dell'idrolisi enzimatica di amido?

Per migliorare la stabilità termica delle a-amilasi e creare un ambiente alcalino a pH 6.5.

Polisaccaridi non amido

Come si spiega la diversa solubilità a freddo delle 3 famiglie di carragenani?

- K-carragenani (25%) poco sostituiti, formano gel fragili e sono solubili a caldo.

- I-carragenani (38%) molto sostituiti, sono solubili già a 40-45° e formano gel soffici, elastici e reversibili ma solo in presenza di Ca che faccia da ponte tra le cariche negative dei gruppi solfato.

- λ-carragenani (46%) estremamente sostituiti, sono solubili a freddo e se formano gel questi sono molto molli.

La diversa solubilità delle 3 famiglie di carragenani è dovuta al diverso grado di sostituzione dato dai gruppi solfato che sono gruppi carichi in grado di interagire con molecole polari come l’acqua: quindi, maggiore è la quantità di gruppi solfato presenti sulla molecola minore è la T necessaria per solubilizzarla.

Come è possibile modulare le proprietà dei gel formati da alginati?

Le proprietà dei gel di alginato possono essere modulate giocando sul pH e aggiungendo degli ioni: infatti a valori di pH superiori al pK dei carbossili, questi si dissociano consentendo la formazione del gel solamente in presenza di Ca. In particolare, più Ca si aggiunge più è forte il gel. Con il pH bassi si ha azione viscosizzante.

Cosa rende diverse le pectine a diverso grado di metilazione?

Le pectine ad alto e basso metossile si distinguono per:

• Caratteristiche di polarità e di carica
• Range di pH in cui solubilizzano
• T di gelificazione

In particolare, le pectine ad alto metossile sono più idrofobiche e molto meno cariche di quelle a basso metossile che hanno invece molta carica e sono molto idrofiliche: infatti le pectine ad alto metossile sono più ricche di funzioni apolari. Inoltre, le pectine a basso metossile hanno un ampio range di pH in cui possono essere usate, mentre quelle ad alto metossile sono solubili in un range di pH molto ristretto (acido) e formano gel solo ad alte T (rimangono gel anche in cottura).

Quale fattori determinano la viscosità di una soluzione di polisaccaridi?

La viscosità di una soluzione di polisaccaridi è determinata dalla capacità di interazione con l’acqua (maggiore è l’interazione maggiore è la viscosità).

Quali sono gli zuccheri semplici presenti nelle gomme alimentari?

Le gomme alimentari sono polisaccaridi solubili e non digeribili, composti da Glu, Gal, mannosio in diverse proporzioni:

• Gomma di carruba Gal ogni 3-4 residui di mannosio
• Gomma di guar Gal ogni 2 residui di mannosio
• Carragenani Gal e anidro-Gal, con diverso grado di sostituzione con gruppi solfato
• Agar-agar agarosio (lineare) e agaropectina (ramificata e con gruppi solfato)
• Alginati acido mannuronico e acido galatturonico
• Gomma di xantano acido galatturonico ogni 2 residui di mannosio

Lipidi

Quali caratteristiche molecolari impartiscono alla lecitina le sue proprietà emulsionanti?

Le proprietà emulsionanti della lecitina derivano dall’equilibrio tra le porzioni apolari (2 code idrofobiche degli AG) e le porzioni polari (testa polare che a qualunque pH ha una carica positiva e una negativa, quindi neutra) e dalle sue proprietà colligative che lo rendono in grado di interagire sia con molecole idrofobiche che idrofiliche.

In che modo il trattamento con enzimi influenza la percezione di alcuni aromi?

A partire dai TG e con l’utilizzo di lipasi, è possibile ottenere AG a corta catena responsabili di note aromatiche come l’acido butirrico e l’acido capronico. Si ha però una diversa percezione in base alla loro concentrazione, in quanto rispondono a due diversi tipi di recettore. In particolare, a basse concentrazioni (ng) entra in gioco un recettore ad alta affinità che produrrà nell’organismo una sensazione gradevole; a concentrazioni maggiori (μg) invece il sensore precedente.

Micronutrienti

In che modo alcuni componenti degli alimenti possono limitare la biodisponibilità di metalli?

Negli alimenti, si possono trovare dei componenti in grado di sequestrare metalli, rendendoli non più disponibili. Un esempio sono i polifosfati, responsabili dell’impossibilità di assorbire il Ca introdotto con la dieta. Utilizzati in passato con lo scopo di trattenere l’acqua nel prodotto alimentare (solitamente formaggi fusi), oggi sono stati sostituiti con altri agenti meno sequestranti, come l’acido lattico o citrico. Un meccanismo analogo di chelazione del Ca interessa i fitati, contenuti per esempio nei cereali integrali: quindi accompagnando un prodotto seppur ricco in Ca (yogurt) con un prodotto integrale (cereali) ricchi in fitati, quest’ultimi non rendono disponibile il Ca per l’assorbimento. Infine, l’EDTA sequestra una grande quantità di minerali, ma è anche un antiossidante in quanto sequestra i metalli responsabili della reazione di Fenton.

Quale frazione della dose raccomandata di Na si assume bevendo 1 L d’acqua allo 0.01% di Na?

Dose raccomandata di Na = 1.5 g/die. 1 L di acqua = 1000 g (densità 1 g/cm³)(0.01/100)*1000 g = 0.1 g di Na in 1 L di acqua. 0.1 g/1.5 g = (1/10)/(15/10) = 1/15 è la frazione di Na assunta con 1 L di acqua allo 0.01%.

Qual è la concentrazione fisiologica di NaCl nel plasma?

9 g/L

In che modo la pompa Na/K contribuisce alla formazione del potenziale di membrana?

La pompa Na/K mantiene il potenziale di membrana (differenza di potenziale tra i 60 e i 90 mV tra l’interno e l’esterno della membrana cellulare) mediante l’espulsione dalla cellula di 3 ioni Na⁺ a fronte di 2 ioni K⁺ introdotti, contro gradiente di concentrazione (è un sistema di trasporto attivo ATP-dipendente). Questo spostamento di ioni comporta uno sbilancio di carica tale per cui all’esterno della cellula la carica è positiva, mentre all’interno è negativa.

A quali importanti funzioni biologiche sono associati metalli come Mo, V e W?

Mo, V e W sono fondamentali per l’organicazione dell’azoto atmosferico che coinvolge i batteri azotofissatori e le piante: i primi ossidano l’NH₃ a nitriti e poi a nitrati che sono la forma con cui le piante assorbono l’azoto dal terreno. Le piante poi riducono il nitrito a nitrato e quest’ultimo a NH₃ che a sua volta diventa prima GLU e poi GLN, gli aa attraverso i quali l’azoto atmosferico entra nella catena alimentare. In particolare, la rottura del triplo legame dell’azoto molecolare è catalizzata dalla nitrogenasi che ha come cofattore un composto contenente oltre al Fe anche Mo, V e W. Anche la nitrato e la nitrito-reduttasi usate dalle piante contengono ancora Fe, Mo, V e W: in particolare, la nitrato-reduttasi delle piante è molto simile a quella presente nell’organismo umano che contiene molibdopterina, un cofattore derivante dalla trasformazione di una vitamina e fondamentale per la sintesi dell’acido lipoico (a sua volta cofattore della piruvato e dell’isocitrato-deidrogenasi nel ciclo di Krebs).

Quali sono i ruoli biochimici del Se?

Il Se è contenuto nella glutatione-perossidasi (neutralizza l’H₂O₂ o altri perossidi a dare H₂O o l’alcol corrispondente mediante l’ossidazione di molecole di glutatione), nella ioduro-perossidasi (ossida lo ioduro a iodio a I₂ che sarà usato nella sintesi degli ormoni tiroidei T₃ e T₄) e nella deiodinasi (trasforma il T₃ in T₄).

Quali proteine contengono Zn nel loro sito catalitico?

SOD/carbossi- e ammino-peptidasi

Quali sono gli effetti dovuti ad un’alterazione del pH ematico?

• Modificazione dell’affinità dell’Hb per l’O₂
• Alterazione della capacità dell’albumina serica di trasportare gli AG ai vari tessuti
• Alterazione della funzionalità delle proteine di trasporto del Fe e dei fattori di coagulazione.

Se il pH ematico si alza alcalosi l’affinità dell’Hb per l’O₂ aumenta talmente tanto che l’O₂ non viene ceduto con conseguente condizione di ipossia dei tessuti. Se il pH ematico si abbassa acidosi.

Come avvengono l’acidificazione e l’alcalinizzazione nel tratto gastrointestinale?

L’acidificazione del bolo alimentare fino a pH=2.5 avviene nello stomaco, dove le cellule parietali secernono HCl. Gli ioni Cl- passano dal flusso sanguigno alla cellula in antiporto con uno ione HCO₃- che è stato a sua volta prodotto all’interno della cellula stessa, mediante la reazione tra la CO₂ e l’OH derivante dalla scissione di una molecola di H₂O. Il protone rimanente da questa scissione viene espulso dalla cellula nel lume gastrico in antiporto con uno ione K⁺, mediante un trasportatore di membrana ATP-dipendente. L’alcalinizzazione del bolo avviene invece grazie all’azione del succo pancreatico che ha pH=8. Le cellule pancreatiche lavorano con un meccanismo uguale e opposto al precedente: assorbono Na⁺ e Cl^- dal sangue in antiporto con ioni H⁺ e HCO₃-.

Come avviene la regolazione della concentrazione di Ca nell’organismo?

Nell’organismo, la concentrazione di Ca è regolata da due ormoni antagonisti:

• Calcitonina elimina l’eccesso di Ca, riducendone il riassorbimento a livello renale e intestinale
• Paratormone facilita l’assorbimento di Ca mediante la vit. D a livello intestinale, anche frenandone la perdita a livello renale e stimolandone il rilascio dal tessuto osseo.

Che ruolo svolge il Mg?

È il cofattore di tutti gli enzimi che usano nucleotidi e che lavorano quindi con un complesso ATP-Mg e regolatore della sensazione di sete.

Quali sono le funzioni della cobalamina (vit. B12)?

• Sintesi degli anelli tetrapirrolici che compongono la struttura eme nell’Hb
• Somministrata in dosi massicce in caso di avvelenamento da