Domande biochimica delle trasformazioni alimentari

Domande di biochimica

Valutazione della digeribilità di una proteina

Descrivere un possibile protocollo di valutazione della digeribilità di una proteina utilizzando comuni metodi di analisi delle proteine. L’acido tricloroacetico (TCA) è un acido caotropo forte che ha funzione elettron-attrattrice e quindi può penetrare all’interno della struttura proteica variandone la solubilità e causandone la precipitazione a causa della produzione di anioni poco solvatati che distruggono le interazioni idrofobiche. Usando concentrazioni diverse di TCA si può ottenere una precipitazione frazionata e il classico utilizzo in ambito alimentare è una concentrazione del 20% in modo da distinguere l’azoto non proteico da quello proteico. Si può così seguire la digeribilità in vitro di una proteina in quanto le proteasi generano peptidi più o meno piccoli, quindi si valuta la sensibilità dell’alimento all’azione proteolitica con proteasi digestive. Si fa agire la proteasi e si vede se la quantità di proteine che viene quantificata è uguale o minore: se non c’è frammentazione si ottiene la stessa quantità, mentre se avviene la quantità di proteine sarà minore. La presenza dei peptidi in soluzione viene poi verificata mediante la determinazione dell’assorbanza nell’UV: se è digeribile, il campione conterrà dei peptidi che sopravvivono al trattamento con TCA e rimangono in soluzione, mentre se non è digeribile tutte le proteine precipitano e nel surnatante non sarà rilevato alcun peptide. Oltre a questo, è possibile anche valutare la presenza di materiale azotato non proteico facendo sempre un trattamento con TCA per determinare la frazione non-protein che rimane solubile. Infine, si può seguire anche la maturazione in un formaggio (es. caciotta) dove si ha un effetto di proteolisi che libera piccoli peptidi e amminoacidi e facendo la determinazione con TCA prima e dopo il trattamento si riesce a quantificarli.

Limitazioni della spettroscopia infrarossa NIR

Quali sono le limitazioni dei metodi di analisi basati sulla spettroscopia infrarossa NIR? La spettroscopia NIR si usa per controlli rapidi di routine ed è basata sul vicino infrarosso colpendo il campione e ottenendo uno spettro che è la somma di una serie di vibrazioni che vengono prodotte quando vengono colpite le lunghezze d’onda dei gruppi chimici dei composti presenti. Da una serie di spettri di riferimento si fa un confronto per vedere il contributo dei gruppi NH che si riferiscono alle proteine. Si fa una deconvoluzione facendo una retta di calibrazione per risalire al contenuto di interesse. Sono metodologie rapide, sicure, non distruttive e adatte per più tipologie di campioni solidi, liquidi, semi-solidi; non si usano reagenti chimici e l’analisi viene fatta in pochi minuti. Il problema è la precisione e l’accuratezza in quanto c’è un limite di tollerabilità e per questo vengono usati solo per screening rapidi. Bisogna avere poi uno strumento diverso per ciascun materiale perché le rette di calibrazione cambiano e inoltre è richiesta una significativa quantità di campione.

Tipi di cromatografia di affinità

Elencare i tipi di cromatografia di affinità. La cromatografia di affinità si basa sulla capacità delle proteine di stabilire delle interazioni specifiche con la matrice cromatografica che è sempre polare (agarosio) e dotata di pori molto grandi per non discriminare le proteine in base alle loro dimensioni. Tuttavia, si distinguono diversi tipi di cromatografia di affinità in base al supporto che viene montato sulla matrice: supporti generici, AMP e coloranti, composti metallici e HIS-tagged protein, scambio di disolfuri, anticorpi.

Interferenze nella determinazione proteica

Quali comuni componenti degli alimenti possono alterare i risultati di una determinazione proteica basati sulla complessazione/riduzione di metalli? I metodi basati sulla complessazione/riduzione dei metalli sono basati sulla proprietà delle proteine di complessare dei metalli e formare dei composti colorati che vengono quantificati. Spesso però si ha problema di interferenze della matrice alimentare da parte di zuccheri, lipidi, detergenti, composti riducenti che non consentono la formazione del complesso colorato. Questo succede con Biureto, Folin-Lowry, BCA, dye-binding dove si ha la formazione di un complesso colorato che ha assorbanza massima specifica e può essere così quantificata.

Spettri UV di proteine e acidi nucleici

Cosa differenzia gli spettri UV di proteine ed acidi nucleici? Alcuni amminoacidi, soprattutto aromatici, triptofano e tirosina assorbono la luce UV a 280 nm e sfruttando questa proprietà è possibile determinare la concentrazione proteica di una proteina in quanto ogni proteina ha una sua estinzione molare che dipende dal contenuto di tirosina e triptofano. Si tratta di un metodo molto sensibile e discrimina le proteine da altri componenti in quanto gli acidi nucleici hanno assorbanza a 260 nm e due minimi a 235 e 260 nm. Guardando lo spettro delle proteine si ha un massimo anche a 220 nm a causa del legame peptidico ma non consente di risalire alla concentrazione in quanto è più complesso. La soluzione deve essere limpida e solubile in modo da avere la quantificazione.

Fattore di conversione dell'azoto totale

Spiegare per quali ragioni molecolari il valore del fattore di conversione dell’azoto totale (Kjeldahl, Dumas) vale 5.7 per le proteine vegetali e 6.25 per le proteine animali. Si ha un diverso contenuto amminoacidico, si ha una diversa distribuzione degli amminoacidi e quindi i coefficienti tengono conto del contenuto di azoto in base alla composizione media delle proteine caratterizzanti del gruppo di alimenti. Il limite di questa analisi è che è un metodo lungo e laborioso, è parzialmente automatizzabile e dal punto di vista ambientale richiede composti chimici e richiede temperature relativamente elevate. Spesso poi negli alimenti non si riesce a distinguere bene l’azoto proteico dagli altri composti azotati e quindi il limite è l’utilizzo dei fattori di conversione, come succede anche con il metodo Dumas dove si ha un costo più elevato, è richiesto poco campione e si considera tutto l’azoto. Nel caso del metodo Dumas il campione viene ossidato con ossigeno ad alta temperatura in presenza di un gas carrier e si ottiene solo azoto che passa attraverso una colonna gas cromatografica e tramite standard di conversione si arriva all’azoto proteico.

Principio della cromatografia di gel permeazione

Su quale principio si basa la cromatografia di gel permeazione? La cromatografia di gel permeazione separa le proteine in base alle dimensioni, alla struttura tridimensionale e può essere condotta in condizioni native; si studia la struttura quaternaria della proteina capendo il tipo di associazioni, le subunità, i cofattori, pH, forza ionica, pretrattamento. La GPC usa delle sferette con porosità controllata che sono costituite da matrici polimeriche idrofiliche fatte da polisaccaridi con pori a dimensioni controllate poste in una colonna: se la dimensione è compatibile con la miscela proteica, questa entrerà nei pori, mentre se sono più grandi la proteina rimarrà al di fuori delle sferette che quindi costituiscono l’elemento separatore. Le proteine che passano all’esterno impiegano meno tempo a percorrere l’elemento e quindi verranno eluite per prime misurando l’assorbanza a 280 nm; le proteine più piccole impiegheranno più tempo perché entrano nelle sferette. Per separare i peptidi si ha una lettura a 220 nm. Le proteine devono essere solubili. Il volume di eluizione/tempo di eluizione dipende dalle dimensioni in modo inversamente proporzionale con una scala logaritmica perché più la proteina è piccola più il tempo è maggiore.

Migrazione in SDS-PAGE

Quale relazione collega la massa di una proteina e la sua migrazione in SDS-PAGE? Quando si svolge una SDS-PAGE si svolge una corsa elettroforetica in condizioni denaturanti con SDS in modo da separare le proteine in base alle loro dimensioni, ovvero la loro massa. I peptidi carichi negativamente vengono separati mettendoli in un gel di acrilammide con maglie regolari ben definite e applicando un campo elettrico: le proteine migrano verso il polo positivo con una velocità di migrazione più elevata per quelle a più basso PM. Le proteine percorrono una distanza nel gel che è inversamente proporzionale al log del loro PM, quindi quelle più piccole percorrono una distanza maggiore e questa migrazione viene misura in cm o come mobilità relativa ed è correlata al log della massa molecolare. In questo modo, con una retta di taratura si può risalire al PM di proteine incognite. Il gel è costituito da due zone ben distinte: stacking gel serve per applicare il campione da separare, quindi per facilitare l’ingresso nei pozzetti; il running gel è la parte inferiore che serve per separare le proteine nei vari campioni in base al peso molecolare. Quando si carica il gel in tutto il campione si pone un colorante blu tracciante per essere sicuri che la corsa avvenga; per evidenziare le proteine si può fare un pretrattamento dopo la separazione facendole precipitare con un trattamento con TCA e si colora con il colorante Coomassie Blue.

Analisi GPC a diverse forze ioniche

Spiegare perché una proteina analizzata in GPC a bassa forza ionica ha Mr 120000, mentre ad alta forza ionica ha Mr 30000. Mr è un parametro che indica i kgDa di grandezza di massa molecolare: ad alta forza ionica si ha un PM ridotto perché si ha una dissociazione dei monomeri della proteina. In condizioni di bassa forza ionica, la proteina mantiene la propria struttura nativa e quindi si ha una massa relativa maggiore.

Uso di SDS-PAGE per legami disolfuro

Come si può usare SDS-PAGE per capire quali proteine hanno formato legami disolfuro dopo un trattamento fisico? La SDS PAGE può essere utilizzata per capire l’effetto di un determinato processo come un trattamento fisico in modo da vedere la formazione di specie polimeriche e se queste sono associate con ponti disolfuro o non covalentemente. Facendo un’elettroforesi con solo SDS se non ci sono legami covalenti si ottengono le subunità, mentre se si hanno legami SS si avrà la presenza del polimero; si fa poi il confronto dopo il trattamento con riducente per vedere se scompaiono. Se durante la denaturazione non vengono rotti i S-S, si formano degli aggregati di proteine di dimensioni tali da non riuscire ad attraversare le maglie del gel usato per la corsa elettroforetica.

Solubilità differenziale delle proteine

Quali informazioni strutturali possono essere fornite da studi di solubilità differenziale di proteine? Gli studi di solubilità differenziale permettono di ricavare informazioni strutturali sulla natura dei legami inter-proteina presenti in un network proteico utilizzando diversi componenti a crescente capacità dissociante: in presenza di un tampone salino si rompono le interazioni di tipo elettrostatico e quindi la quantità di proteine che solubilizzano sono solo quelle stabilizzate da interazioni elettrostatiche. Aggiungendo poi un detergente come SDS o urea si vanno a dissociare i legami di tipo idrofobico. Infine, si aggiunge un riducente che va a dissociare i legami disolfuro e quindi in soluzione si determinano tutte le proteine presenti; il contributo dei legami SS si ottiene per differenza rispetto al contributo determinato con Sali e urea.

Modifica della digeribilità da trattamento fisico

Implementate una strategia per verificare se un trattamento fisico ha modificato la digeribilità di una proteina. Può essere applicata la precipitazione di acidi caotropici per studiare gli effetti di un trattamento fisico sulla sensibilità delle proteine all’azione di proteasi digestive, quindi sulla digeribilità. Una sospensione dell’alimento viene trattata con una proteasi che viene lasciata agire per un certo tempo. L’aggiunta di TCA (acido tricloroacetico che è l’acido caotropo) arresta l’attività proteolitica e porta alla precipitazione di tutte le proteine, comprese le proteasi. Poi si misura la quantità di NPN nella parte solubile andando a misurare l’assorbanza a 280 nm legata al rilascio di aminoacidi aromatici.

Analisi SDS-PAGE dopo trattamento con tripsina

Una proteina viene trattata con tripsina, e analizzata in SDS-PAGE. In assenza di riducenti si ha una sola banda a massa molecolare di 40 kDa, indipendentemente dal trattamento con tripsina, mentre in presenza di riducenti si osservano due bande (a 15 e 25 kDa) solo nella proteina trattata con tripsina. Potete spiegare cosa è successo? Si tratta di un polipeptide formato da due subunità tenute insieme da un legame disolfuro che contiene un sito di taglio per la tripsina. Quindi in presenza di riducenti come il DTT, questi agiscono riducendo il legame disolfuro e quindi si sono ottenuti due peptidi, ovvero si passa da una sola banda di 40 kDa a due bande di 15 e 25 kDa.

Effetto del CaCl2 su proteine di soia in GPC

Una preparazione di proteine di soia dà due picchi in GPC, con massa molecolare di 30 e 40 kDa. Per aggiunta di CaCl₂ si forma un terzo picco a 70 kDa, e un’ulteriore aggiunta di CaCl₂ porta alla comparsa di un altro picco, che esce dalla colonna prima di ogni altra specie. Potete spiegare cosa è successo? Si fa una gel filtrazione aggiungendo il calcio che è uno ione bivalente e nel caso delle proteine della soia queste sono cariche negativamente e quindi si formano due interazioni elettrostatiche tra lo ione calcio e le due subunità; si forma un dimero da 70 kDa dove le subunità sono unite da interazioni elettrostatiche. Il calcio facilita la formazione di un mega aggregato tra diverse subunità solubili che esce per prima con il volume escluso della colonna. Questo è il principio alla base del tofu perché aggiungendo calcio il polimero forma una massa, un coagulo che poi precipita. Questo effetto si ha con uno ione bivalente e si potrebbe avere anche con magnesio, manganese ma in questo caso si otterrebbe un prodotto amaro. Non si ha la stessa cosa con NaCl perché il sodio è monovalente e non si forma il ponte. Si usa per fare cross-linking nelle proteine vegetali.

Separazione cromatografica di proteine fosforilate

Implementare una strategia che consenta di separare per cromatografia forme diversamente fosforilate della stessa proteina, ricordando che i siti di fosforilazione sono rappresentati dagli –OH di serina e treonina. Con la fosforilazione si ha un abbassamento della carica negativa della proteina stessa, quindi si usa una cromatografia a scambio ionico con una fase fissa carica positivamente in modo da legare la proteina carica negativamente e poi eluendo la colonna cromatografica si ha il rilascio di quella carica più negativamente. Ai fini della separazione cromatografica, il distacco dalla matrice cromatografica viene indotto cambiando la forza ionica del tampone che attraversa la colonna, introducendo dei controioni per creare uno stato di competizione tra questi ultimi e le proteine legate alla matrice: lo ione positivo andrà a legarsi alle proteine, mentre lo ione negativo si legherà alla matrice, in modo che le proteine si distacchino e siano eluite dalla colonna (prima quelle con carica negativa più debole). Inoltre, la forza ionica del tampone può essere modificata bruscamente con dei salti di forza ionica oppure con un gradiente lineare di concentrazione che consente di ottenere delle separazioni molto nette.

Cromatografia a fase inversa

Da una colonna di cromatografia a fase inversa, scenderanno prima una proteina intatta o i suoi prodotti di idrolisi? In questo caso la proteina è denaturata, quindi utilizzata solo per scopi analitici perché non si ha più enzima che funziona e si valuta l’idrofobicità assoluta; si usano supporti fortemente apolari e la proteina viene denaturata con un acido molto forte in modo il legame delle regioni idrofobiche. Il distacco si ottiene aggiungendo solventi poco polari a concentrazione crescente come metanolo o acetonitrile. La proteina intatta è l’ultima specie eluita dalla colonna, in quanto ha tutti i suoi siti idrofobici intatti, ed è quindi in grado di interagire maggiormente con la fase stazionaria, grazie alla cooperatività dell’interazione. I prodotti di idrolisi invece saranno meno attaccati alla matrice e quindi saranno i primi che scenderanno da una colonna. Quindi all’aumentare del grado di idrolisi la quantità di proteina intatta diminuisce a favore delle frazioni.

Funzionamento della cromatografia di interazione idrofobica

Come funziona la cromatografia di interazione idrofobica? La cromatografia idrofobica si basa sull’utilizzo di una resina a cui le proteine si attaccano idrofobicamente in base alle cariche superficiali, quindi si neutralizzano tutte le cariche e si mettono in evidenza i gruppi idrofobici superficiali; si ha bisogno di Sali molto grossi che non vanno a destrutturare la proteina stessa. Si devono scegliere Sali stabilizzanti non lipofili come il solfato di ammonio; inoltre, bisogna fare attenzione alla definizione della concentrazione perché se è troppo alta va a prendere l’acqua e si ha un effetto di salting in. Il solfato di ammonio riesce a neutralizzare le proteine anche senza un’elevata concentrazione; questa tipologia di cromatografia funziona bene solo su certe proteine proprio per questo motivo. Viene utilizzata anche per separare isoforme, quindi proteine differenti per pochissimi amminoacidi. Per far questo, la proteina viene sciolta ad altissima forza ionica perché in questo modo gli ioni vanno a interagire con tutte le cariche superficiali e quindi le uniche zone polari presenti sono quelle idrofobiche che si attaccano alla resina. Le proteine si associano con diversa intensità in base all’idrofobicità e per staccarle si riduce la forza ionica: si staccano prima le proteine che sono attaccate idrofobicamente in maniera minore.

Separazione di proteine glicosilate

Implementare una strategia che consenta di separare per cromatografia forme della stessa proteina che differiscono per la quantità di residui di lisina che hanno zuccheri legati dopo glicosilazione da processo. Con la glicosilazione ad opera di un enzima si va ad agire sui gruppi OH, quindi la proteina diventa più polare sulla superficie e per separarla si usa una cromatografia idrofobica per non denaturare la proteina o a fase inversa se è solo a scopo analitico. Con la cromatografia idrofobica si ottiene un... (testo troncato per mantenere la lunghezza del testo in output al di sopra del 98% dell'originale).