Domande Biochimica delle trasformazioni alimentari

Domande biochimica delle trasformazioni alimentari

Limiti dei metodi di analisi spettroscopica

Quali sono le limitazioni dei metodi di analisi basati sulla spettroscopia infrarossa?

Le limitazioni del metodo NIR sono che è spesso utilizzato per rilevazioni rapide, come per l'accettazione delle materie prime. Inoltre, serve uno strumento differente per ogni matrice alimentare che si vuole trattare e la quantità di campione richiesta dal macchinario è consistente.

Interferenze nella determinazione proteica

Quali comuni componenti degli alimenti possono alterare i risultati di una determinazione proteica basati sulla complessazione/riduzione di metalli?

I componenti che possono interferire con le tecniche di complessazione con metalli possono essere zuccheri, lipidi, detergenti e composti non riducenti.

Spettri UV di proteine e acidi nucleici

Cosa differenzia gli spettri UV di proteine e acidi nucleici?

Le proteine hanno due picchi fondamentali, a 220 nm per via dei legami peptidici e a 280 nm per la presenza di amminoacidi aromatici. Per quanto riguarda gli acidi nucleici, hanno un picco a 260 nm per via dei sistemi aromatici nelle basi azotate.

Valore del fattore di conversione dell'azoto totale

Spiegare per quali ragioni molecolari il valore del fattore di conversione dell'azoto totale (Kjeldahl, Dumas) vale 5.7 per le proteine vegetali e 6.25 per le proteine animali.

Per i metodi che vanno a valutare l'azoto totale di un composto bisogna sempre utilizzare un fattore di conversione tra la quantità di azoto e la quantità effettiva stimata di proteine. Per ogni tipologia di proteine cambia tale fattore di conversione poiché la struttura amminoacidica tra proteine di differente tipo, come appunto ad esempio tra proteine vegetali ed animali, cambia per dimensione, gruppi R laterali se non per gli amminoacidi stessi che si possono ritrovare nella struttura proteica.

Cromatografia di gel permeazione

Su quale principio si basa la cromatografia di gel permeazione?

La cromatografia GPG è un metodo di separazione di proteine in base alla loro grandezza. Le proteine vengono mantenute nella loro forma nativa, il che consente un possibile recupero per eventuali saggi biologici. La matrice è formata da delle porosità che permettono alle proteine di piccole dimensioni di intrappolarsi all'interno della matrice ed essere rilasciate lentamente, mentre le proteine di dimensioni maggiori fluiscono con più facilità. Il risultato è che più una proteina fluirà velocemente, tanto più grandi saranno le sue dimensioni. Infine, si ha una misurazione alla base della colonna grazie alla tecnica UV.

SDS page e massa proteica

Quale relazione collega la massa di una proteina e la sua migrazione in SDS page?

Per quanto riguarda SDS-page, tanto più è ingombrante una proteina, tanto più lento sarà il suo cammino elettroforetico. Quindi, le proteine di grandi dimensioni si fermeranno prima rispetto a proteine di piccole dimensioni e peptidi, che invece arriveranno a percorrere delle zone più lunghe.

Effetto della forza ionica in GPG

Spiegare perché una proteina analizzata in GPG a bassa forza ionica ha Mr 120 000, mentre ad alta forza ionica ha Mr 30 000.

La proteina a bassa forza ionica fluisce come tale con massa pari a 120 000, mentre in condizioni di alta forza ionica la proteina viene scissa in 4 monomeri, ognuno dei quali pesa 30 000 e viene rilevato dall'analisi.

Uso di SDS page per legami disolfuro

Come si può usare SDS page per capire quali proteine hanno formato legami disolfuro dopo un trattamento fisico?

Si può agire effettuando un'analisi precedente al trattamento e una subito dopo, così che se determinate bande non saranno più visibili significherà che si sono formati degli aggregati. Un altro metodo è quello di effettuare un'analisi dopo il processo dopodiché denaturare la proteina non solo con SDS ma anche con urea per andare a rompere gli eventuali legami S-S ed effettuare di nuovo l'analisi. Se si notano delle proteine di piccole dimensioni in più rispetto alla prima corsa, significherà che si sono formati degli aggregati a seguito del processo.

Studi di solubilità differenziale delle proteine

Quali informazioni strutturali possono essere fornite da studi di solubilità differenziali di proteine?

Gli studi di solubilità differenziale, tramite l'utilizzo di sali non denaturanti, poi detergenti e poi urea, vanno a rompere rispettivamente i legami ionici, elettrostatici e covalenti che sono presenti in un network proteico. Grazie a questa tecnica si possono quindi andare a solubilizzare man mano differenti proteine e quantificare le varie tipologie di legame che stabilizzano un network.

Modifica della digeribilità proteica

Implementare una strategia per verificare se un trattamento fisico ha modificato la digeribilità di una proteina.

Si sfruttano enzimi digestivi e si fanno agire sul substrato per verificare se esso viene attaccato efficientemente, ovvero che porti alla formazione di peptidi di dimensioni minori. Si va quindi a valutare tramite elettroforesi la formazione o meno di peptidi, e quindi di bande corrispondenti a PM minori. Dopodiché si effettua sul substrato il trattamento fisico e si lasciano agire una seconda volta gli enzimi e si effettua di nuovo la corsa elettroforetica. I risultati che si possono ottenere sono due: la proteina che prima non era attaccabile dagli enzimi, dopo il trattamento lo diventa e quindi la prima elettroforesi non evidenzia peptidi mentre la seconda sì, oppure il contrario ovvero che il trattamento fisico rende inaccessibile la proteina da parte degli enzimi digestivi e quindi la prima elettroforesi evidenzia la formazione di peptidi mentre la seconda no.

Effetto dei riducenti su proteine in SDS page

Una proteina viene trattata con tripsina e analizzata in SDS page. In assenza di riducenti si ha una sola banda massa molecolare di 40 kDa, indipendentemente dal trattamento con tripsina, mentre in presenza di riducenti si osservano due bande (15 e 25 kDa) solo nella proteina trattata con tripsina. Spiegare quello che è successo.

Il riducente aggiunto nella seconda analisi ha probabilmente denaturato la proteina da 40 kDa senza però idrolizzarla, ma esponendo i residui specifici per il taglio da parte di tripsina, così che dopo la reazione enzimatica la proteina venga scissa in due peptidi.

Effetto del CaCl₂ su proteine di soia in GPC

Una preparazione di proteine di soia da due picchi in GPC, con massa molecolare di 30 e 40 kDa. Per aggiunta di CaCl₂ si forma un terzo picco a 70 kDa, e un'ulteriore aggiunta di CaCl₂ porta alla comparsa di un altro picco, che esce dalla colonna prima di ogni specie. Spiegare quello che è successo.

Essendo il Ca, derivato da CaCl₂, uno ione bivalente si riesce a legare a due proteine fungendo da ponte. Infatti, le proteine da 30 e 40 kDa si uniscono formandone una singola da 70 kDa. Aggiungendo ulteriore CaCl₂ si riuscirà ad ottenere una proteina ancora più grande grazie all'unione di cluster proteici.

Separazione cromatografica di proteine fosforilate

Implementare una strategia che consenta di separare per cromatografia forme diversamente fosforilate della stessa proteina, ricordando che i siti di fosforilazione sono rappresentati dagli -OH di serina e treonina.

Essendo che le proteine fosforilate risultano presentare delle cariche negative maggiori rispetto a delle proteine non fosforilate, si potrebbe sfruttare un metodo che separa le proteine in base alla loro carica. Grazie al metodo di cromatografia a scambio ionico si potrebbe utilizzare un supporto carico positivamente, così che le proteine fosforilate si attacchino ad esso. Cambiando poi la forza ionica del sistema, grazie all'aggiunta di sali, si andrebbe man mano a staccare le proteine dalla meno fosforilata alla più fosforilata.

Ordine di eluzione in cromatografia inversa

Da una colonna di cromatografia a fase inversa, scenderanno prima una proteina intatta o i suoi prodotti di idrolisi?

Essendo che da una colonna di cromatografia a fase inversa si staccano prima le proteine che hanno un'interazione idrofobica minore con la matrice, in questo caso si staccano per primi i prodotti derivati dall'idrolisi poiché presenteranno un numero inferiore di residui idrofobici.

Funzionamento della cromatografia di interazione idrofobica

Come funziona la cromatografia di interazione idrofobica?

La cromatografia ad interazione idrofobica tratta le proteine in condizioni native, che abbiano dei residui apolari sulla loro superficie. Per prima cosa è importante annullare le cariche superficiali così che non interferiscano con il legame, tramite condizioni ambientali ad alta forza ionica. Dopodiché si abbasserà la concentrazione salina utilizzata in precedenza, per far comparire di nuovo le cariche superficiali delle proteine, facendole staccare in ordine inversamente proporzionale alla idrofobicità, quindi si staccheranno per prime le proteine con minori residui idrofobici.

Separazione di proteine glicosilate

Implementare una strategia che consenta di separare per cromatografia forme della stessa proteina che differiscono per la quantità di residui di lisina che hanno zuccheri legati dopo glicazione da processo.

Le proteine che subiscono una glicazione da processo risultano essere maggiormente polari rispetto alle proteine native. Si può sfruttare questa loro caratteristica andandole a separare in base al numero di residui glicati. I metodi che si potrebbero utilizzare sono la cromatografia a fase inversa e la cromatografia idrofobica. Nel primo caso si andrebbe a denaturare la proteina e si utilizzerebbero dei supporti fortemente apolari, nel caso in cui invece si vorrebbe mantenere la proteina in condizioni native si sfrutterebbe il secondo metodo grazie a dei supporti debolmente apolari. Nei due metodi le proteine più polari si staccano prima rispetto alle proteine meno polari.

Ordine di eluzione in cromatografia a scambio ionico

Da una colonna a scambio ionico (cromatografia a scambio ionico), uscirà prima mioglobina o met-mioglobina?

Mioglobina Fe²⁺ prima perché meno carica, met-mioglobina Fe³⁺ dopo perché più carica.

Enzimi della via glicolitica interagenti con AMP

Citare almeno tre enzimi della via glicolitica che siano, potenzialmente, in grado di interagire con AMP legato ad una matrice cromatografica, e spiegare le ragioni della scelta.

Esochinasi e fosfofruttochinasi sono chinasi poiché sono gli enzimi che vanno a fosforilare e defosforilare i componenti della via glicolitica e quindi sarebbero reattivi nei confronti di AMP, aggiungendo gruppi fosfato. Inoltre, la gliceraldeide-3-fosfato-deidrogenasi è reattiva nei confronti dell'AMP perché reagisce con NAD, che è composto dall'adenosina.

Uso dell'acetonitrile in cromatografia a fase inversa

Perché l'acetonitrile è il solvente organico più comunemente impiegato nella cromatografia a fase inversa?

Acetonitrile è il solvente organico più utilizzato per la cromatografia a fase inversa poiché presenta tutte le caratteristiche per un solvente ottimale a tale scopo. È miscibile con acqua, è trasparente nell'UV, è isocomprimibile e isorifrangente, ha calore di miscelazione nullo ed è privo di reattività.

Limite della cromatografia di interazione idrofobica

Qual è il più importante limite pratico della cromatografia di interazione idrofobica (effetto dei sali lipofili sulle proteine)?

Il limite della cromatografia idrofobica, per quanto riguarda la scelta dei sali, è relativo al fatto che la proteina per tale analisi deve rimanere nella sua forma nativa. Se si sceglie di utilizzare dei sali lipofili, essi avranno un effetto denaturante sulla proteina, esponendo le zone idrofobiche del core proteico, falsando i risultati dell'analisi. Solitamente si usa solfato d'ammonio che è un sale grosso e funziona a concentrazioni basse senza far precipitare le proteine.

Principi dell'elettroforesi bidimensionale

Su quali principi si basa l'elettroforesi bidimensionale?

L'elettroforesi bidimensionale unisce i due sistemi di divisione per carica (IEF) e per dimensione (SDS-Page). Prima di tutto si opera dividendo le proteine per carica in un supporto che presenta differenti gradi di pH, dove i vari residui si muoveranno finché non incontrano il pH pari al loro punto isoelettrico. Dopodiché si opera rendendo bidimensionale la divisione grazie ad un elettroforesi SDS-Page, che va a dividere le proteine per dimensione, così da evidenziare eventuali differenze tra proteine che hanno stessa carica ma dimensione differente.

Uso delle anfoline nel metodo IEF

Cosa sono le anfoline, e a cosa servono?

Le anfoline sono un gruppo di polimeri che presentano una forte eterogeneità di carica tra loro e un grande potere tamponante a pH pari al punto isoelettrico. Vengono quindi utilizzate per creare il gradiente di pH, dopo aver applicato un campo elettrico, sulla matrice del metodo IEF per la divisione per carica netta delle proteine.

Uso di detergenti non ionici o urea nelle separazioni IEF

Perché si usano detergenti non ionici o urea nelle separazioni IEF?

Nel metodo IEF, l'utilizzo di detergenti ionici, ovvero carichi, potrebbe andare ad interagire con i residui carichi delle proteine, schermando quindi le loro cariche e non permettendo una efficace divisione. L'urea invece andrebbe direttamente a denaturare la proteina esponendo dei residui che primariamente erano all'interno della struttura proteica, falsando la separazione.

Ipotesi sulla presenza dei "trenini" nei tracciati 2D-E

Provate a formulare un'ipotesi per la presenza dei cosiddetti trenini nei tracciati 2D-E presentati negli esempi. Un trenino è fatto da molecole con massa simile (ma non uguale), che però differiscono per il loro punto isoelettrico.

Per proteine come le caseine e le gliadine si può riscontrare, nei tracciati 2D-E, la formazione di trenini. La motivazione principale è che per una stessa proteina possono esserci dei polimorfismi dati da modifiche post-traduzionali delle stesse, come ad esempio la fosforilazione delle caseine, il che cambia la carica in maniera eterogenea all'interno di una stessa famiglia di proteine e quindi cambiare leggermente il punto isoelettrico della proteina, ma mantenendo pressoché lo stesso peso molecolare.

Produzione di ioni molecolari in uno spettrometro di massa

In che modo possono venir prodotti gli ioni molecolari da analizzare in uno spettrometro di massa?

La generazione di ioni può avvenire in due principali metodi, in base alla natura del campione ovvero che sia volatile o meno. Nel primo caso si agisce con elettrospray (ESI) dove il campione viene mandato in campo ad alto voltaggio facendo sì che si trasformi in ioni gassosi carichi. Per quanto riguarda i campioni non volatili vengono ionizzati tramite ionizzazione laser (MALDI) dove si colpisce la matrice su cui è presente il campione con un raggio laser, il campione vaporizza, cede energia e protoni e viene ionizzato, co-desorbito sottovuoto e inviato all'analizzatore.

Uso dell'analizzatore TOF in associazione con MALDI

Perché un analizzatore Time of Flight è particolarmente adatto ad essere impiegato in associazione con un generatore di ioni di tipo MALDI?

L'analizzatore TOF può essere messo in correlazione solo a generatori di ioni ad impulsi, poiché le particelle devono passare singolarmente all'interno dell'analizzatore. Un generatore di tipo MALDI è quindi l'ideale per questo tipo di analisi.

Glicazione delle proteine durante la produzione del gelato

Una proteina di siero di latte ha massa 18.000 Da. Utilizzandolo come ingrediente per un preparato da gelato sottoposto a pastorizzazione nel suo spettro di massa compaiono picchi a 18.162 Da e 18.324 Da. Cosa è successo?

Durante il processo di produzione del gelato si sono formate delle proteine glicate, la prima da 18.162 Da ha subito una glicazione con un monosaccaride, mentre quella da 18.324 Da ha subito una glicazione con un disaccaride. (Peso proteina 18.000 Da, peso monosaccaride 162 Da, peso disaccaride 324 Da).

Posizionamento degli strumenti in spettrometria di massa

Perché negli strumenti computerizzati si mette sempre il TOF dopo il quadrupolo, e mai viceversa?

Si utilizza prima il quadrupolo per poter analizzare una specie alla volta. Infatti, le specie entrano una per volta nel quadrupolo, gli ioni vengono frammentati e vengono mandati nel TOF per eseguire l'analisi.

Approcci MudPIT e Shotgun nella proteomica

In che cosa si differenziano gli approcci MudPIT e Shotgun dalla proteomica tradizionale?

Questi due approcci, rispetto alla proteomica tradizionale, vanno a eliminare tutte le fasi di separazione precedenti all'analisi, avendo solamente una separazione preliminare dei peptidi in RP-HPLC.

Trasferimento su matrice per Western Blotting

Perché è necessario trasferire le proteine in un gel SDS-Page su una matrice prima di un'analisi tramite Western Blotting?

Il motivo per cui si fa il trasferimento su superficie idrofobica è perché gli anticorpi risultano avere una dimensione troppo grossa per entrare tra le maglie dell'SDS-Page, ed individuare gli antigeni.

Tipi di dosaggio ELISA

Commentare le differenze che intercorrono tra i diversi tipi di dosaggio ELISA.

Il dosaggio ELISA viene effettuato con due principali metodi, ovvero quello competitivo e quello non competitivo. Il dosaggio non competitivo viene utilizzato per molecole grosse e idrofobiche, nel caso del metodo diretto dove il campione che potenzialmente contiene l'antigene viene legato al pozzetto per poi essere intercettato dall'anticorpo, e per molecole che contengono almeno due epitopi il metodo sandwich, dove al pozzetto è legato l'anticorpo, viene aggiunto il campione e vengono aggiunti altri anticorpi che andranno a legarsi all'antigene potenzialmente presente nel campione. Questi due metodi hanno una risposta, data da una variazione causata da un enzima presente sull'anticorpo, che cresce al crescere della concentrazione dell'antigene. Nel caso dell'ELISA competitivo si hanno degli antigeni da valutare piccoli, non in grado di legarsi al pozzetto. Vengono aggiunti al pozzetto degli antigeni noti, dopodiché verranno aggiunti contemporaneamente anticorpi e campione. Il metodo è competitivo poiché risulterà esserci competizione di attacco tra gli anticorpi e gli antigeni inseriti volontariamente e quelli presenti nel campione. Il risultato decresce al crescere nella concentrazione dell'analita poiché dopo l'aggiunta di anticorpi e campione il pozzetto viene lavato e ciò che rimane sono gli anticorpi che non si sono legati al campione.

Caratteristiche degli epitopi

Quali caratteristiche distinguono epitopi sequenziali da epitopi conformazionali?

L'epitopo è una frazione di antigene...