Biochimica delle Trasformazioni Alimentari - Lezioni e Domande (con Risposte) MAGISTRALE A.A. 2016

BIOCHIMICA DELLE

TRASFORMAZIONI ALIMENTARI

BIOCHIMICA DELLE TRASFORMAZIONI ALIMENTARI

LEZIONE 1

PROTEINE NEI PRODOTTI ALIMENTARI

Sono il materiale più interessante in quanto negli alimenti svolgono la funzione di enzimi e

quindi sapere cosa succede alle proteine nel corso di un processo alimentare è di grande

importanza.

La presenza/assenza di certe proteine determina le caratteristiche della:

trasformabilità del materiale alimentare (condizione che una certa materia prima

1) alimentare sia utilizzabile oppure no, per una certa trasformazione).

Conseguenze sul valore nutritivo.

2) Conseguenze dirette sulla salute umana.

3)

Un altro aspetto di rilevanza (oltre alla presenza/assenza) è la quantità con cui le proteine

sono presenti.

1) a. C’e/non c’è PRIMA > suitability della materia prima (è adatta al processo che

voglio attuare?)

Es. caseine, ce ne sono di diversi tipi, espresse da alleli differenti. Differenza genetica

(c’è un certo gene in una certa razza di mammiferi oppure non c’e) oppure differenze

nel processo di maturazione del trascrizione primario (in tutti gli eucarioti nel DNA ci

sono delle parti che sono importanti in quanto contengono informazioni fondamentali

per la proteina e delle parti che invece non lo sono; il trascritto primario viene preso, in

un processo che si chiama “maturazione trascritto primario” e vengono rimosse le parti

che non centrano in modo che restino solo le parti codificanti). Il processo di

maturazione può avvenire in modo diverso in diverse specie.

Un esempio sono le caseine della capra, abbiamo la presenza/assenza di una certa

componente e se questa componente è assente noi avremo un latte insensibile

all’azione del caglio (no formaggio); questo latte, in cui non abbiamo proteine in grado

di aggregare e di fare il formaggio, lo possiamo termizzare (latte pastorizzato da bere).

Se la caseina invece c’è, il formaggio sono in grado di farlo, mentre nel latte

pastorizzato le proteine aggregano con facilità (forma sulla parete del pastorizzatore

delle croste di proteine).

Quindi presenza/assenza di alcune proteine ne condiziona il successivo processo.

b. C’e/non c’è DOPO. Come si fa a sapere il trattamento termico subito dal latte?

Perossidasi, fosfatasi alcalina, livelli residui di siero proteine. Quindi noi possiamo

utilizzare la presenza/assenza di questi componenti come marcatori di processo (se un

latte è stato termizzato poco sarà ancora per ossidasi positivo; se è stato trattato un po’

di più inizierà ad andar via la fosfatasi; quando invece è stato maltrattato mancano sia

fosfatasi e per ossidasi ma anche le siero proteine. 2

2) VALORE NUTRITIVO, dipende da due cose:

- Gli AA presenti (soprattutto quelli essenziali, danno valore alla proteina). Non basta

però che questi AA siano presenti, devono essere anche disponibili.

Es. Bianco d’uovo (ovoalbunina, proteina più abbondante nel bianco d’uovo, è una

serpina, ovvero inibitore delle proteasi a serina, ovvero tutte le proteasi del tratto

digerente superiori fino al duodeno; cuocendo l’uovo però il processo elimina l’attività

di inibizione esercitata da questa proteina e prende questa proteina che nella sua

struttura nativa è compatta, grazie a legami disolfuro che la tengono unita,

trasformandola in un”gomitolo disteso”, piu facile da digerire e con anche più facile

accesso agli AA idrofobici, che solitamente sono nascosti in questa struttura, come

tirosina, fenilalanina, valina, metionina, isoleucina e triptofano.

Il processo in questo caso aumenta la loro digeribilità.

Le serpine non sono l’unico esempio di componete antinutrizionale. Altro esempio di

proteina con stessa azione è la avidina, che sequestra la biotina.

3) EFFETTO SULLA SALUTE:

- ci sono delle proteine che sono tossiche per tutta la popolazione (tossine batteriche,

botulino per esempio)

- allergeni (che si distinguono in topici, anche solo al contatto con la pelle o la respirazione,

o per ingestione, di origine animale, vegetale e m.o.). produzione di anticorpi.

- intolleranze (il meccanismo non è mediato da anticorpi); glutinopatie.

QUANTE PROTEINE?

Sapendo prima quante ne abbiamo posso decidere come sfruttarle.

Es. grano tenero e grano duro;

Il grano duro, più ricco in proteine (14%), utile per fare la pasta o per pani caratterizzati da

una elevata elasticità, mentre il grano tenero (10%) per pane e biscotti.

Quindi la quantità di proteine determina il tipo di utilizzo.

Es. il latte viene valutato in base al quantitativo di proteine (maggior è il numero di

contenuto di proteine e prima avviene la coagulazione). La velocità di questa reazione è

funzione ennesima (esponenziale) della concentrazione di proteine. Più ce ne ho e piu è

facile e veloce, meno ce ne ho e meno avviene facilmente.

Dal punto di vista pratico ogni industria ha la necessità di standardizzare la sua produzione,

quindi di sapere quanta proteina c’è nel latte che sta utilizzando in modo tale da avere

processi con tempistiche ben definite.

Quindi standardizzerò il contenuto di proteine in modo tale da averlo sempre uguale per i

processi in cui sarà impiegato. 3

METODI PER LA QUANTIFICAZIONE DELLE PROTEINE

- METODO DELLA MINERALIZZAZIONE/ KJELDAHL.

Si prende una certa quantità di campione, si fa bollire in ac. Solforico e tutto l’azoto

organico presente si trasforma in ammoniaca (fase di mineralizzazione), poi si aggiunge

soda e si libera ammoniaca in forma gassosa, la distillo in acido borico e misuro quanto

acido è rimasto libero. Ottengo un contenuto in azoto totale del mio campione, moltiplico

per un fattore (6,25 prot. Animali e 5.25 per le vegetali) e ottengo il contenuto in proteine.

La parte negativa del metodo è che non distingue (urea, acidi nucleici, ammine derivate da

processi di putrefazione o proteine vere) l’azoto organico. Non discrimina l’origine

dell’azoto.

Inoltre richiede un quantitativo ingente di campione e che il metodo è di difficile

applicazione.

- METODO DI DUMAS.

Abbiamo del materiale organico, composto da carbonio, idrogeno e azoto, a temperature

elevate (900°C) con presenza di opportuni catalizzatori, l’azoto organico presente nel

sistema diventa azoto gassoso. Per sapere quanto ce ne si prende la miscela di gas e si

passano su due assorbitori, uno che assorbe acqua e uno CO2, vengono trattenuti; esce

solo azoto alla fine, che grazie alle sue caratteristiche di conducibilità termica, si ottiene un

picco di azoto.

Uno svantaggio è quello di non distinguere se quello è azoto proteico o azoto non proteico.

Vantaggio è che funziona con quantità basse di campione, è automatizzato e affidabile.

Come si fa a distinguere l’azoto proteico da quello non proteico?

In un materiale alimentare potremmo avere la classica miscela di Sali azotati (come solfato

d’ammonio o urea), piccoli peptidi e delle vere e proprie proteine. La differenza tra i piccoli

peptidi e le proteine è che le proteine in genere hanno 20 AA in su, i peptidi 20 AA in giù.

Per distinguere si sfrutta l’insolubilità delle proteine in presenza di alcuni acidi: acido

perclorico, acido tricloroacetico (TCA) e acido sulfosalicinico. Tutti sono acidi forti e lipofili

(penetrano nelle strutture proteiche, anche nelle zone idrofobiche rompendo le interazioni

elettrostatiche nascoste all’interno della struttura. Vengono chiamati acidi caotropi.

Se ne metto poco precipitano le proteine grosso, mettendone di più anche quelle più

piccole. Quindi giocando sulla concentrazione dell’acido che aggiungo posso anche

differenziare peptidi grossi da piccoli o proteine grosse da piccole.

Latte metto TCA al 10%, ho un precipitato e un surnatante. Posso misurare quanto azoto

c’e nel surnatante (e sarà azoto non proteico), quello che è precipitato è proteico. 4

- ALTRO METODO DETERMINAZIONE AZOTO (Infrarosso)

Sfrutta l’assorbimento del legame peptidico nella regione dell’infrarosso. Ha una capacità

di assorbire la luce infrarossa (lunghezza d’onda elevate), fa vibrare gli atomi coinvolti nel

legame peptidico e l’energia viene assorbita dal campione. L’energia che occorre per far

vibrare è posizionata in specifiche regioni dello spettro infrarosso. Dove c’è presente la

proteine l’assorbimento aumenta in una specifica regione dello spettro. Si misura la

quantità di luce che viene riflessa (utile per quei prodotti come carne, pane etc.., prodotti

solidi, che non è possibile misurare quanta ne assorbe o la oltrepassa, ma bensì quanta

viene riflessa).

Limitazione è quella di essere specifico per un certo tipo di proteine e non è molto

accurato. Vantaggio è quello di distinguere le proteine ed è molto rapido. 5

LEZIONE 2

Metodi che permettono di capire a livello di laboratorio cosa sta succedendo nei nostri

prodotti alimentari, molto sensibili.

Due tipi:

-colorimetriche

-spettrofotometriche

Richiedono una quantità di campione modestissime (nanogrammi) e una strumentazioni

semplice, poco costosa e di rapida risposta (spettrofotometro).

-Una metodologia sfrutta la capacità di alcuni ioni metallici come il rame di formare

complessi colorati con le proteine o di andare incontro ad un processo di riduzione da

Rame 2+ a +1, se incontra proteine in ambiente alcalino.

-Le proteine hanno regioni idrofobiche, sono in grado di associarsi in modo stabile con

altre molecole idrofobiche (i coloranti) e di modificare le caratteristiche spettrali di questi

coloranti.

- METODO BIURETO

È un composto (il biureto) che in ragione della presenza di funzioni azotate è in grado di

coordinare un atomo di rame. Pensando alle proteine abbiamo un sistema molto simile e

in ambiente estremamente alcalino (es. soda 20%, pH 14), i gruppi di molti AA, come la

tirosina, cisteina, si dissociano e diventano dei fortissimi riducenti; come risultato, questa

molecola con lo ione rame coordinato con la proteine viene ridotto a rame +1. Questo

rame nella forma rameosa (+1) forma un complesso molto più colorato (rosso) che di

quello formato dal rame +2 (azzurro).

Si prende quindi una proteina, la si scioglie in soda, si aggiunge la soluzione di qualche sale

di rame solubile in ambiente alcalina e se c’è una proteina diventa rosso, se non c’è rimane

azzurro. Si misura quindi l’assorbimento della luce a 540 nm (verde, colore complementare

al rosso).

La quantità di colore che si forma è proporzionale al numero di legami peptidici che ci sono

nel sistema. È insensibile alle dimensioni della proteina.

Svantaggio è che non è molto sensibile (1-100mg/ml).

Per aumentare la sensibilità si utilizza un reattivo basato sull’acido fosfotunstico (o

fosfomolitico).

Se quindi riduco il rame da rame +2 a +1, posso usare il rame ridotto generato per farlo

reagire con l’acido fosfotunstico. Polimerizza e da dei composti dal colore blu molto forte

(con assorbimento nella regione spettrale equivalente al rosso, 750 nm). Aumenta la

sensibilità di quasi 20 volte (50 microgrammi/ml).

Ci sono comunque alcune difficoltà nell’applicazione.

Il metodo si basa sulla riduzione dell’acido fosfotunstico a queste forme polimeriche

dotate di un alto assorbimento del colore blu. Molto spesso nei campioni però sono

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presenti anche altre sostanze riducenti, che non è soltanto il rame che deriva della

reazione con le proteine, ma sono alcuni AA, come la tirosina, triptofano, cisteina,

polifenoli (tutti composti che si ossidano con estrema facilità).

Si usa quindi il TCA, che separa le proteine dai polifenoli e dagli AA, per poi sciogliere in

soda, facciamo la reazione del biureto e mettiamo l’acido fosfotunstico.

- ALTRO METODO COLORIMETRO

Si basa sulla capacità di alcuni coloranti di reagire stabilmente con le proteine, attraverso

una associazione tra le parti idrofobiche presenti nella proteina e il colorante.

Quando il colorante interagisce con la proteina cambia il suo colore (da rosso a blu) e

diventa molto più colorato. Si è spostato il suo spettro di assorbimento. Questi due eventi

sono chiamati shift-ipercromico (spostamento con aumento dell’intensità della

colorazione).

È proporzionale alla quantità di proteine.

Non ci sono reazioni chimiche, è un metodo insensibile alle tutte le sostanze possibilmente

presenti ad eccezione dei detergenti, che formano delle micelle che esponendo al solvente

l’acqua, nasconde al suo interno le sue porzioni idrofobiche. In questa porzione idrofobica

del detergente si può infilare il colorante e quindi provoca un falso shift-ipercromico

(anche se nessuna proteina è presente).

Per ovviare a ciò si deve lavorare in ambiente estremamente acido (acido fosforico) e in

presenza di etanolo (che minimizza la formazioni di strutture micellari).

Un altro problema è che il colorante si lega alle porzioni idrofobiche delle proteine, ma non

tutte le proteine sono idrofobiche allo stesso modo. Con proteine molto piccole e molto

cariche, si rischia di avere una sottostima.

Come standard dobbiamo avere una proteina che imiti il comportamento delle proteine

che sto usando.

Costruisco una curva di taratura utilizzando l’albumina di siero bovino BSA (che ha una

composizione bilanciata in AA e ricca in zone idrofobiche).

- QUANTIFICAZIONE DELLE PROTEINE CON SPETTOFOTOMETRO/ULTRAVIOLETTO.

Tutte le proteine chi tanto chi poco contengono AA aromatici (triptofano, fenilalanina e

tirosina), che hanno la peculiarità di assorbire la luce nell’ultra violetto, quindi avranno dei

picchi di assorbimento molto intensi nella regione spettrale dell’ultravioletto (280 nm).

È un sistema molto sensibile, ma richiedono strumentazioni complesse e le proteine

devono essere pulite (no latte che è torbido per es.); se ho un sistema in cui soni presenti

altri componenti, come gli acidi nucleici, potrebbero falsare la lettura.

Quindi serve per determinare se un prodotto va bene per un processo da attuare o che

cosa ha fatto un certo processo al mio prodotto. 7

DIMENSIONI DELLE PROTEINE

QUALI PROTEINE? (Se c’è/non c’e; presente in forma nativa o no) (quanti AA ha)

- SDS PAGE (sodio-dodecil-solfato policrilamide gel elettroforesi)

L’elettroforesi su gel di policrillammide in presenza di detergenti (solitamente il sodio-

dodecil-solfato SDS).

1. Per primo si prende la proteina e si denatura. Ovvero si mettono nel SDS e di un tiolo (2-

mercato-etanolo). Il 2-mercato-etanolo riduce i legami disolfuro (due cisteine unite da un

legame disolfuro tornano ad essere due cisteine differenti). Il SDS ad alta temperatura( si

fa bollire per 10 minuti e si aggiunge anche un colorante, il blutirolofenolo, di colore blu,

ma se il pH è sbagliato diventa giallo; si aggiunge anche il glicerolo, che aumenta la densità

del sistema) si attacca a tutte le superfici idrofobiche presenti nella proteina, anche a

quelle che sono attaccate ad un'altra proteina.

Quindi otteniamo una specie di scopino, in cui l’anima (la parte in ferro dello scopino) è

rappresentata dalla catena polipeptidica della proteina, mentre le setole dalle molecole di

SDS (disposte con la coda idrofobica verso la proteina e la testa idrofilia rivolta verso

l’esterno).

Questi scopini hanno una carica uniforme (tutte hanno carica negativa), ma potranno

avere lunghezza diversa in base alla dimensione originaria della proteina.

2. Faccio passare questi scopini in una maglia polimerica con dei pori di dimensioni adeguate

a far si che tutti passino, ma che quelli più piccoli passino più velocemente di quelli grossi.

Per farli muovere devo applicare un potenziale positivo sotto.

La maglia deve essere idrofila (in modo tale che non leghi le proteine) e deve essere in

grado di controllare il grado di reticolazione (porosità). Come materiale si usa la acrilamide

e metilene-bisacrilamide che crea legami trasversali. Otteniamo un copolimero in cui le

catene lineari (formate dall’acrilamide) sono connesse con legami trasversali da metilene-

bisacrilamide.

Più le maglie saranno strette e più sarà difficile il passaggio di proteine.

Solitamente non si una solo un gel, bensì due: gel di impaccamento (staking gel) e il gel di

corsa (running gel). Poi abbiamo anche un tampone di corsa, che sta sopra e sotto il gel

(dove applichiamo la differenza di potenziale), che ha come specie mobile, un’AA, la

glicina.

Staking gel è una porzione ad alta porosità, con un tampone uguale a quello con cui ho

denaturato i campioni (cloruro come contro ione e pH basso, 6.6). Serve per far entrare le

proteine simultaneamente nel running gel

Il gel di corsa usa come contro ione il cloruro, a pH elevato. Se dobbiamo separare proteine

grosse e quindi con maglie larghe (quindi poca acrilamide e metilene-bisacrilamide).

Contrario per proteine piccole. Se voglio separare entrambe, applico un gel con un

gradiente di porosità (molto poroso in alto e poco poroso sul fondo). 8

Le proteine vanno nei pozzetti.

3. Applico la corrente; nel campione ci sono ioni cloruro (piccoli ed estremamente mobili,

carichi negativamente) e migrano verso il polo positivo; gli ioni cloro spingono le proteine

le une contro le altre, quindi in un gel a bassa porosità ho il fenomeno dello staking (si

impaccano in una banda piccola, il volume si riduce).

4. Quando le proteine entrano nel gel di separazione, quello che sta sotto (running gel),

entrano tutte insieme. Effetto isotacoforetico.

Quelle più piccole migrano più velocemente, quelle più grosse più lentamente.

Ogni proteina al termine dell’elettroforesi è migrata nel gel di separazione di una sostanza

che è funzione esponenziale reciproca del suo peso molec