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Formazione di aggregati tra proteine
Il fenomeno che avviene come esito finale di un trattamento termico è proprio la formazione di aggregati tra proteine. Questo dipende dalla facilità con cui una proteina denaturata incontra un'altra proteina denaturata. A concentrazioni basse, le proteine non si incontrano tra loro e quindi hanno i siti idrofobici esposti. Tanto più è alta la concentrazione proteica, tanto più è probabile che le proteine si incontrino e formino aggregati.
426) Come fareste a vedere se una modificazione strutturale (ad esempio, una variazione nello spettro di fluorescenza di TRP) è reversibile o irreversibile?
Quando una proteina subisce un trattamento denaturante, nella maggior parte dei casi raggiunge una fase intermedia in cui la proteina è detta transientemente modificata. In questa fase, se viene rimosso l'agente denaturante, la proteina è in grado di tornare alla struttura nativa. Quindi, per valutare se la modificazione strutturale è reversibile o irreversibile, è necessario rimuovere l'agente denaturante e osservare se la proteina ritorna alla sua struttura nativa.
La modificazione è reversibile o non lo è misuro la fluorescenza del triptofano. Dopo di che provo a rimuovere l'agente denaturante e misuro la variazione nello spettro di fluorescenza del triptofano. Se la fluorescenza della seconda misurazione è diminuita significa che la modificazione della proteina era reversibile, perché rimuovendo l'agente denaturante è tornata alla struttura nativa.
27) Quali parametri contribuiscono a definire "PSH", l'indice che esprime l'idrofobicità superficiale di proteine?
L'indice superficiale di idrofobicità delle proteine è il rapporto tra i siti presenti e la costante di dissociazione di questi siti (Fmax/Kd). Il numero di siti presenti (Fmax) si valuta aggiungendo un marcatore di fluorescenza in quantità saturante, esprime quante molecole di marcatore sono legate per unità di massa alla proteina, più siti idrofobici ci sono più vedo la fluorescenza.
La costante di dissociazione si trova calcolando il 50% dei siti presenti, quindi quando avrò metà dei siti occupati la concentrazione di marcatore libero è pari alla costante di dissociazione (Kd).
28) Commentare un esempio di variazione della stabilità di una struttura proteica in ragione della composizione dell'ambiente.
Un agente ambientale che modifica la stabilità di una proteina è il pH. Un esempio lo si può vedere nel processo di produzione dello yogurt. Se si abbassa il pH aumentano le cariche positive e diminuiscono le cariche negative, in questo modo le micelle di caseina interagiscono tra loro formando un gel, lo yogurt. Abbassando il pH si arriva al punto isoelettrico della caseina che diventa insolubile e si separa completamente dal siero. Per evitare che ciò avvenga dobbiamo evitare che si arrivi al punto isoelettrico, ci si ferma a un pH leggermente più alto, in modo che la caseina conservi un po' di carica.
così che possa trattenere un po' d'acqua: in questo modo si ottiene una struttura dello yogurt più compatta.
29) Cosa si intende per "conformero transiente" nel processo di denaturazione di una proteina?
Un conformero transiete, è il conformero di una proteina che è stata sottoposta ad un'agente denaturante, ma rimuovendo l'agente denaturante può tornare alla struttura nativa. Questa specie transiente viene ottenuta nello stato intermedio di denaturazione, spesso nei processi alimentari è di questo conformero che abbiamo bisogno. Un esempio tangibile è la maionese, in questo caso serve che le proteine dell'albume espongano le regioni idrofobiche in modo da stabilizzare l'interfaccia acqua-olio; se invece viene utilizzata una proteina totalmente denaturata le proteine si associano tra loro e non sono in grado di stabilizzare niente.
30) È più termostabile una proteina senza
modificazioni post-traduzionali, una proteina glicosilata, o una proteina fosforilata? In linea di massima le proteine glicosilate sono più stabili perché l'acqua nelle immediate vicinanze della proteina non è libera di muoversi. Lo zucchero lega l'acqua facendo legami idrogeno, mentre i fosfati fanno interazioni elettrostatiche con l'acqua. Nella pratica è più difficile modificare con temperatura una proteina glicosilata, non si può dare una risposta certa perché è difficile trovare una proteina sia in forma glicosilata che in forma fosforilata. I determinanti del processo di denaturazione e aggregazione non sono i gruppi glicosilati o fosforilati.
31) Perché il glicerolo viene spesso usato per stabilizzare enzimi commerciali? Il glicerolo stabilizza la struttura di una proteina perché (come il saccarosio) è una molecola organica che contiene più di una funzione alcolica. Gli ossidrili
Alcolici presenti in queste molecole interagiscono con l'acqua, rendendo meno efficace l'azione devastante che l'acqua ha sulla struttura delle proteine. La funzione più importante è quella di limitare l'azione devastante che l'acqua potenzialmente ha sui legami che stabilizzano una struttura proteica.
Perché un alimento trattato ad altissime pressioni isostatiche non cambia la sua forma? Perché la pressione è isostatica, è la stessa cosa che succede quando un sub fa immersioni ad elevate profondità. Essendo il sub fatto di liquido ed immerso in un liquido non c'è alterazione della forma perché la pressione è isostatica. L'unica cosa che si comprime nel sistema sono le porzioni gassose, nel caso in cui schiacciamo le porzioni di liquido attorno all'alimento che è anch'esso liquido la pressione si distribuisce uniformemente all'interno del mio.
A cosa è principalmente dovuto l'effetto di un trattamento ad altissime pressioni?
Comprimendo l'acqua con un'altissima pressione, perde la sua capacità strutturante: in questo modo si ha una denaturazione a freddo delle macromolecole che erano organizzate grazie alla spinta entropica dell'acqua. Il tutto avviene senza avere svantaggi in termini di accelerazione delle reazioni chimiche, che invece avrei a temperature elevate.
Cosa potreste osservare misurando la fluorescenza di una miscela di proteine e ANS durante un trattamento ad altissime pressioni?
ANS è un marcatore che diventa fluorescente solo quando adeso a una superficie idrofobica. Alzando la pressione si vede un piccolo aumento della fluorescenza. Se viene alzata ancora si vede che la fluorescenza si sviluppa più velocemente. Se si alza ancor di più si vede una scomparsa di siti idrofobici, perché si appiccicano l'uno all'altro rendendosi.
ma subisce una denaturazione parziale che comporta la perdita della sua struttura terziaria. Questo avviene perché le interazioni tra le regioni idrofobiche e i legami disolfuro vengono disturbate dalla pressione elevata. Tuttavia, una volta rimossa la pressione, la proteina è in grado di riacquistare la sua struttura nativa.Perché se la proteina si disavvolge, il volume che occupa è maggiore di quello della proteina nativa, quindi torna alla struttura originaria. Per la formazione di polimeri occorre che avvenga il disavvolgimento della regione ad alfa elica sotto il quale è posta la cisteina 121 (unica Cys libera, che può fare legami disolfuro), ad alte pressioni è difficile che quest'elica si sposti.
Provate a individuare le ragioni per cui la denaturazione di BLG trattata ad alte pressioni è reversibile, e quella di OVA non lo è.
La struttura di OVA e BLG è molto diversa, hanno dimensioni diverse (OVA è più grande). OVA è glicosilata e BLG no. C'è una differenza di stabilità tra le proteine: BLG ha il barile stabilizzato da 2 legami di solfuro e solo una regione ad alfa elica mobile, OVA è molto meno stabile di BLG. La BLG quando esposta ad alte pressioni espone un tiolo, ma una volta che interrompo
L'alta pressione il tiolo torna al suo posto. OVA è irreversibile, perché una volta che ho stirato le strutture ad alfa elica, non possono tornare al loro posto. Sono due proteine con diversa stabilità intrinseca e quando rendo l'acqua non in grado di esercitare la sua spinta entropica una proteina fa una modificazione reversibili (BLG) e l'altra no (OVA).
38) La forma "S" di ovoalbumina è generata da un trattamento termico ad elevato pH. Secondo voi, ne contiene di più l'albume crudo, quello pastorizzato, o quello in polvere ottenuto per essiccazione "spray drying"? L'uovo fresco ha un pH di 9,5, quando non è più tanto fresco ha un pH di circa 8, però non c'è nessun effetto della temperatura. L'albume pastorizzato ha un pH di circa 8 e viene trattato ad una temperatura di 62 °C. L'albume essiccato ha un pH di 8 e viene sottoposto ad un trattamento a
temperature molto elevate perché è necessario far evaporare tutta l'acqua, quindi sono quelle le condizioni più favorevoli alla generazione di "S" OVA. 39) E' appropriato inquadrare il trattamento con radiazioni ionizzanti nella famiglia delle modalità di "denaturazione fisica"? Le radiazioni sono un agente denaturante fisico, ma la denaturazione che impartiscono è una denaturazione chimica. Non si aggiungono agenti chimici ma si creano in seguito al processo che provoca la radiolisi dell'acqua, che genera radicale idrossilico e idrogeno con un solo elettrone. Ad esempio si possono generare sulfini e sulfoni aggiungendo ossigeno allo zolfo della cisteina, e se il trattamento è molto violento si possono rompere anche i legami peptidici. 40) A che cosa è dovuto l'effetto antigerminativo dei trattamenti con radiazioni ionizzanti? Le radiazioni ionizzanti vengono utilizzate per inibire latare con i tuberi e i bulbi, queste specie reattive possono causare la germogliazione precoce e indesiderata. Per evitare ciò, vengono utilizzati trattamenti specifici per inibire la germogliazione e prolungare la durata di conservazione dei prodotti. Uno dei trattamenti più comuni è l'utilizzo di sostanze chimiche come il clorpropham, che agisce inibendo la crescita delle gemme. Questo permette di mantenere i tuberi e i bulbi in uno stato di dormienza, ritardando la germogliazione. Un altro metodo utilizzato è l'applicazione di radiazioni ionizzanti, come i raggi gamma o i raggi X. Queste radiazioni danneggiano il DNA delle cellule germinali presenti nei tuberi e nei bulbi, impedendo la loro capacità di germogliare. Questo trattamento è sicuro per l'ambiente e per la salute umana, in quanto le radiazioni vengono utilizzate a dosi controllate e non lasciano residui nel prodotto trattato. Inoltre, l'utilizzo di atmosfere controllate durante la conservazione può contribuire a rallentare la germogliazione. Questo viene fatto regolando la temperatura, l'umidità e la concentrazione di gas come l'ossigeno e il biossido di carbonio all'interno delle camere di conservazione. In conclusione, la germogliazione dei tuberi e dei bulbi può essere controllata e ritardata attraverso l'utilizzo di trattamenti chimici, radiazioni ionizzanti e atmosfere controllate. Questi metodi consentono di estendere il periodo di commercializzazione dei prodotti e di garantire la loro qualità durante la conservazione.
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