Domande e risposte biochimica alimentare

Domande di biochimica alimentare

1. Cosa sono le "scleroproteine"?

È una classe di proteine stabilita dalla classificazione di Osborne del 1909, questa classificazione raggruppa le proteine in funzione del mezzo di dispersione. In particolare le scleroproteine sono di norma insolubili in tutte le soluzioni, non si sciolgono perché sono legate da una quantità enorme di legami covalenti pontedisolfuro, oppure legami covalenti formati facendo una base di Shiff. Sono un esempio di questa categoria le cheratine che costituiscono le unghie e i capelli.

2. Cosa si intende per "salting in" e "salting out"?

Quando aggiungo sale ad una soluzione aumento la forza ionica, all’aumentare della forza ionica migliora la solubilità delle globuline e anche le albumine, che erano già solubili a forza ionica 0, lo diventano ancora di più. Questo aumento di solubilità è dovuto al fatto che le proteine sono degli aggregati stabilizzati da attrazioni elettrostatiche. Aumentando la forza ionica, le cariche presenti sulle proteine non interagiscono più tra loro ma con gli ioni aggiunti alla soluzione. La fase di aumento della solubilità delle proteine al crescere della forza ionica è detta salting-in. Quando la forza ionica si alza troppo si ha un crollo della solubilità delle proteine: questa è la fase di salting-out. Il salting-out avviene perché aumentando la concentrazione salina, tutte le molecole d’acqua della soluzione sono impegnate nella solvatazione del sale e quindi viene meno l’azione strutturante dell’acqua, ciò determina l’esposizione e l’aggregazione di tutti i residui idrofobici determinando la precipitazione della proteina.

3. Presentare un esempio di gel stabilizzato da legami a idrogeno

Un esempio di gel stabilizzato da legami idrogeno è la gelatina di origine animale. Mettendo collagene in soluzione acquosa e portandolo a temperature elevate si rompono i legami idrogeno che tengono insieme la tripla elica. Se faccio raffreddare la soluzione ottenuta, si formano legami idrogeno tra il CO e NH del collagene, non si può riformare la tripla elica ma si forma un reticolo tridimensionale che ingloba acqua. Il reticolo ha una disposizione casuale ed è stabilizzato solo da ponti idrogeno, è una struttura reversibile perché scaldandola ritorna liquida.

4. Perché la solubilità di proteine è minima al loro punto isoelettrico?

Perché al punto isoelettrico la carica netta è pari a zero (il numero di cariche positive equivale a quello delle cariche negative) quindi non sono presenti cariche che si respingono, le proteine si possono avvicinare per formare aggregati insolubili. Il valore del pH corrispondente al punto isoelettrico sarà anche il valore per cui la proteina avrà il minor numero di cariche possibili, quindi la minor capacità di trattenere acqua.

5. Presentare un esempio di gel stabilizzato da legami disolfuro

L’uovo può diventare un gel perché all’interno contiene acqua che, quando solidifica, viene incorporata. L’albume dell’uovo è composto da ovoalbumina, ciascuna molecola di essa contiene 5 cisteine: 3 libere e 2 che formano un legame disolfuro. Alzando la temperatura è reso possibile lo scambio di disolfuri, i legami intra molecolari diventano intermolecolari, e vengono esposti i residui idrofobici che interagiscono tra loro appiccicandosi.

6. Lega più acqua una proteina che contiene 20 Glu e 80 Asn nella sua sequenza, oppure una che contiene 20 Asn e 80 Glu?

Lega più acqua la miscela contenente 20 Asn e 80 Glu, sono entrambi due amminoacidi polari, ma Asn non ha catena laterale carica, invece il glutammato ha una catena laterale polare carica. La proteina che lega più acqua è quella con più cariche, ammesso che il pH sia compatibile con l’esistenza di cariche.

7. Presentare un esempio di gel stabilizzato da ioni Ca²⁺

Il tofu è un gel stabilizzato da ioni calcio. Per la sua produzione si parte da un estratto proteico di globuline di soia, viene aggiunta una sorgente di calcio che va ad interagire con le abbondanti cariche negative presenti sulle proteine della soia. Le varie catene proteiche condividono ioni calcio bivalenti. Quello che si forma è quindi un reticolo stabilizzato da interazioni ioniche che incorpora acqua al suo interno, quindi è un gel. Le interazioni che lo stabilizzano non sono sensibili alla temperatura.

8. Quali caratteristiche strutturali o compositive fanno sì che le gliadine siano solubili solo in alcoli?

Secondo la classificazione di Osborne, appartengono alla classe delle prolamine. Si trovano solo nei cereali dove svolgono la funzione di proteine di deposito. Sono solubili solo in alcol perché sono composti molto apolari, composte da glutammina e asparagina. Hanno moltissimi amminoacidi idrofobici, quindi la possibilità che una proteina di questo tipo sia solubile in acqua è nulla, quindi è necessario un solvente più apolare per rompere le interazioni idrofobiche tra le proteine. Posso anche diminuire la spinta entropica dell’acqua utilizzando agenti caotropi o utilizzando una combinazione di temperatura e detergenti.

9. Come mai alcuni ioni hanno azione destrutturante?

Hanno azione destrutturante gli ioni che si solvatano poco in acqua o che non si solvatano per niente, questi riescono a penetrare nella cavità proteica stabilizzata da interazioni elettrostatiche, interferiscono con queste interazioni, facendo collassare la struttura della proteina.

10. Perché una eccessiva acidificazione dello yoghurt porta ad una separazione di fasi?

Perché abbassando il pH si arriva al punto isoelettrico della caseina, che diventa insolubile e si separa completamente dal siero. Per evitare che ciò avvenga dobbiamo evitare che si arrivi al punto isoelettrico, ci si ferma a un pH leggermente più alto, in modo che la caseina conservi un po’ di carica, così che possa trattenere un po’ d’acqua: in questo modo si ottiene una struttura dello yogurt più compatta.

11. Quale componente proteica della caseina è glicosilata, e in quale regione?

La K-caseina è ricca di residui glicosilati che sono esclusivamente posti nella porzione C-terminale, c’è quindi una netta separazione tra la parte idrofobica e idrofilica della proteina. La k-caseina si trova maggiormente nelle submicelle più esterne, quindi i residui glicosilati sono esposti all’esterno della micella di caseina.

12. Qual è la frazione di ligando associata ad una proteina, data una Kd pari a 1 mM, e una concentrazione di ligando e proteina entrambi pari a 2 mM?

Bisogna trovare PL:

2(2−) 21= (2 − ) = 1 = 1

13. Quali tipi di legami chimici si possono stabilire tra una proteina e un acido grasso?

Si può stabilire un’interazione elettrostatica, tra il gruppo carbossile dell’acido grasso e delle cariche positive presenti sulla proteina, oppure si può stabilire un’interazione idrofobica tra la catena idrocarburica degli acidi grassi e i residui apolari presenti nella struttura della proteina. Un caso esplicativo di queste interazioni tra acidi grassi e proteina è rappresentato dall’albumina serica, essa è organizzata in modo da avere un grande solco idrofobico al suo centro, che funge da sito di legame per gli acidi grassi.

14. Presentare un esempio di "denaturazione interfacciale"

Un esempio di denaturazione interfacciale è la schiuma, cioè un’emulsione in cui c’è un velo d’acqua che separa ambienti riempiti con gas. Il bianco d’uovo è largamente utilizzato in questi sistemi perché all’interno presenta due proteine glicosilate, l’albumina e l’ovomucoide. Montando il bianco d’uovo con una frusta incorporiamo aria in questa soluzione acquosa di proteine, il fatto che viene applicata un’azione meccanica vigorosa e intensa denatura le proteine, srotolandosi la proteina espone i suoi residui idrofobici, che si pongono verso la parte del sistema dove non c’è acqua, nel caso della schiuma la parte apolare è rappresentata dal gas. In questo modo è stato ottenuto un sistema costituito da bolle d’aria separate da una regione acquosa detta lamella, le lamelle si incontrano in regioni specifiche che si chiamano punti nodali. Questo sistema non è perfettamente stabile perché l’acqua delle lamelle evapora e causa la fuoriuscita di gas. Per fare durare di più la schiuma è necessario qualcosa che si leghi all’acqua rallentando la velocità di evaporazione, come ad esempio lo zucchero e il glicerolo. Nel caso dell’albume già la presenza dell’ovomucoide svolge le funzioni di zucchero e glicerolo, perché contiene molto zucchero ed è molto viscoso.

15. Perché una proteina si denatura in modo diverso sulla superficie di una gocciolina lipidica e di un solido idrofobico?

La proteina su una gocciolina lipidica subisce delle modificazioni significative perché una parte della struttura proteica penetra la fase apolare, espone i suoi residui idrofobici e perde il suo disavvolgimento. Il triptofano si sposta dal sito di quenching ed emette molta energia che si può misurare attraverso il fluorimetro. Nel caso di un solido, la proteina non penetra la fase solida, la proteina si denatura ed espone i suoi residui idrofobici, ma l’emissione di energia del triptofano che si è spostato dal sito di quenching è contenuta perché è comunque legato a qualcosa di idrofobico e non è esposto al solvente.

16. Quali indicazioni strutturali si possono ricavare dallo studio della fluorescenza dei residui di triptofano?

La posizione del triptofano è indice delle modificazioni strutturali di proteine. La fluorescenza intrinseca di proteine legata alla collocazione del triptofano dipende da solvente, pH, forza ionica, agenti caotropi e la struttura. Il triptofano normalmente si trova nel sito di quenching dove emette luce molto energetica, ma questa energia viene assorbita da altri amminoacidi come cisteina e arginina. Quando il triptofano si sposta dal sito di quenching emette molta energia che non viene assorbita dagli amminoacidi, questo è possibile misurarlo con un fluorimetro. Quindi grazie all’utilizzo di un fluorimetro possiamo valutare lo spettro di emissione del triptofano e valutare se la proteina è presente alla struttura nativa oppure è denaturata.

17. Quali fattori contribuiscono alla stabilità di una schiuma?

Per fare durare di più una schiuma è necessario aggiungere qualcosa che si leghi all’acqua e che ne rallenti l’evaporazione, questi possono essere ad esempio lo zucchero e il glicerolo. Il glicerolo essendo più viscoso dell’acqua rallenta lo scorrimento verso i punti nodali (punti di incontro tra le lamelle, cioè le regioni acquose che separano le bolle d’aria in una schiuma). Nel caso dell’albumina, l’ovomucoide, che è ricca di zucchero e molto viscosa, impedisce l’evaporazione dell’acqua e in secondo luogo impedisce lo scorrimento dell’acqua verso i punti nodali.

18. Fornite una spiegazione molecolare per la presenza (e la quantità relativa) degli ingredienti presenti in una maionese commerciale

La presenza di acqua è dovuta all’utilizzo di uova essiccate. Senape e zucchero sono utilizzati per una questione di gusto, lo zucchero serve anche a correggere l’acidità del limone o dell’aceto. L’EDTA è un chelante, evita che il ferro del tuorlo crei radicali liberi che ossidano i doppi legami degli acidi grassi. L’amido è l’ingrediente che fa da viscosizzante, cioè aiuta la stabilità dell’emulsione, ritardando il movimento delle goccioline lipidiche le une verso le altre. Se non c’è amido vuol dire che sono state utilizzate uova intere, l’albume durante la pastorizzazione denatura le sue proteine che esercitano la funzione viscosizzante. L’acido citrico è un chelante e l’acido ascorbico è antiossidante (entrambi presenti nel succo di limone).

19. Sulla base dei dati di immunoreattività presentati nelle slides, cercate di rispondere a chi vi chiede se un gelato sia meglio del latte fresco per un bambino sensibile a BLG

Quando BLG varca la mucosa si scatena una risposta immunitaria incontrollata in soggetti sensibili come i bambini. I bambini sono sensibili a BLG perché le loro cellule intestinali non sono ancora saldate e quando BLG riesce a passare tra queste viene attaccata da moltissime immunoglobuline. I frammenti di BLG sono pericolosi quando sono in emulsione, si formerebbero polimeri che vengono attaccati più facilmente dagli anticorpi. Quindi verrà scatenata una risposta immunitaria maggiore ed incontrollata nel caso del gelato, perché BLG è legata a particelle di grasso. Quindi per un bambino sensibile a BLG è meglio il latte fresco.

20. Sulla base dei dati di digeribilità presentati nelle slides, indicate quale di questi alimenti sia una miglior sorgente di cisteina

Nessuno di questi alimenti è una buona sorgente di cisteina. Le uniche proteine che contengono una significativa quantità di cisteina che sono le sieroproteine sono quelle che si denaturano quando noi prepariamo un’emulsione, quindi il gelato è una miglior sorgente di cisteina. La presenza dipende dal grado di lavorazione e dalla denaturazione delle uniche proteine che contengono quantità significative di cisteina (le sieroproteine).

21. Perché una proteina denaturata ad una interfaccia liquido-liquido e ad una interfaccia solido-liquido assumono strutture diverse?

Le modificazioni strutturali sono diverse, perché se ho una fase oleosa le porzioni idrofobiche della proteina penetrano all’interno della fase non acquosa. Se ho una superficie idrofobica solida queste regioni non penetrano all’interno del solido e continuano a toccare la proteina che si trova dall’altra parte. Quindi la conformazione della proteina è diversa a seconda che le regioni idrofobiche riescono a penetrare all’interno della fase apolare o siano costrette a rimanere sulla superficie.

22. Perché la digeribilità di una proteina ad un’interfaccia può cambiare in ragione delle dimensioni delle particelle nella fase non acquosa?

Se metto una proteina in presenza di particelle solide e vado a valutare la sensibilità alle proteasi. Se prendo una particella solida piccola e una sensibilmente più grossa, i prodotti di idrolisi che ottengo non sono gli stessi. La proteina si denatura quando vede la superficie idrofobica, il modo con cui interagisce dipende da quanta proteina ho e quanto è curva la superficie. Una proteasi che vuole tagliare la proteina lavora in modo diverso in base a come la proteina è attaccata alla particella. Se la particella è grande la proteina sarà completamente adesa ad essa, se la proteina è piccola no. Per questo motivo la dimensione delle particelle della fase non acquosa influenza l’azione delle proteasi.

23. Provate ad esprimere con parole vostre la differenza tra temperatura e calore

La temperatura indica lo stato termico di un corpo, cioè l’agitazione delle molecole che lo costituiscono. Il calore invece è una forma di energia che viene trasferita tra due corpi che si trovano a temperatura differente. Nel caso della denaturazione delle proteine è l’azione termica della temperatura, non del calore, ad operare una denaturazione fisica.

24. Commentare un esempio di modificazione covalente di amminoacidi indotta da un trattamento termico, illustrandone le possibili conseguenze.

La formazione di furosina è un esempio di modificazione covalente indotta dal trattamento termico, si forma per reazione tra l’ammino gruppo della catena laterale della lisina e uno zucchero riducente, comporta una perdita di valore nutrizionale e di digeribilità dell’alimento a causa della mancata accessibilità dell’amminoacido lisina che è bersaglio della tripsina nel tratto digestivo. La furosina è un marcatore di qualità, in quanto fa capire se l’alimento è stato sottoposto ad un trattamento termico troppo severo, il suo contenuto ha precisi limiti legali.

25. Perché la formazione di aggregati proteici in seguito ad un trattamento termico è funzione della concentrazione della proteina?

Perché il fenomeno che avviene come esito finale di un trattamento termico è proprio la formazione di aggregati tra proteine, essa dipende dalla facilità con cui una proteina denaturata incontra un’altra proteina denaturata. A concentrazioni basse le proteine non si incontrano tra loro e quindi hanno i siti idrofobici esposti, tanto più è alta la concentrazione proteica, tanto più è probabile che le proteine si incontrino e formino quindi aggregati.

26. Come fareste a vedere se una modificazione strutturale (ad esempio, una variazione nello spettro di fluorescenza di TRP) è reversibile o irreversibile?

Quando una proteina subisce un trattamento denaturante nella maggior parte dei casi raggiunge una fase intermedia, dove la proteina è detta transientemente modificata, in questa fase se viene rimosso l’agente denaturante la proteina è in grado di tornare alla struttura nativa. Quindi per valutare se la modificazione è reversibile o non lo è misuro la fluorescenza del triptofano. Dopo di che provo a rimuovere l’agente denaturante e misuro la variazione nello spettro di fluorescenza del triptofano.