Domande di biochimica delle trasformazioni alimentari

DOMANDE ESAME BIOCHIMICA DELLE TRASFORMAZIONI ALIMENTARI

1°LEZIONE

1. Descrivere un possibile protocollo di valutazione della digeribilità di una proteina utilizzando comuni

metodi di analisi delle proteine.

Un possibile protocollo di valutazione della digeribilità di una proteina prevede la simulazione della digestione con

pepsina e chimotripsina, endoenzimi per liberarne dei peptidi. Per visualizzare l’effettiva produzione di questi

peptidi dalla digestione delle proteine, si può aggiungere alla soluzione del TCA. Il TCA è infatti un agente caotropo

che, essendo poco carico e poco solvato, disordina la struttura dell’acqua facendole perdere la sua capacità

strutturante: quindi, l’acqua non può più penetrare nella proteina, le cui interazioni ioniche all’interno del core

idrofobico si indeboliscono. Per questa ragione, in presenza di TCA la proteina precipita mentre i peptidi rimangono

in soluzione. Centrifugando il sistema in cui è stata simulata la digestione, i peptidi rimangono in soluzione, mentre

le proteine ancora intatte precipitano nel fondello. La presenza dei peptidi in soluzione viene poi verificata mediante

la determinazione dell’assorbanza nell’UV. Quindi, se digeribile il campione conterrà dei peptidi che sopravvivono

al trattamento con TCA e rimangono in soluzione, mentre se non è digeribile tutte le proteine precipitano e nel

surnatante non sarà rilevato alcun peptide.

2. Quali sono le limitazioni dei metodi di analisi basati sulla spettroscopia infrarossa?

Le limitazioni dei metodi di analisi basati sulla spettroscopia infrarossa sono in termini di precisione e accuratezza,

di necessità di uno strumento diverso per ogni materiale ed in termini di quantità di campione richiesta. Per quanto

concerne la precisione del metodo, vi è uno scostamento del 5%. Un altro limite può essere l’adattamento dello

strumento alla fase del materiale: grassi o oli, funziona in trasmittanza; mentre solidi, l’assorbimento cambia a

seconda dell’angolo.

3. Quali comuni componenti degli alimenti possono alterare i risultati di una determinazione proteica basati

sulla complessazione/riduzione di metalli?

Tra i comuni componenti degli alimenti che possono alterare i risultati di una determinazione proteica basati sulla

complessazione/riduzione di metalli sono zuccheri tra cui il glucosio, lipidi, polifenoli, detergenti ed altri composti

riducenti.

4. Cosa differenzia gli spettri UV di proteine ed acidi nucleici?

Gli spettri UV di proteine ed acidi nucleici differenziano in quanto le proteine possono assorbire ad una lunghezza

d’onda massima di 280nm, mentre gli acidi nucleici di 260nm. Questa differenza permette di valutare eventuali

contaminazioni.

5. Spiegare per quali ragioni molecolari il valore del fattore di conversione dell’azoto totale (Kjeldahl,

Dumas) vale 5.7 per le proteine vegetali e 6.25 per le proteine animali.

Le proteine vegetali sono ricche di aminoacidi con molto azoto (glutammina, asparagina), che a parità di peso

permettono di stoccare molta più proteina che acqua poiché sono molto meno polari in quanto non posseggono

una carica negativa. Il fattore di conversione per le proteine vegetali è 5,7, mentre per le proteine animali è 6,25. Le

proteine dove il fattore di conversione è minore, contengono maggiore azoto. La differenza tra i due fattori di

conversione sta quindi nella quantità di asparagina e glutammina che nelle proteine animali è inferiore e comporta

dunque un FC più elevato. Ad esempio le proteine dei cereali sono povere di lisina e questo dipende dagli

aminoacidi, perché alcuni sono più propensi a legare l’acqua di altri (asparagina e glutammina). Il glutammato

essendo ionizzato lega di più l’acqua rispetto alla glutammina. Il fatto di non legare l’acqua, consente di intaccare la

massima quantità di proteine in un ambiente.

2°LEZIONE

1. Su quale principio si basa la cromatografia di gel permeazione?

La cromatografia di gel permeazione (GPC) è un metodo che non richiede necessariamente la denaturazione delle

proteine, ovvero può essere condotto in condizioni native, ma le proteine devono essere solubili. Questa è un’analisi

che permette di valutare la complessità della proteina, ovvero la presenza di forme oligomeriche, le interazioni

strutturanti la proteina e la dipendenza dei fattori da condizioni esterne, come pH, forza ionica e presenza o assenza

di cofattori.

Si impiega una matrice cromatografica composta da sfere di polimeri porose inserite in una colonna cromatografica.

Si identificano spazi tra le sfere e spazi all’interno delle sfere. Considerando una miscela di proteine di diversa massa

molecolare, quelle di maggiori dimensioni restano al di fuori delle sfere, quelle di dimensioni intermedie in alcuni

pori si inseriscono, mentre in altri no, mentre quelle più piccole si infilano anche negli spazi delle sfere porose.

Quindi le molecole più grandi eluiranno per prime, poiché il volume di solvente necessario per farle uscire è solo

quello esterno alle sfere, mentre quelle di minori dimensioni attraversano un volume maggiore.

Il volume di eluizione (volume richiesto per eluire da una colonna una determinata macromolecola) diminuisce

all’aumentare delle dimensioni di una molecola.

2. Quale relazione collega la massa di una proteina e la sua migrazione in SDS-PAGE?

SDS PAGE è una delle tecniche più utilizzate per separare molecole proteiche in base alle loro dimensioni.

La proteina viene disavvolta con un trattamento termico in presenza del detergente, che si lega alle regioni

idrofobiche della proteina, mantenendola in forma disavvolta. SDS interagisce con le proteine in un rapporto di

massa costante (1,4 g SDS/g proteina). Le varie specie proteiche si muovono nella matrice polimerica del gel di

poliacrilammide in ragione delle loro dimensioni: quelle pù piccole si muoveranno più velocemente di quelle

grosse. La distanza percorsa dopo un certo tempo sarà pertanto inversamente proporzionale al logaritmo del peso

molecolare della proteina.

3. Spiegare perché una proteina analizzata in GPC a bassa forza ionica ha Mr 120000, mentre a alta forza

ionica ha Mr 30000.

Si tratta della stessa proteina (un tetramero) che eluisce in modo diverso in funzione della forza ionica. Ad alta forza

ionica si è denaturata e quindi si è scissa in 4 monomeri, ognuna delle quali ha massa pari a 30.000, in quanto gli

ioni annullano le interazioni ioniche. Mentre a bassa forza ionica la proteina eluirà prima e corrisponderà ad una

massa di 120 000.

4. Come si può usare SDS-PAGE per capire quali proteine hanno formato legami disolfuro dopo un

trattamento fisico?

Il trattamento denaturante può essere condotto sia in presenza che in assenza di un riducente dei legami disolfuro

(DTT o 2- mercaptoetanolo), in modo da avere informazioni circa la presenza di legami disolfuro intercatena.

Nell’SDS-PAGE, la proteina viene denaturata ad alte T in presenza di mercapto-EtOH che riduce i S-S (liberando 2

CYS) e di SDS (detergente) che con le sue cariche negative si dispone sulle regioni idrofobiche esposte dalla

proteina disavvolta. Quindi, se durante la denaturazione non vengono rotti i S-S, si formano degli aggregati di

proteine di dimensioni tali da non riuscire ad attraversare le maglie del gel usato per la corsa elettroforetica.

5. Quali informazioni strutturali possono essere fornite da studi di «solubilità differenziale» di proteine?

Gli studi di solubilità differenziale permettono di ricavare informazioni strutturali sulla natura dei legami interproteina

presenti in un network proteico e su eventuali trattamenti subiti dal materiale, in presenza di componenti a crescente

capacità dissociante: Sali, denaturanti (urea, guanidina), detergenti (SDS) e riducenti (DTT-2ME). Permettono di

determinare le interazioni idrofobiche ed i legami covalenti disolfuro presenti.

6. Implementate una strategia per verificare se un trattamento fisico ha modificato la digeribilità di una

proteina

Può essere applicata la precipitazione di acidi caotropici per studiare gli effetti di un trattamento fisico sulla

sensibilità delle proteine all’azione di proteasi digestive, quindi sulla digeribilità.

Una sospensione dell’alimento viene trattata con una proteasi che viene lasciata agire per un certo tempo. L’aggiunta

di TCA (acido tricloroacetico che è l’acido caotropo) arresta l’attività proteolitica e porta alla precipitazione di tutte

le proteine, comprese le proteasi. Poi si misura la quantità di NPN nella parte solubile andando a misurare

l’assorbanza a 280nm legata al rilascio di aminoacidi aromatici.

7. Una proteina viene trattata con tripsina, e analizzata in SDS-PAGE. In assenza di riducenti si ha una sola

banda a massa molecolare di 40 kDa, indipendentemente dal trattamento con tripsina, mentre in

presenza di riducenti si osservano due bande (a 15 e 25 kDa) solo nella proteina trattata con tripsina.

Potete spiegare cosa è successo?

In quanto si tratta di un polipeptide formato da due subunità tenute insieme da un legame disolfuro che contiene

un sito di taglio per la tripsina. Quindi in presenza di riducenti come il DTT, questi agiscono riducendo il legame

disolfuro e quindi si sono ottenuti due peptidi, ovvero si passa da una sola banda di 40kDa a due bande di 15 e

25kDa.

8. Una preparazione di proteine di soia dà due picchi in GPC, con massa molecolare di 30 e 40 kDa. Per

aggiunta di CaCl si forma un terzo picco a 70 kDa, e un’ulteriore aggiunta di CaCl porta alla comparsa

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di un altro picco, che esce dalla colonna prima di ogni altra specie. Potete spiegare cosa è successo?

Avendo aggiunto Cloruro di Calcio che è il sale dell’acido cloridrico esso va a schermare le cariche delle proteine

della soia e fa in modo che eluiscano anche proteine di dimensioni maggiori come quelle di 70 kDa e il picco

maggiore. Quindi esce dalla colonna per primo perché le proteine maggiori avendo un ingombro sterico maggiore

non si insinuano all’interno delle sferette e quindi eluiscono per primo.

3°LEZIONE

1. Implementare una strategia che consenta di separare per cromatografia forme diversamente fosforilate

della stessa proteina, ricordando che i siti di fosforilazione sono rappresentati dagli –OH di serina e

treonina.

Poiché separare forme diversamente fosforilate della stessa proteina significa separare specie con una diversa carica

negativa (i gruppi fosfato conferiscono carica negativa), una tecnica valida per questo scopo è la cromatografia a

scambio ionico (Ionic Exchange Cromatography, IEC). Per separare queste specie, si usa come matrice

cromatografica uno scambiatore di anioni (carico positivamente), come la di-etil-amino-etil cellulosa, a cui le

proteine si legheranno in modo più o meno stabile a seconda della loro carica. Ai fini della separazione

cromatografica, il distacco dalla matrice cromatografica viene indotto cambiando la forza ionica del tampone che

attraversa la colonna, introducendo dei controioni per creare uno stato di competizione tra questi ultimi e le proteine

legate alla matrice: lo ione positivo andrà a legarsi alle proteine, mentre lo ione negativo si legherà alla matrice, in

modo che le proteine si distacchino e siano eluite dalla colonna (prima quelle con carica negativa più debole).

Inoltre, la forza ionica del tampone può essere modificata bruscamente con dei salti di forza ionica (eluizione

stepwise) oppure con un gradiente lineare di concentrazione che consente di ottenere delle separazioni molto nette.

2. Da una colonna di cromatografia a fase inversa, scenderanno prima una proteina intatta o i suoi prodotti

di idrolisi?

La proteina intatta è l’ultima specie eluita dalla colonna, in quanto ha tutti i suoi siti idrofobici intatti, ed è quindi in

grado di interagire maggiormente con la fase stazionaria, grazie alla cooperatività dell’interazione. I prodotti di

idrolisi invece saranno meno attaccati alla matrice e quindi saranno i primi che scenderanno da una colonna. Quindi

all’aumentare del grado di idrolisi la quantità di proteina intatta diminuisce a favore delle frazioni.

3. Come funziona la cromatografia di interazione idrofobica?

La cromatografia di interazione idrofobica è caratterizzata dall’utilizzo di supporti debolmente apolari come gels a

base polisaccaridica sostituenti relativamente “corti” e poco apolari e sull’eluizione a concentrazione salina

decrescente, ovvero effetto “solvatazione” della proteina al decrescere della forza ionica.

La proteina viene fatta aderire alla resina (che porta gruppi apolari) ad altissima forza ionica. In queste condizioni, i

gruppi polari sulla proteina non sono solvatati, e questo facilita le interazioni idrofobiche tra proteina e matrice.

Abbassando la forza ionica, i gruppi polari si solvatano, e le interazioni tra regioni idrofobiche diventano più difficili:

la proteina si stacca, e proteine poco idrofobiche si staccano più facilmente di quelle molto idrofobiche.

HIC si basa su di una matrice polisaccaridica polare (agarosio, acrilamide, sefarosio -agar derivato-) con legati i

gruppi apolari come Ottile (8C), Butile (4C), Fenile. Molte proteine hanno regioni idrofobiche sulla superficie, ma di

norma le regioni idrofobiche sono coperte dall’acqua di solvatazione che circonda la proteina. Per permettere alla

proteina di aderire alla matrice si può cercare di rimuovere l’acqua di solvatazione, inserendo dei soluti cosmotropi

nella soluzione in cui è presente la proteina, ovvero specie ioniche in grado di competere efficacemente con la

proteina per il legame con l’acqua (quindi specie ioniche in grado di interagire con l’acqua). L’agente cosmotropo

più usato è il solfato di ammonio 1,4-1,8 M. Aggiungendo troppo sale si ottiene il salting-out, che è un fenomeno di

insolubilizzazione della proteina (quindi le proteine anziché legarsi alla resina si legano tra loro e formano aggregati

grandi e insolubili).

Proteine molto apolari si legano efficacemente alla superficie della matrice. Al fine di staccarle senza distruggerle si

esegue eluizione a gradiente inverso (eluizione a concentrazione salina decrescente), cioè restituire alle proteine la

loro acqua di solvatazione, diluendo il sale presente nel sistema, abbassando progressivamente quindi la forza

ionica. Le proteine tornano a solvatarsi, e quelle debolmente adese (meno apolari) si staccano prima che quelle

fortemente adese.

Al fine di determinare la quantità corretta di solfato di ammonio da aggiungere si esegue una prova aggiungendo

alla soluzione di proteine una soluzione di solfato di ammonio satura (3,87 M a 0°C) e si osserva a quale

concentrazione di sale la soluzione diventa torbida (le proteine stanno precipitando). Ci si ferma nell’aggiunta prima

di raggiungere questa condizione. Si inserisce questa soluzione nella colonna di analisi, e si valuta quali proteine si

legano e quali non si legano, applicando a quanto fuoriesce la metodologia SDS-PAGE. Se la proteina che interessa

è rimasta attaccata, si diminuisce la forza ionica valutando l’assorbanza. Una volta che si è determinata la forza ionica

alla quale viene eluita la proteina di interesse si può mettere a punto il metodo.

La caratteristica fondamentale della cromatografia a interazione idrofobica è la possibilità di ottenere alla fine del

processo le proteine in forma nativa. Non è semplice da condurre, ma offre il grande vantaggio di preservare

l’integrità strutturale della proteina durante l’analisi.

4. Implementare una strategia che consenta di separare per cromatografia forme della stessa proteina che

differiscono per la quantità di residui di lisina che hanno zuccheri legati dopo glicazione da processo.

La glicazione – evento tale per cui a una proteina si lega un glicoside per effetto di un trattamento fisico – comporta

un aumento di polarità nella proteina, per effetto dell’aumentato numero di gruppi in grado di interagire con l’acqua,

e una modifica della carica. Questo fenomeno interessa per esempio la LYS che durante un trattamento termico

della proteina reagisce con il Glu a formare una base di Schiff: quindi, la LYS scompare dal sistema e la proteina

cambia carica. Per separare le proteine che hanno subito la glicazione da processo si può sfruttare la cromatografia

a scambio ionico in eluizione stepwise oppure la cromatografia ad interazione idrofobica, in cui le proteine più

glicate eluiscono prima di quelle meno glicate.

5. Da una colonna a scambio anionico, uscirà prima mioglobina o met- mioglobina?

In una cromatografia di scambio anionico tra mioglobina (Fe

2+ ) e met-mioglobina (Fe

3+ ) eluisce prima la met-

mioglobina poiché è meno attratta dalla fase stazionaria, carica positivamente. Nonostante la proteina presenti nella

sua totalità molte cariche, avviene lo stesso la separazione.

6. Citare almeno tre enzimi della via glicolitica che siano – almeno potenzialmente - in grado di interagire

con AMP legato ad una matrice cromatografica, e spiegare le ragioni della scelta.

Tre enzimi della via glicolitica che sono in grado di interagire con AMP legato ad una matrice cromatografica

potrebbero essere l’esochinasi che trasforma il glucosio in glucosio-6-fosfato, la fosfofruttochinasi e la fosfoglicerato

chinasi in quanto sono enzimi che utilizzano ATP, quindi hanno un sito di legame per l’AMP che è l’adenosina

monofosfato.

7. Perché l’acetonitrile è il solvente organico più comunemente impiegato nella cromatografia a fase

inversa?

L’acetonitrile è il solvente organico più comunemente impiegato nella cromatografia a fase inversa in quanto rispetta

delle caratteristiche fondamentali tra cui: deve essere miscibile con l’acqua, trasparente nell’UV, isocomprimibile

(sopportare pressioni a 400atm), isorifrangente nei confronti dell’acqua, privo di reattività ed avere un calore di

miscelazione con l’acqua nullo. Inoltre l’