Dogma della biologia - DNA, introduzione materia

Il materiale genetico

Tutti gli organismi possiedono un materiale genetico che controlla tutte le caratteristiche di un individuo e che viene trasmesso dai genitori alla progenie. L'acido desossiribonucleico (DNA) è il materiale genetico di tutti gli organismi viventi e di alcuni virus. Soltanto alcuni virus possiedono RNA come materiale genetico. DNA e RNA sono macromolecole composte da subunità chiamate nucleotidi. Ogni nucleotide è formato da uno zucchero (DNA = desossiribosio; RNA = ribosio) a 5 atomi di carbonio (pentoso), al quale sono legati covalentemente una base azotata e un gruppo fosfato. Il DNA possiede 4 basi azotate: Adenina, guanina (purine), timina, citosina (pirimidine). Nell'RNA, invece, la Timina è sostituita dall'Uracile.

Modello di Watson e Crick

Secondo il modello di Watson e Crick, la molecola di DNA è costituita da due catene polinucleotidiche unite da legami a idrogeno tra le coppie di basi (A-T; C-G) a formare una doppia elica. Nella cellula procariote il DNA si trova nel citoplasma, mentre in quella eucariote all'interno del nucleo. Molto prima che fosse provata l’esistenza di DNA e RNA, i genetisti si erano resi conto che gli organismi viventi dovessero possedere qualche sostanza responsabile del trasferimento delle caratteristiche che vengono passate alla progenie. Allora essi postularono che il materiale responsabile dei caratteri ereditabili avrebbe dovuto avere 3 caratteristiche principali:

• Doveva possedere, in forma stabile, l'informazione per quanto concerne struttura, funzione, sviluppo e riproduzione di un organismo.
• Doveva essere in grado di replicarsi accuratamente.
• Doveva essere in grado di andare incontro a variazione. Senza variabilità, gli organismi non sarebbero in grado di mutare e adattarsi, l'evoluzione, quindi, non avrebbe luogo.

Teorie di Weismann e sviluppi successivi

A fine 800, Weismann sostenne l'idea che nei nuclei delle cellule ci fosse una sostanza in grado di controllare lo sviluppo cellulare e pertanto le caratteristiche dell'intero organismo. Negli anni successivi, fu sperimentalmente dimostrato che i cromosomi sono i portatori delle caratteristiche ereditarie, e che questi sono formati da proteine e acidi nucleici. Inizialmente molti scienziati ritenevano che fossero le proteine a possedere il codice genetico, tuttavia, a partire dagli anni 20 del 900, una serie di esperimenti portò all'identificazione del DNA come il materiale genetico.

Esperimenti storici sul DNA

L’esperimento di trasformazione di Griffith

Uno dei primi studi fu condotto da Frederick Griffith, che stava lavorando su Streptococcus pneumoniae (comunemente chiamato pneumococco), un batterio che causa la polmonite. Griffith utilizzò due ceppi del batterio: uno, il ceppo liscio (S = Smooth) produce colonie lisce e lucenti ed è altamente virulento; l’altro, il ceppo rugoso (R) produce colonie dall’aspetto rugoso ed è innocuo, non virulento. Sebbene questo non fosse noto ai tempi dell’esperimento, ogni cellula batterica del tipo S è avvolta da un involucro polisaccarido (chiamato capsula) che conferisce al ceppo le sue proprietà infettive e dà luogo all’aspetto liscio delle colonie S. Il ceppo ruvido, che è una mutazione del ceppo S, non ha la capsula. Griffith lavorò su due varianti, i ceppi IIS e IIIS. Occasionalmente, cellule del tipo S sono mutate in cellule di tipo R e viceversa. Le mutazioni sono tipo specifiche, quindi, se una cella IIS muta in una cellula R, quest’ultima può solo retromutare in IIS e non ad una cellula IIIS.

Griffith iniettò in dei topi diversi ceppi batterici, verificando se l’animale rimaneva sano oppure moriva. Quando i topi venivano infettati con i batteri IIR, prodotti da mutazioni di batteri di tipo IIS, i batteri IIR non avevano alcun effetto. Quando invece i topi venivano infettati con i batteri del tipo IIIS, morivano, e dal loro sangue si potevano isolare batteri vivi del tipo IIIS. Tuttavia, i topi sopravvivevano se i batteri IIIS venivano uccisi col calore. Questi due esperimenti dimostrarono che i batteri dovevano essere vivi e possedere l’involucro polisaccaridico per essere virulenti. Successivamente infettò altri topi con una sorta di miscela costituita da batteri vivi del tipo IIR e IIIS, i quali però erano stati uccisi precedentemente col calore. Con molta sorpresa i topi morirono e i batteri S erano presenti nel sangue. Questi erano tutti batteri del tipo IIIS e pertanto non avrebbero potuto originarsi per mutazione dei batteri R, visto che ciò avrebbe portato la formazione di colonie IIS. Griffith allora concluse che alcuni batteri IIR erano in qualche modo stati trasformati per interazione con le cellule morte di tipo IIIS, ritenendo che l’agente sconosciuto responsabile di questo cambiamento fosse una proteina, e si riferì a questo agente come principio di trasformazione.

Gli esperimenti di trasformazione di Avery

Il biologo americano Avery riprese gli esperimenti di Griffith, cercando di identificare il principio trasformante. Egli uccise i batteri IIIS e separò l’estratto cellulare nei suoi componenti macromolecolari, quali lipidi, polisaccaridi, proteine ed acidi nucleici. Quindi esaminò ogni componente per verificare se contenesse questo principio trasformante e controllando se fosse in grado o meno di trasformare batteri R vivi derivati da IIS in batteri IIIS. A questo punto Avery usò delle nucleasi, che sono in grado di degradare gli acidi nucleici, per stabilire se il principio trasformante fosse il DNA o l’RNA. Quando trattò gli acidi nucleici con ribonucleasi, che degrada RNA, ma non il DNA, l’attività trasformante risultò ancora presente. Al contrario, utilizzando desossiribonucleasi, che degrada solo il DNA, non si ottiene trasformazione. Quindi i risultati indicavano che fosse il DNA il materiale genetico. Nonostante l’importanza del lavoro di Avery, egli fu criticato perché gli acidi nucleici isolati dai batteri non erano completamente puri e in realtà possedevano dei contaminati di natura proteica.

Esperimenti con i batteriofagi di Hershey e Chase

Nel 1953, Alfred Hershey e Martha Chase pubblicarono i risultati di esperimenti che provavano come il DNA fosse il materiale genetico. Stavano studiando un batteriofago chiamato T2. Come tutti i virus, anche il Fago T2 non è in grado di riprodursi da solo, ma si replica invadendo una cellula vivente ed utilizzando il metabolismo di quest’ultima per produrre nuovi virus. La cellula ospite quindi si rompe, liberando la progenie virale; questo processo prende il nome di ciclo litico. Hershey e Chase sapevano che il fago T2 era costituito soltanto da DNA e proteine, e che era in qualche modo capace di usare il proprio materiale genetico per riprogrammare la cellula ospite e farle produrre nuovi fagi. Tuttavia, non erano a conoscenza se la causa fosse il DNA o le proteine. Per stabilire la natura del materiale genetico, allora, fecero crescere cellule di Escherichia Coli in colture contenenti o un isotopo radioattivo del fosforo o un isotopo radioattivo dello zolfo. Questi isotopi vennero utilizzati perché il DNA contiene fosforo ma non zolfo, e le proteine contengono zolfo ma non fosforo. Allora infettarono i batteri con i fagi T2 e raccolsero la progenie fagica prodotta. A questo punto i due scienziati possedevano due stock di fagi T2, uno aveva le proteine marcate e l’altro aveva il DNA marcato. Quindi infettarono E. Coli non marcato con i due tipi di T2 marcati radioattivamente. Quando il fago infettante era marcato con il fosforo, gran parte della radioattività poteva essere trovata all’interno del batterio subito dopo l’infezione. Una piccola quantità invece era associata alle parti proteiche del fago. Dopo la lisi, una parte del fosforo radioattivo veniva trovata nella progenie fagica. Al contrario, dopo aver infettato E. Coli con zolfo radioattivo, la radioattività non compariva all’interno della cellula, stessa cosa nella progenie. Pertanto, Hershey e Chase dedussero che il DNA deve essere il materiale responsabile per la funzione e la riproduzione del fago T2.

Composizione e struttura di DNA e RNA

Una volta che, tramite la ricerca del materiale genetico, è stato dimostrato che il DNA è il materiale genetico, gli scienziati lo studiarono per determinarne la struttura molecolare. Era già noto che sia il DNA e l’RNA sono polimeri di monomeri di nucleotidi. Ognuno è composto da 3 parti distinte:

• Uno zucchero pentoso, cioè a 5 atomi di carbonio.
• Una base azotata.
• Un gruppo fosfato.

Nel caso dell’RNA lo zucchero è il ribosio, e per il DNA il desossiribosio. I due zuccheri differiscono per i gruppi sostituenti legati al carbonio 2’: un gruppo ossidrile (OH) nel ribosio, e un gruppo idrogeno (H) nel desossiribosio. Gli atomi di carbonio sono numerati da 1’ a 5’ per distinguerli dagli atomi di carbonio e azoto negli anelli delle basi. Le basi azotate sono di due classi: Purine (Adenina e guanina, struttura a doppio anello formate da 9 atomi) e Pirimidine (citosina, timina e uracile, strutture a singolo anello formate da 6 atomi). Gli atomi di carbonio e di azoto degli anelli purinici sono numerati da uno a nove, mentre quelli delle pirimidine da uno a sei. Sia il DNA che l’RNA contengono A, G, C, mentre la Timina si trova solo nel DNA e l’Uracile solo nell’RNA. La combinazione di uno zucchero e di una base azotata è detta nucleoside. Se si aggiunge un gruppo fosfato ad un nucleoside, esso diventa un nucleotide. Il gruppo fosfato è legato al carbonio 5’ dello zucchero, sia nel DNA che nell’RNA. Per la formazione dei polinucleotidi, i nucleotidi vengono uniti da un legame covalente del gruppo fosfato di un nucleotide ed il carbonio 3’ del pentoso dell’altro nucleotide. Questo tipo di legame fosfato viene detto legame fosfodiesterico. È importante ricordare che nella catena polinucleotidica possiamo riconoscere una sorta di polarità del filamento. Infatti, le due estremità non sono uguali: ad un’estremità troviamo il carbonio 5’ che porta un gruppo fosfato, e all’altra estremità un gruppo 3’ che porta un gruppo ossidrile.

DNA dei procarioti

La maggior parte dei procarioti contiene un singolo cromosoma costituito da DNA a doppia elica, circolare. Gli altri procarioti hanno genomi costituiti da uno o più cromosomi circolari o lineari. Generalmente, in questi ultimi vi è un cromosoma principale e uno o più cromosomi più piccoli. Quando un cromosoma piccolo non è indispensabile per la vita della cellula, viene correttamente definito un plasmidio. Negli eubatteri e negli archeibatteri, il cromosoma è organizzato in un blocco denso in una regione della cellula nota come nucleoide. A differenza dei nuclei degli eucarioti, non vi è una membrana tra la regione del nucleoide e il resto della cellula.

Duplicazione del DNA

La duplicazione del DNA è semiconservativa, questo poiché le due nuove doppie eliche di DNA sono formate entrambe da uno dei vecchi filamenti e da un nuovo filamento complementare. Per far sì che la duplicazione avvenga è indispensabile un DNA preesistente, un complesso di duplicazione e un primer, cioè un filamento di DNA che serve da punto di partenza per la duplicazione, e numerose proteine. Questo processo avviene in 2 fasi:

1. La doppia elica di DNA, con l’aiuto di specifici enzimi, si despiralizza e si rompono i legami a idrogeno tra le basi appaiate, per permettere l’allontanamento dei due filamenti stampo e renderli disponibili all’appaiamento con nuove basi.
2. I nucleotidi liberi si uniscono a ciascun nuovo filamento in crescita secondo una sequenza determinata dall’appaiamento per complementarità con le basi del filamento stampo. La formazione dei legami fosfodiesterici è catalizzata dall’enzima DNA polimerasi.

Un punto importante da ricordare è che i nucleotidi si vanno ad aggiungere al nuovo filamento in accrescimento solo all’estremità 3’, quella dove il filamento di DNA presenta un gruppo ossidrile libero sul carbonio 3’ del desossiribosio terminale. Il nuovo nucleotide trifosfato si lega al gruppo -OH in 3’ del filamento in crescita, mediante un legame fosfodiestere. L’energia necessaria alla reazione è liberata dalla rottura dei legami fra un fosfato del nucleotide e gli altri due gruppi fosfato, rilasciati come pirofosfato inorganico.

Origini di replicazione e unità di replicazione

La replicazione del DNA inizia su specifiche sequenze dette origini di replicazione. Tali sequenze sono particolarmente ricche di A e T, dal momento che queste due basi si legano con soli due legami a idrogeno al posto dei tre tra G e C, e sono quindi più facilmente scindibili. Nell'uomo vi è un numero variabile di origini di replicazione su ciascuno dei cromosomi, e durante il processo non si attiva una sola origine di replicazione per volta (occorrerebbero 800 ore per completare la replicazione), ma batterie di 20-80 origini di replicazione dette unità di replicazione. Ciascuna unità di replicazione è attivata in un momento diverso della fase S. Sembra che l'attivazione immediata o tardiva delle unità di replicazione dipenda dallo stato della cromatina in cui sono immerse e non dalla velocità della DNA polimerasi che è più o meno costante. L'eucromatina è replicata all'inizio della fase S, perché più prontamente raggiungibile e meno condensata, mentre l'eterocromatina è replicata tardivamente perché più condensata e inaccessibile. A livello di ciascuna origine di replicazione, la doppia elica si apre grazie alla DNA elicasi e all'idrolisi di ATP in ADP+P alla velocità di circa 1.000 nucleotidi al secondo. Ciascuna DNA elicasi continua a dividere le due eliche di DNA, ma ciascun filamento singolo tenderebbe naturalmente a formare cappi che bloccherebbero la sintesi di DNA da parte della DNA polimerasi, per questo, in attesa della nuova sintesi, alcune proteine dette single-strand binding proteins (SSBP) vi si legano e contribuiscono a tenerlo in una conformazione estesa.