Tecnologia del DNA ricombinante

Tecnologia del DNA ricombinante

Ibridazione

L'ibridazione è una strategia fondamentale nella tecnologia del DNA ricombinante e rappresenta il processo attraverso il quale un frammento di DNA o di RNA con sequenza nucleotidica nota e di dimensioni variabili (sonda o probe) è utilizzato per identificare un altro frammento di DNA contenente una sequenza complementare (bersaglio).

Caratteristica essenziale per tutte le reazioni di ibridazione: sonda e bersaglio a singolo filamento. Il processo di separazione dei due filamenti di DNA è chiamato denaturazione o melting, e avviene mediante l’aumento della temperatura o mediante il trattamento con alcali (quest’ultimo però idrolizza l’RNA).

Quando il DNA sonda e il DNA bersaglio a catena singola sono mescolati, le basi complementari tenderanno ad associarsi di nuovo. Questo processo è chiamato ibridazione e può dare origine a diversi prodotti a doppio filamento:

• Un omoduplex sonda-sonda
• Un omoduplex bersaglio-bersaglio
• Eteroduplex ibrido sonda-bersaglio

L'affidabilità e la specificità del processo d’ibridazione e quindi la sua Tm (melting point) viene influenzata da vari fattori:

• La lunghezza del filamento
• La composizione in basi
• Forza ionica e pH della miscela di reazione
• Divergenza delle sequenze
• Presenza di denaturante

Marcatura delle sonde

Le sonde devono essere marcate per permetterne l’identificazione. Esistono vari modi per marcare il DNA in vitro:

• Marcatura terminale: consiste nell’attacco di un gruppo marcato ad un’estremità della sonda. Scambio del gruppo fosforico γ marcato dell’ATP con il fosfato sul terminale 5’ di un frammento di DNA. L’enzima che catalizza lo scambio è la polinucleotide chinasi.
• Marcatura mediante polimerasi:
  • Utilizzando una DNA polimerasi, numerosi nucleotidi marcati possono essere incorporati in una sonda nel corso della sua sintesi.
  • Questa reazione di sintesi richiede naturalmente la presenza di deossiribonucleotidi trifosfato (dNTP), di cui, in genere, uno, per esempio il dCTP, è marcato (dCTP*).
  • Le sonde sintetizzate con questa tecnica hanno un’alta attività specifica, poiché, mediamente fino al 25% dei nucleotidi incorporati sono marcati.
• Una tecnica molto utilizzata per marcare un frammento di DNA da utilizzare come sonda è costituita dalla marcatura a innesco casuale (random priming).
  • Questa tecnica prevede l’utilizzo di diversi esanucleotidi con sequenza casuale tale da rappresentare tutte le possibili combinazioni di basi A, T, G e C.
  • Necessariamente tra questi esanucleotidi ce ne sarà almeno uno in grado di ibridare con una regione complementare su un filamento di DNA.
  • La sonda che deve essere marcata viene denaturata a DNA a singolo filamento e incubata con la miscela di esonucleotidi per permettere l’ibridazione.
  • Il legame di uno o più esanucleotidi a singolo filamento della sonda genererà dei punti di marcatura.