Tecnologia del DNA ricombinante

IMMOBILIZZAZIONE DEL DNA

 Oggi è possibile creare delle molecole ricombinanti tra segmenti di DNA che non presentano

omologia e che possono provenire da organismi diversi.

 Con l'utilizzo degli enzimi di restrizione e dei vettori molecolari è possibile isolare una sequenza di

DNA da qualsiasi organismo ed inserirla nel DNA di un altro.

Gli enzimi di restrizione sono indispensabili per effettuare un Southern blot.

1. Le endonucleasi di restrizione sono enzimi che idrolizzano i legami fosfodiesterici su entrambi i

filamenti di un DNA a doppia elica

2. sono altamente specifici per determinate sequenze di DNA e i siti su cui possono agire (siti di

riconoscimento o di restrizione) sono presenti sul DNA in modo limitato.

 I prodotti di digestione generati dall’incubazione di una molecola di DNA con un enzima di

restrizione possono essere separati sulla base della loro lunghezza mediante elettroforesi su gel.

 L’elettroforesi su gel di agarosio permette di separare frammenti di DNA di lunghezza variabile da

100 basi a circa 20kb.

La velocità di migrazione dei frammenti di DNA dipenderà dalla loro dimensione

 I frammenti di DNA ottenuti mediante la digestione con enzimi di restrizione sono separati sulla

base delle loro dimensioni attraverso elettroforesi su gel di agarosio.

 Il gel viene poi immerso in una soluzione alcalina per denaturare il DNA.

 I singoli filamenti così’ ottenuti possono passare per osmosi attraverso il gel e migrare su una

membrana di nylon, per dare origine ad un archivio di DNA digerito .

AMPLIFICAZIONE E CLONAGGIO DEL DNA

L’amplificazione in vitro della quantità di DNA può essere ottenuta con due metodi:

1. clonaggio del DNA basato su sistemi cellulari

2. clonaggio del DNA basato su sistemi enzimatici (cell-free)

Un tipo di clonaggio del DNA basato su sistemi enzimatici (cell-free) è il clonaggio del DNA mediante PCR

(polymerase chain reaction). La reazione richiede i seguenti reagenti.

un DNA stampo: il frammento di DNA che si vuole amplificare;

- i primers: piccoli oligonucleotidi che si legano ad una sequenza complementare di basi all’inizio del

- frammento di DNA da amplificare

la polimerasi

-

PCR

La PCR è una tecnica molto versatile che può essere utilizzata in numerose metodiche di studio del DNA.

 L’applicazione più frequente della PCR nella pratica clinica riguarda l’identificazione di mutazioni

genetiche mediante l’analisi del DNA amplificato, in individui a rischio.

La procedura denominata reazione a catena della polimerasi (PCR) può replicare selettivamente e

rapidamente una sequenza nucleotidica in grandi quantità. Vengono disegnati degli oligonucleotidi

(primers) complementari all'estremità 3' del segmento di DNA da amplificare, che guidano la polimerasi

sulla sequenza da copiare. La DNA polimerasi termoresistente è ottenuta dal Thermophilus aquaticus, un

batterio che vive nelle sorgenti di acque termali. E’ possibile che una mutazione crei o elimini un sito di

restrizione: in questo caso le metodiche basate su enzimi di restrizione permettono di dimostrare la

presenza o l’assenza di un allele mutato.

Una delle mutazioni più studiate è la sostituzione di A con T sul codone 6 del gene per le catene β

dell’emoglobina (β-globina), responsabile dell’ anemia falciforme. Questa sostituzione determina la

mutazione ac.glutammico-valina (Gln-Val) sulla proteina e la scomparsa del sito di riconoscimento per

l’enzima di restrizione MstII. La digestione del DNA umano normale con MstII e l’analisi dopo Southern blot

con una sonda specifica per il promotore del gene della β dell’emoglobina permette di rilevare una singola

base di 1,2 kb, poiché il sito più vicino di riconosciuto da MstII si trova 1,2 kb a monte sulla regione 5’ del

gene. La scomparsa del sito di restrizione in seguito alla mutazione del codone 6, determina l’aumento del

frammento osservabile analizzando il DNA digerito con MstII, il quale sarà di 1,4 kb.

I pazienti affetti da anemia falciforme presenteranno solo una banda di 1,4 kb. Gli eterozigoti avranno due

bande, una di 1,2 kb e una di 1,4 kb, mentre gli individui sani avranno solo una banda di 1,2 kb.