DNA ricombinante e biotecnologie

YAC.

artificiale di lievito o Essi possiedono l’origine della replicazione del genoma di lievito,

sequenze per il centromero e il telomero.

I marcatori genetici

I ricercatori devono essere in grado di determinare in quali cellule sono effettivamente presenti le

geni reporter,

sequenze di DNA da clonare. A tale scopo si utilizzano i i cui fenotipi sono

facilmente distinguibili e servono quindi come marcatori genici.

Metodo 1: utilizzo di proteine dotate di fluorescenza verde che normalmente si trovano nella

medusa Aequopora victoriana.

Metodo 2: utilizzo di geni per la resistenza agli antibiotici.

Provenienza dei geni utilizzati negli

esperimenti di clonazione

I geni e i frammenti di DNA usati nei procedimenti fin’ora descritti provengono da tre fonti

principali:

1) frammenti di cromosomi generati casualmente e conservati come librerie genomiche;

2) DNA complementare ottenuto per trascrizione inversa di frammenti di mRNA;

3) DNA sintetico o contenente mutazioni indotte artificialmente.

Le librerie genomiche

Consideriamo le 23 coppie di cromosomi umani come librerie contenenti tutti i geni della specie.

Ogni cromosoma è un “volume” della libreria e contiene una enorme molecola di DNA perciò

libreria

viene frammentato tramite enzimi di restrizione in pezzi minori che costituiscono una

genomica. La costruzione di una libreria genomica avviene attraverso i seguenti passaggi:

1. Un campione di DNA e i plasmidi vengono tagliati con gli stessi enzimi di restrizione;

2. I frammenti di DNA e i plasmidi sono mischiati e legati fra loro con la DNA ligasi;

3. Si ottiene una miscela di plasmidi differenti costituiti dallo stesso vettore ma da inserti diversi;

4. Le cellule batteriche assumono i plasmidi e vengono coltivate su un terreno che consente la

selezione dei cloni ricombinanti;

5. Le colonie formate da cloni contenenti frammenti del DNA originario vengono separate e

mantenute come coltura pura. Ognuna di queste colture rappresenta un “volume” della libreria

genomica.

DNA complementare ottenuto per trascrittasi inversa

Per ottenere una libreria di DNA più ridotta che comprenda solo i geni trascritti nelle cellule di un

DNA complementare:

particolare tessuto si utilizza il

Sintesi chimica del DNA

La sintesi del DNA è stata oggigiorno automatizzata, infatti un gene sintetico può essere

progettato utilizzando il codice genetico e scrivendo una sequenza di basi costituita dai codoni che

codificano la sequenza amminoacidica nota. Si utilizza poi tale sequenza come punto di partenza

aggiungendo altre sequenza comprendenti codoni per l’inizio, per la fine della traduzione e per la

regolazione della trascrizione. La scelta dei codoni è importante in quanto molti aminoacidi

possiedono più di un codone e in organismi diversi vengono usati di preferenza determinati codoni

sinonimi piuttosto che altri.

Introdurre nel DNA mutazioni mirate

La tecnologia del DNA ricombinante ci permette di rispondere alla domanda “cosa accade se…?”

senza dover ricorrere allo studio delle sole mutazioni che si verificano in natura. Poiché è

possibile sintetizzare molecole di DNA di qualsiasi sequenza, possiamo clonare una qualsiasi

sequenza di DNA in modo da creare geni contenenti mutazioni mirate e vedere cosa accade

quando facciamo esprimere un gene mutato da una cellula ospite.

Altri strumenti utilizzati negli esperimenti di

manipolazione del DNA

Altri tecniche usate nella manipolazione del DNA sono:

­ Uso della ricombinazione genetica per creare geni inattivi;

­ Uso di chip di DNA per rilevare la presenza di molte sequenze diverse simultaneamente;

­ Uso di RNA antisenso e di interferenza per bloccare la traduzione di specifici mRNA;

­ Determinazione di quali proteine interagiscono in una cellula;

I geni possono essere inattivati per ricombinazione omologa

Le mutazioni artificiali sono un modo per chiedersi "cosa accade se...?" riguardo al ruolo di un

gene in funzione della cellula. La ricombinazione omologa risponde alla stessa domanda ma a

livello dell'intero organismo, rimpiazzando un gene in una cellula con la sua forma inattivata

(knockout genico). L'allele normale di un gene da testare viene inserito in un plasmide, e un

frammento contenente un marcatore genetico viene posto all'interno del gene normale. Il DNA

extra influisce in modo disastroso con la trascrizione del gene, producendo mRNA non

funzionante. Il plasmide viene poi trasfettato in una cellula precursore in un embrione ai primi stadi

di sviluppo, dove il plasmide si allinea con il cromosoma dell'organismo e si verifica una

ricombinazione tale che l'allele inattivo del plasmide venga scambiato con quello funzionante della

cellula ospite. Il gene reporter inserito viene utilizzato per identificare le cellule staminali

contenente il gene inattivato e una di queste viene impiantata in un embrione che produrrà un

organismo knockout contenente il gene inattivo in forma omozigote.

I chip di DNA rivelano le mutazioni del DNA e l'espressione dell'RNA

I chip di DNA sono lastre di vetro a cui è attaccata una serie di sequenze di DNA in un ordine

preciso. La lastra è divisa in quadrati ciascuno contenente milioni di copie di una sequenza lunga

fino a 20 nucleotidi. Ognuna di queste sequenze ibrida con una sola sequenza di DNA genomico,

identificando quindi un solo gene. Questi chip possono essere usati per due usi: il primo è l'analisi

dell'mRNA cellulare, incubato tramite trascrittasi inversa per produrre cDNA, che verrà poi

amplificato per mezzo della polimerasi. I cDNA amplificati vengono accoppiati a un colorante

fluorescente e usati per sondare il DNA contenuto in un chip, e le sequenze di cDNA che formano

ibridi vengono localizzate tramite scanner. Un altro utilizzo dei chip è la rivelazione di varianti

genetiche e quindi mutazioni, creando frammenti di 20 nucleotidi che includano l'intero gene e

tutte le sue mutazioni e delezioni note, e una possibile mutazione del DNA potrebbe essere

rilevata dall'ibridazione di questo con una sequenza mutante sul chip.

Gli RNA antisenso possono impedire l'espressione di specifici geni

Un RNA antisenso è una molecola di RNA complementare ad un'altra. La formazione di un RNA

ibrido a doppio filamento impedisce ai tRNA di legarsi all'mRNA, in modo che il gene continui ad

essere trascritto ma che ne venga impedita la traduzione. Così è possibile aggiungere alle cellule

RNA antisenso per impedire la traduzione di un particolare mRNA.

Una tecnica simile si avvale dell'RNA di interferenza (RNAi), e consiste nel far svolgere una

breve molecola di RNA a doppio filamento nei singoli filamenti da un complesso proteico, che li

guida fino a una regione complementare sull'mRNA che si vuole demolire. In questo modo si può

produrre siRNA per inibire la traduzione di qualsiasi gene conosciuto.

Il sistema a due ibridi mostra quali proteine interagiscono in una cellula

E' possibile determinare quali proteine interagiscano tra di loro tramite l'approccio in provetta

(usando una proteina "amo"), oppure tramite la creazione di un sistema a due ibridi che sondi le

interazioni tra proteine in una cellula. Questo usa un fattore di trascrizione composto da due

domini che attiva la trascrizione di un gene reporter: il primo si lega al DNA all'altezza del

promotore, e il gene che codifica questo dominio è fuso con un gene che produce la proteina

"bersaglio". La proteina ibrida che ne risulta legherà il promotore del gene reporter senza

attivarlo. Il secondo dominio si lega ad un'altra proteina nel complesso di trascrizione per

attivare la trascrizione del gene reporter. Il gene che codifica questo dominio viene invece fuso

con un gene che codifica la proteina "preda" di cui vogliamo studiare le interazioni con la

proteina bersaglio. Quando questo gene ibrido viene inserito nel filamento "esca" di cellule, le

due proteine possono legarsi, attivando la trascrizione del gene reporter.

Biotecnologie: applicazioni delle tecniche di

manipolazione del DA

Le biotecnologie consistono nell’utilizzazione di cellule microbiche, vegetali e animali allo scopo di

produrre sostanze utili all’uomo come cibi, medicine e prodotti chimici. La scoperta di Fleming che

la muffa Penicillium sintetizzava l’antibiotico penicillina fu il primo passo per lo sviluppo

commerciale di colture di microrganismi utilizzate per produrre antibiotici. Ciò che oggi permette di

trasformare le cellule microbiche in efficienti fabbriche di prodotti è la possibilità di inserire qualsiasi

gene in cellule batteriche o lievito tramite le metodiche che inducono l’espressione e la traduzione

di tali geni nei prodotti codificanti.

I vettori di espressione possono trasformare le cellule in fabbriche

di proteine

Affinché un batterio esprima in modo efficiente un gene eucariotico, quest’ultimo deve disporre

promotore batterico

di un per legami specifici. La soluzione a questo problema è la

costruzione di vettori di espressione che sono tipici vettori con sequenze extra necessarie per

l’espressione del gene estraneo nelle cellule ospiti. Un vettore di espressione può essere

promotore inducibile promotore

modificato in vari modi ad esempio utilizzando un oppure un

tessuto­specifico. sequenze di indirizzo

Al vettore di espressione possono anche essere aggiunte che dirigono

il prodotto del gene alla destinazione appropriata.

Applicazioni in medicina: le cellule cancerose

La causa primaria del cancro consiste in cambiamenti genetici: essi sono soprattutto alterazioni a

carico del DNA che vengono trasmesse alle generazioni cellulari successive durante la divisione

cellulare.

Le cellule cancerose differiscono da quelle normali, dalle quali hanno preso origine, per due

aspetti principali:

1. Non sono in grado di esercitare un controllo sulla divisione cellulare; metastasi.

2. Si diffondono ad altri organi e tessuti creando localizzazioni secondarie chiamate

Processo di diffusione delle cellule cancerose

La massa cancerosa secerne segnali chimici che permettono di rifornire il tumore di ossigeno

- Processo di angiogenesi

e sostanze nutrienti. 

Successivamente si estendono nel tessuto che le circonda grazie ad enzimi digestivi da loro

- prodotti;

Questi enzimi distruggono le cellule e le strutture extracellulari circostanti la massa tumorale

- e aprono la strada alle cellule tumorali verso i vasi sanguigni;

Alcune di queste cellule penetrano nel circolo sanguigno o nel sistema linfatico ma solo

- alcune sopravvivono;

A questi punto quando una delle sopravvissute raggiunge un organo adatto alla sua crescita,

- esprime alcune proteine di superficie che le consentono di invadere il tessuto.

Tumori

Carcinomi

Sarcomi

Prendono

Sono a carico

( circa

origine

di