Tecnologia del DNA ricombinante

Appunti di tecnologia del DNA ricombinante basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Bolchi, dell’università degli Studi di Parma - Unipr, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea in biologia. Scarica il file in formato PDF!

Esame Tecnologia del DNA ricombinante

Facoltà Scienze matematiche fisiche e naturali

Dal corso del Prof. Bolchi Angelo

Università Università degli Studi di Parma

Publisher sciannamartina.01

A.A. 2021-2022

145 pagine

Appunto

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Estratto del documento

COSMIDI

Si tratta di un plasmide a tutti gli effetti: possiede dei geni per la resistenza all'antibiotico, un'origine di replicazione, sito di policlonaggio. Una caratteristica di questo vettore rispetto ai plasmidi normali è che al suo interno è stato inserito un pezzetto di DNA di lambda, in particolare la regione cos (centinaio di basi all'estremità del DNA di lambda). Di conseguenza possiede delle caratteristiche sia di lambda che del plasmide classico.

Nella regione cos abbiamo il sito di taglio; la lambda terminasi permette il taglio e la produzione (dopo l'internalizzazione delle particelle del fago) delle estremità adesive cos caratteristiche di λ. Questo tipo di vettore viene sfruttato per il clonaggio di frammenti di DNA ancora più grandi di quelli classici di un vettore lambda di sostituzione. Abbiamo visto che nei lambda di sostituzione si tagliano 20 kb.. quando il frammento di DNA aumenta e arriva a 40 kb non

è clonabile né nei plasmidi ne nei lambda di sostituzione. A questo punto i biologimolecolari hanno ideato questo vettore che permette il clonaggio di frammenti fino a 40-45 kb.

Procedura di clonaggio;ci sono somiglianze sia col clonaggio del fagolambda di sostituzione che dei plasmidi.

Innanzitutto, essendo un plasmide si propagagrazie alla resistenza all’antibiotico;prendiamo il batterio contenente il cosmide elo prepariamo in un terreno contenentel’antibiotico. Quando avremo raggiunto unadeterminata densità cellulare, per estrarre ilcosmide si sfruttano le stesse tecniche che siusano per il plasmide -> lisi delle cellule edestrazione. A questo punto abbiamo deicircoli perché il cosmide è un plasmide e vienelinearizzato (mediante taglio con enzimi direstrizione) per poter inserire il DNA esogeno.

Proviamo ad immaginare il clonaggio di unframmento di DNA di 40kb; si formano deigrossi plasmidi (46 kb) difficili da inserire inColi

Attraverso la trasformazione. In alternativa si sfrutta l'infezione -> dobbiamo impacchettare icosmidi ricombinanti all'interno di particelle fagiche. Questo è possibile perché dalla reazione diligazione otteniamo un concatenato cosmidico con siti cos alternati in maniera ottimale per l'impacchettamento in vitro. (Nomenclatura: pJB8.. la p indica che è un plasmide).

Queste particelle fagiche non hanno alcun gene del fago λ, hanno la sequenza cos riconosciuta dalla terminasi che era insieme alle proteine del packaging. Quindi siamo in presenza di virioni "simulati" con all'interno il plasmide con il frammento di DNA esogeno, ma non sono particelle fagiche. Infatti si parla di VLP (particelle simili a virus) che però sono in grado, grazie alla presenza della coda, di infettare dei batteri. È ovvio però all'interno del batterio non ci sono i geni di lambda, quindi il cosmide non lisa i batteri.

però avendo ilcosmide, il gene per la resistenza all’antibiotico.. la selezione dopo l’infezione è su unterreno contenente l’antibiotico -> le cellule contenenti il cosmide possono crescere eformare colonie. Le colonie conterranno il cosmide -> anche qua possono esserci cosmidiricombinanti e non ricombinanti e quindi l’analisi successiva sarà molto simile a quella fattaper i plasmidi; i batteri vengono fatti crescere separatamente, si estrae il cosmide inseguito alla lisi, analisi di restrizione o PCR e così via.

Clonaggio in un cosmide:

preparazione cosmide
il cosmide viene digerito (in questo caso rappresentato sotto) con l’enzima di restrizione BamHI per favorire la linearizzazione
reazione di ligazione che implica l’utilizzo di frammenti di DNA di grosse dimensioni comprese nel range di 35-45kb (in questo modo fra i siti cos c’è la giusta distanza)-> si ottiene un concatenato in cui, grazie

alla presenza del sito cos nel plasmide, il sito cos si ripete ad una data distanza

impacchettamento in vitro
formazione delle particelle simili a fagi
infezione
circolarizzazione a livello delle estremità cos
selezione su antibiotico

essendo le due estremità BamHI compatibili potrebbe succedere che il cosmide si leghi al contrario -> la distanza fra un sito cos e quello successivo non è più quella prevista (succede anche in lambda sisostituzione). Solo ciò che si è ligato in maniera corretta entrerà nelle particelle fagiche!

clonaggio in un cosmide con un sito cos

cosmide di 5000pb viene linearizzato con un enzima di restrizione. Poi si prepara il DNA esogeno e se quest'ultimo ha dimensioni differenti, bisogna purificarlo in modo da selezionare quelli che hanno una determinata dimensione -> quelli più piccoli o quelli più grandi non entreranno mai e in qualche modo competono nella reazione di ligazione. Dopo aver

selezionato il DNA di interesse, viene eseguita una reazione di ligazione che favorisce la formazione di concatenati. Poi si ha l'aggiunta delle proteine di impacchettamento, formazione di VLP utilizzati per infettare coli. Poi si effettua una piastatura su un terreno contenente antibiotico -> colonie cosmidiche da analizzare singolarmente per individuare il clone contenente il DNA desiderato. Analisi dei ricombinanti con PCR analitica, colony ibridization o analisi di restrizione. Esistono anche cosmidi modificati che invece di avere al loro interno la regione minima di 200pb una sola volta, questa è presente due volte nella molecola. Tra i due siti cos può essere inserito un gene per la selezione (in questo caso è il gene che da la resistenza alla canamicina. Il sistema di clonaggio è un po' più semplice perché invece di formare un concatenato è sufficiente produrre delle molecole utilizzando non un cosmide linearizzato, bensì i dueframmenti cosmidici ottenuti dalla doppia digestione di questo vettore. Quindi anziché usare solo il sito BamHI si sfrutta anche l'enzima SmaI. Quest'ultimo interrompe il gene che da resistenza alla canamicina. Si formano due frammenti e vengono purificati, miscelati al DNA di interesse. VETTORI M13 → fagi utilizzati non per il clonaggio diretto dei geni, ma per delle applicazioni particolari delle tecnologie. Oltre al fago M13 poi ci sono altri fagi correlati (fd e f1) che hanno sequenze molto simili. Questi fagi, rispetto al vettore lambda, hanno delle caratteristiche strutturali completamente diverse: - capsidi bastoncellari (nel fago lambda sono ecosaedrici) → non c'è un limite alla quantità di DNA che possono contenere (a differenza di lambda) perché la struttura dei capsidi si ottiene grazie ad un attacco delle proteine del capside intorno all'acido nucleico (spesso aspirale). Se il DNA aumenta di dimensioni, aumenta anche ladimensione del fago. Poi in realtà all'interno di questo vettore, raramente vengono clonati frammenti superiori alle 7kb (per un fattore di stabilità del genoma).

Genoma circolare a singolo filamento (in λ era lineare a doppio filamento e con due estremità adesive)
Per la sua replicazione ha bisogno di un certo numero di geni -> 11 geni indicati con i numeri romani, indispensabili per la produzione delle varie proteine del capside. Alcuni geni sono anche sovrapposti -> caratteristica molto comune dei virus e dei fagi proprio perché il loro genoma è di piccole dimensioni (infatti non ci saranno introni).
Regione intergenica di circa 500 nucleotidi nel quali si trova l'origine di replicazione fagica

Mentre lambda infetta il batterio grazie ad un recettore che riconosce la permeasi del maltosio sul batterio, M13 infetta i batteri che possiedono il pilus F, episoma F della coniugazione del batterio. Poichél’episoma F non offre nessun vantaggio al batterio che quindi a lungo andare potrebbe perderlo, si è cercato di modificare l’episoma F inserendo dei marcatori che permettono di mantenerlo all’interno del batterio. Uno dei marcatori può essere la resistenza all’antibiotico. Nell’infezione ci sono delle proteine presenti nella membrana del batterio che sono in grado di togliere il capside del fago M13 in modo da far penetrare solo il suo genoma all’interno della cellula batterica. Ciclo vitale di M13 M13 penetra nel batterio, il singolo filamento (indicato con un +) già circolare viene trasformato in doppio filamento (prende il nome di forma replicativa col filamento -) e si replica per centinaia di volte. Ad un certo punto abbiamo la replicazione solo del filamento + perché ne verranno prodotti tanti e saranno il genoma del fago. Il filamento + viene impacchettato nelle proteine capsidiche e fuoriesce dal batterio senza lisarlo -> la

cellula batterica non può dare origine a placche dilisi. Una volta prodotto il fago, questo viene assemblato e fuoriesce dalla cellula senza lisare il batterio.

Come si visualizzano i vari cloni? Si piastrano i batteri in eccesso -> si forma un tappeto e là dove è avvenuta la replicazione del fago si osservano delle placche di ridotta crescita.. (il batterio che è stato infettato non cresce molto bene) -> non c'è un tappeto uniforme, ma ci sono delle regioni un po' più chiare. Spesso non è facile individuare queste placche perché non hanno la forma classica circolare, hanno bordi non perfetti e possono essere di piccole dimensioni. Il gene VI e il gene II sono responsabili della replicazione del fago e della formazione fino a 100-200 copie di doppio filamento. Ad un certo punto viene prodotta la proteina V che legandosi al singolo filamento ne impedisce la trasformazione nel doppio filamento. Di conseguenza viene prodotto un

Un numero notevole di singoli filamenti (filamenti +) Naturalmente il fago wild type è stato modificato dai biologi molecolari per introdurre alcune caratteristiche importanti per la loro propagazione, la loro selezione o il clonaggio.

Fago M13 trasformato nel vettore M13mp18;

Sono state mantenute più o meno tutte le regioni geniche del fago. L'unica cosa che è stata modificata è la regione intergenica in cui è stato inserito il sito di clonaggio. Introducendolo in quella regione non si va a clonare all'interno dei geni importanti per la replicazione -> nel vettore dell'immagine si passa da 6.4 kb a 7.2kb.
Selezione bianco blu
Tutti i siti di restrizione sono st

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