Tecnologia del DNA ricombinante

Tecnologia del DNA ricombinante

Le tecnologie del DNA ricombinante spiegano come estrarre il DNA (nucleare, mitocondriale o plastidiale) da un organismo. Può essere estratto anche l’RNA. In particolare, questo processo comporta la purificazione dell’mRNA che in un secondo momento viene convertito in cDNA (prima a singolo filamento e poi a doppio filamento) in modo tale da avere una forma più stabile e adatta ad un eventuale clonaggio genico (avviene tutto in vitro).

Tuttavia, il DNA può essere sintetizzato artificialmente (si sintetizza un filamento alla volta). Stessa cosa per le proteine. Questo processo però ha delle limitazioni in quanto gli acidi nucleici possono contenere dagli 80 ai 100 nucleotidi, mentre le proteine circa 50 amminoacidi.

OGM

Gli OGM sono organismi modificati ottenuti per trasferimento di geni da un organismo all’altro. Tramite gli OGM si possono studiare e analizzare particolari geni e far esprimere il prodotto del DNA sotto forma di proteine ricombinanti. Quest’ultime si dividono in native (uguali a quelle d’origine) o modificate (ibride).

Equivalenze fra unità di misura

• 10 g = 10x10⁶ µg
• 3 ng = 3x10^-3 µg
• 5 pg = 5x10³ µg

Strumenti e apparati di laboratorio

• Pipette automatiche
• Bilance: per la misurazione di pesi e volumi
• Centrifughe: consentono la separazione e sedimentazione di componenti
• Agitatori (Vortex); rimescola componenti separati
• Incubatori termostatati; regolano la temperatura permettendo dei passaggi chimici che richiedono una determinata temperatura
• Apparati per elettroforesi
• Elettroporatore, apre i pori di membrana permettendo il passaggio di macromolecole
• Sonicatore; emette ultrasuoni in un mezzo acquoso per disgregare la cellula più facilmente
• Spettrofotometro; misura la torbidità di una soluzione
• Cappe a flusso laminare; protegge il prodotto che viene maneggiato per non comprometterne la sterilità
• Autoclave; sterilizza grazie alle alte temperature (121 gradi C) per 20 min sotto pressione
• Forno a microonde; riscalda velocemente
• Forno UV; elimina residui di DNA contaminante creando dimeri di timina e rendendo perciò impossibile la replicazione
• Termociclatore; per PCR
• Vetreria e plasticheria da laboratorio

Termodinamica

La formazione dei polimeri è termodinamicamente sfavorita, mentre la loro degradazione è spontanea e più rapida. Per far sì che i monomeri si aggreghino per formare dei polimeri in tempi brevi è necessaria la presenza di catalizzatori in grado di abbassare l’energia di attivazione della reazione. RNA instabile per via di enzimi o ioni OH- che catalizzano la sua degradazione.

Enzimi utilizzati nelle tecnologie ricombinanti

DNA e RNA estratti da organismi o sintetizzati chimicamente fungono da substrato per enzimi utili in questa disciplina. Tali enzimi sono:

• Enzimi di Restrizione
• Metilasi
• Nucleasi
• Ligasi
• Fosfatasi alcaline
• Polinucleotide chinasi del fago T4
• DNA polimerasi
• Trascrittasi Inversa
• Terminal Transferase
• RNA polimerasi

Enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi in grado di rompere un legame fosfodiesterico all’interno della sequenza dell’acido nucleico. Si parla quindi di DNasi o RNasi. Questi enzimi vengono prodotti da molti ceppi batterici, nei quali sono responsabili della restrizione d’ospite che blocca l’infezione fagica in seguito alla degradazione del DNA estraneo (dopo essere entrato nella cellula ospite).

Le endonucleasi agiscono solo sul doppio filamento, quindi solo sul DNA, tramite il riconoscimento di una determinata sequenza di DNA nel solco maggiore a cui si legheranno per poi catalizzare la rottura del legame fosfodiesterico. I batteri che producono endonucleasi di conseguenza produrranno anche delle metilasi che metilano l’adenina della sequenza GAATTC proteggendola dalle endonucleasi. Se agiscono prima le endonucleasi, il fago si replicherà all’interno della cellula ospite. Queste sequenze di riconoscimento (dal 5’ al 3’) di solito sono palindromiche. Le frecce nella figura indicano il punto esatto di rottura del legame (viene lasciato un OH al 3’ e sul 5’ rimane il fosfato).

Sono stati isolati centinaia di enzimi di restrizione dai microrganismi che riconoscono più siti bersaglio ciascuno. In particolare sono stati isolati tre tipi di enzimi di restrizione:

• Classe II, dove il taglio viene effettuato in sequenze specifiche, le attività endonucleasica e metilasica appartengono a due proteine diverse.
• Le endonucleasi di tipo I e III invece necessitano di ATP e effettuano l'idrolisi del DNA in punti casuali, distanti anche più di 1000bp dal sito di riconoscimento.

Come mai l’enzima di restrizione riconosce una sequenza palindromica e taglia in maniera così simmetrica? Nell’immagine, in azzurro abbiamo la sequenza di DNA mentre in rosso e giallo abbiamo le due subunità (simmetriche) dell’enzima di restrizione. Una subunità riconosce una parte di sequenza e l’altra subunità riconosce la parte di sequenza restante. Di conseguenza, gli enzimi di restrizione classici sono omodimeri che tagliano in maniera simmetrica la molecola di DNA.

Poiché ci sono centinaia di enzimi diversi, si è cercato una nomenclatura determinata dal seguente schema:

• eco = escherichia coli (E= genere; co=specie)

Modalità di taglio estremità 3’ o 5’ protrudenti a singolo filamento. Tagliano tot basi più a monte o più a valle rispetto al sito di riconoscimento.

Gli enzimi di restrizione che riconoscono lo stesso sito di restrizione possono essere distinti in due categorie in base al tipo di taglio che effettuano e alle estremità che producono:

• Neoschizomeri: tagliano lo stesso sito di riconoscimento in modo differente generando estremità coesive diverse.
• Isoschizomeri: tagliano lo stesso sito di riconoscimento nella stessa posizione generando estremità coesive identiche.

Le ditte di biotecnologie forniscono dei cataloghi di enzimi di restrizione da acquistare. Quelli più utili nelle procedure di clonaggio genico sono quelli che generano estremità protrudenti identiche definite adesive compatibili. In sostanza, due enzimi diversi tagliano due sequenze diverse formando estremità compatibili. Se abbasso la temperatura (vicino allo zero), i due filamenti si appaiano e otteniamo un ibrido. Situazione instabile perché a temperatura ambiente le due estremità si separano. Questo ibrido però ha bisogno di riformare il legame fosfoesterico per diventare una molecola più stabile. A questo proposito subentra la DNA ligasi che riforma questi legami per stabilizzare l’ibrido → DNA ricombinato.

Spesso il DNA deve essere tagliato con più di un enzima di restrizione diverso, quindi presenterà più siti di riconoscimento. Può capitare che alcuni siti siano all’estremità e di conseguenza diminuisce l’efficienza di taglio. Di conseguenza bisogna sapere quando l’enzima è influenzato dalla posizione del sito di restrizione. In particolare, ad influire sull’efficienza di taglio è anche il tempo in cui la molecola di DNA rimane in soluzione insieme agli enzimi di restrizione; più tempo essi rimangono nella stessa soluzione, più probabile sarà il riconoscimento e quindi il taglio del sito di restrizione.

Temperatura ottimale e DNA lineare o circolare

La T ottimale dell’enzima di restrizione dipende dal tipo di enzima e da quale microrganismo è stato estratto. Se parliamo di un microrganismo che vive nel suolo, la sua temperatura ottimale sarà intorno ai 20 gradi (temperatura ambiente), se invece abbiamo escherichia coli la sua temperatura ottimale sarà di 37 gradi. Se invece parliamo di batteri termofili o ipotermofili, gli enzimi di restrizione avranno una temperatura ottimale molto più alta.

Il DNA sottoposto alla digestione da parte dell’enzima di restrizione può essere lineare oppure circolare. In natura entrambi i tipi di DNA possiedono dei superavvolgimenti (più numerosi nel DNA circolare) che rendono non più così facilmente accessibile la molecola di DNA da parte dell’endonucleasi. Quindi in questo caso dobbiamo aumentare la quantità di enzimi per ottenere quasi un 100% di taglio. Naturalmente questo dipende dal tipo di enzimi; alcuni digeriscono bene anche il DNA superavvolto.

Tampone di reazione e frequenza di taglio

Ogni enzima di restrizione ha generalmente un tampone ottimale per il suo funzionamento, ma esistono anche dei tamponi universali che permettono di poter utilizzare più di un enzima contemporaneamente. La frequenza di taglio è la distanza tra due siti di restrizione in una sequenza di basi casuale ed è uguale a 4 elevato alla N, dove N è il numero di basi riconosciute dall’enzima. Ad esempio:

• Se la sequenza del sito è di 4 basi, ogni 256 bp ritroviamo un sito
• Se la sequenza del sito è di 6 basi, i vari siti saranno distanti tra loro 4096 bp (4^6)
• Se la sequenza del sito è di 8 basi, i vari siti saranno distanti tra loro 65.536 bp

L’enzima taglia raramente la molecola di DNA. Questo è vero solo se il DNA ha una sequenza casuale, ma le sequenze dei DNA estratti dagli organismi viventi non sono casuali. Di conseguenza, la frequenza non è quella calcolata e varia da specie a specie. In questi casi si può misurare la posizione dei siti di restrizione senza conoscere la sequenza del DNA tramite digestione ed elettroforesi: in questo modo si determina la posizione dei siti di restrizione analizzando la lunghezza dei frammenti ottenuti.

Poiché non c’è solo un enzima di restrizione, esistono dei programmi che tramite l’inserimento di una sequenza di DNA è possibile risalire agli enzimi di restrizione ottenendo una cosiddetta mappa di restrizione. In più, questo programma indicherà anche gli enzimi che non sono specifici per quella sequenza inserita. Certe volte invece si cerca di determinare una mappa di restrizione di una sequenza ignota di DNA. In questo caso si sottopone la molecola a più tagli effettuati da enzimi diversi e in base ai frammenti ottenuti (la cui dimensione viene valutata tramite l’elettroforesi) si può ricostruire la mappa di quel DNA.

Metilazione e digestione incompleta

Come abbiamo già specificato, l’enzima di restrizione agisce sul DNA ancora non metilato. Il batterio metila il proprio DNA per proteggerlo dalle nucleasi mentre qualsiasi DNA estraneo viene immediatamente degradato da questi enzimi poiché non è metilato. Tuttavia, la metilazione non è sempre legata agli enzimi di restrizione; per esempio, nei batteri esistono due DNA metilasi (DNA adenosina metilasi e DNA citosina metilasi che agiscono nella sequenza GATC) che agiscono indipendentemente dalla restrizione. La prima, la DAM, serve per riconoscere il filamento neosintetizzato da quello parentale al momento della replicazione. Se vogliamo degradare il DNA del batterio che ha queste metilazioni in più oltre a quelle legate alla restrizione, se l’enzima di restrizione ha nel suo sito GATC allora questo non riuscirà a tagliare quel DNA. Quindi dobbiamo sapere se l’enzima di restrizione è influenzato dalle metilazioni che sono indipendenti.

Quanti tipi di molecola si formano dopo la digestione di una molecola di DNA circolare contenente due siti di restrizione? Due, ma se l’enzima non taglia in modo efficiente possiamo ottenere anche solo una molecola con i frammenti attaccati oppure può avvenire che la molecola iniziale non venga digerita. La restrizione non è mai al 100%.

Endonucleasi ed esonucleasi

Abbiamo visto gli enzimi di restrizioni che sono nucleasi che catalizzano la rottura del legame fosfoesterico. Esistono endonucleasi ed esonucleasi. Esistono delle endonucleasi non specifiche. Tagliano a caso e più a lungo lasciamo gli enzimi con questi DNA, più la molecola verrà frantumata. Dipende dal tempo che lasciamo l’enzima e dalla sua concentrazione.

DNasi I isolata dal pancreas bovino, agisce sia sul singolo che sul doppio filamento di DNA e può fare sia dei tagli sfalsati che simmetrici. Applicazioni nello studio della cromatina, footprinting DNA –> per studiare l’impronta, la posizione di queste proteine sul DNA. Per capire dove si è posizionata la proteina bisogna analizzare i frammenti tramite elettroforesi che permette di separarli in base alla loro dimensione. Là dove non ci sono frammenti, c'è la proteina.

Un’altra endonucleasi aspecifica è la nucleasi S1 inizialmente estratta dal fungo Aspergillus oryzae mentre oggi è per lo più ricombinata. La caratteristica di questa endonucleasi è che anche a concentrazioni elevate, agirà sempre e solo su singolo filamento occupandosi del taglio delle estremità protrudenti. Applicazione per eliminare le strutture a forcina nel DNA difficilmente manipolabile e che a questo proposito deve essere lavorata per ottenere delle estremità classiche.

Le esonucleasi tagliano alle due estremità e hanno una direzione di catalisi che va dal 3’ al 5’ a differenza delle polimerasi che vanno dal 5’ al 3’. Se aggiungiamo una esonucleasi ad un DNA circolare non succede nulla perché non ci sono estremità libere. Ci vuole un DNA lineare. Arriva ad un certo punto che il DNA sia a singolo filamento. Tutte queste nucleasi non hanno bisogno di energia perché la degradazione è sempre favorita.

Esonucleasi tre da Escherichia coli, può essere miscelato con DNA e digerisce entrambi i filamenti. Poi utilizziamo delle nucleasi S1 per togliere le estremità protrudenti per riottenere molecole a doppio filamento. Un’altra esonucleasi è quella estratta da un batterio BAl31 che ha sia un’attività esonucleasica che endonucleasica. Inizia a digerire un solo filamento.

Le ribonucleasi digeriscono l’RNA che è già facilmente degradabile: RNasi A e RNasi T1. Tagliano ripetutamente la molecola di RNA anche se non sono completamente aspecifiche. Queste ribonucleasi non agiscono sul doppio filamento di RNA prodotto tramite tecniche di biomolecolare o durante la replicazione di virus a RNA. RNasi H dove H sta per hybrid che agisce solo quando l’RNA è appaiato al DNA e catalizza l’idrolisi dell’RNA.

DNA ligasi

La DNA ligasi è un enzima che opera durante la duplicazione del DNA poiché unisce i vari frammenti di Okazaki saldando i nick prodotti dall’eliminazione dei primer. Per questo processo, al contrario della degradazione, è necessario l’apporto di energia. In particolare, la DNA ligasi è in grado di ripristinare una doppia discontinuità quindi unisce due molecole di DNA per ottenere un DNA ricombinante. Le DNA ligasi principali sono quella di Escherichia coli che richiede NAD e quella del fago T4 che necessita di ATP. Ovviamente esiste anche l’RNA ligasi che può unire due molecole di DNA a singolo filamento o due molecole di RNA (non avviene mai al 100%).

Fosfatasi e chinasi

Fosfatasi e chinasi agiscono sull’estremità 5’ del DNA a doppio filamento. Alcune sono in grado di staccare il fosfato dal 5’. Mentre le chinasi, tramite l’utilizzo di ATP, catalizzano la reazione inversa. Aggiungono un fosfato al 5’. Fosfatasi: BAP o CIAP mescolate DNA a singolo filamento o sull’RNA. La chinasi può anche agire da fosfatasi. Prima stacca il fosfato, lo trasferisce all’ADP e poi se è presente ATP trasferisce il fosfato in gamma al 5’. Reazione meno efficiente.

DNA polimerasi

Le DNA polimerasi catalizzano la sintesi di DNA. La prima usata nelle tecnologie è stata quella di Escherichia coli.

Requisiti per il funzionamento in vitro

• DNA templato (stampo)
• Primer che fornisce un 3’ OH a cui agganciare i nucleotidi, altrimenti è necessaria la primasi che sintetizzi il primer
• Miscela di dNTP
• Tampone

Il frammento Klenow è un enorme frammento proteico prodotto quando la DNA polimerasi I di E.coli subisce un taglio enzimatico da parte della proteasi subtilisina. Manca completamente l’attività esonucleasica.

DNA polimerasi termoresistenti (la Taq polimerasi per esempio) hanno facilitato l'utilizzo della PCR e ha permesso la sua automatizzazione. Questa DNA polimerasi è stata isolata dai batteri (Thermus acquaticus) che vivono nelle sorgenti di acqua calda. Il primo passaggio della PCR è la denaturazione del DNA che avviene ad una temperatura di 95°C. Tuttavia, in seguito dovrà esserci la condizione necessaria per far sì che i primer si leghino alle due estremità e di conseguenza abbasso la temperatura a 50°C. In questo modo, nel frattempo, l’altro filamento potrebbe riappaiarsi eliminando i due primer! Quindi come faccio ad evitare questa situazione? Utilizzo un’alta concentrazione di primer in grado di legarsi in tempi minori rispetto a quanto ci impieghino due filamenti per appaiarsi e, inoltre, mantengo la temperatura di 50°C per il minor tempo possibile (la DNA polimerasi agisce immediatamente). Tuttavia, andando a denaturare il DNA ottenuto, rischio di danneggiare le DNA polimerasi che in questo modo andrebbero reinserite ogni volta. Come risolvere ciò? Utilizzo delle proteine termo resistenti, polimerasi batteriche funzionano meglio a 75°C (il primer non si stacca perché c’è la polimerasi che lo blocca).