Divisione in tre classi, Biologia Molecolare

DIVISIONE IN TRE CLASSI

Dividing cells: cellule che si dividono continuamente



(cellule basali)

Resting cells: cellule uscite temporaneamente dal ciclo



quindi in fase G0 (fegato e rene)

Non dividing cells: cellule non in grado di dividersi.



In fasre Gz

SINCRONIZZAZIONE IN COLTURA: permette di collocare la durata delle fasi del ciclo

cellulare.

Le cellule animali per sopravvivere in coltura hanno bisogno di particolari condizioni chimico

fisiche e di sostanze nutritive per sostentare.

a) SHAKE OFF: le celule in fase M sono più globose => aderiscono meno al vetrino e quando

si scuote questo in maniera energica le cellule in interfase rimangono attaccate => avviene

sincronizzazione.

b) INIBIZIONE DA CONTATTO: le cellule proliferano fino a che tutta la superficie della

piastra non è ricoperta, a quel punto entrano tutte in fase G0 => arresto della crescita e

sincronizzazione.

DURATA DEL CICLO CELLULARE (circa 24h)

Si creano colture gemelle e si calcola il tempo in cui le cellule raddoppiano.

Fase M: si guarda il vetrino della coltura al microscopio e si nota la % di cellule in fase M => si fa

la media (durata circa 1-2h)

Fase S: si marcano con la timidina le cellule che stanno duplicando DNA (durata 8h)

Fase G2: tempo trascorso tra marcatura e comparsa dei nuclei marcati rappresenta la durata (4h)

Fase G1: sottraiamo a 24h la durata delle altre fasi => (circa 10/12h)

N.B. nei primi stadi della vita embrionale la fase G1 non c'è e le fasi sono più rapide

FACS: (Fluorence-Activated Cells Sorter) misura la fluorescenza delle cellule.

Q.tà DNA = 1 -----> fase G1

Q.tà DNA = 2 -----> fase G2 o M

Q.tà DNA 1<x<2 -----> fase S MITOSI

PROFASE: La cromatina si spiralizza in cromosomi. Separazione centrosomi (spostano verso i

poli). Formazione fuso mitotico con microtubuli (astral).

Diminuzione concentrazione: - proteine cicline

- enzimi Cinasi (attivano altre proteine con aggiunta di un fosfato)

aumento → Ciclina B/Cdk1 (fattore promuovente la mitosi)

diminuzione → Ciclina A/Cdk2 (caratterizza fase S)

METAFASE: Cromosomi si dispongono sul piatto equatoriale per azione delle proteine motrici calo

di Ciclina B/Cdk1

ANAFASE: I cromatidi fratelli vengono portati ai poli opposti della cellula attivazione dell'APC

TELOFASE: si ricostituisce la membrana nucleare i cromosomi non sono più identificabili.

CITOCHINESI: divisione del citoplasma per strozzatura

MICROTUBULI E MECCANICA DELLA DIVISIONE

MT: strutture proteiche formate da dimeri di α e β tubulina funzioni trofiche e meccaniche,

costituente del citoscheletro.

Impalcatura interna di ciglia e flagelli

 responsabili del transito vescicole e organelli

 costituiscono il fuso durante la divisione



Tre Classi: 1. Astral: (raggera) : nella divisione dal centrosoma si irradia un ventaglio di MT che

formano il fuso

2. Overlap: (interpolari) : microtubuli di un centrosoma che interagiscono con quelli di

un altro centrosoma

3. Kinetochore: spostamento dei cromosomi, si legano al cinetocore di ciascun

cromatido garantendo l'interazione tra cromosomi e fuso mitotico

TREADMILING: stabilità dinamica dei microtubuli (continua polimerizzazione e

depolimerizzazione) allungamento: favorito dal cappuccio di GTP

accorciamento: favorito da presenza di GDP => disgregazione

Quando vengono a contatto con le membrana interrompono

l'allugamento.

Coinvolgimento di proteine che si attaccano all'estremità dei

microtubuli e si dividono: ◦ MAP: stabilizzano il filamento

creando un MT più lungo ma meno

dinamico

◦ Catastrofine: destabilizzando il MT

inducono la depolimerizzazione

Centrosoma: organizzazione dei MT, composizione:

- matrice amorfa e anelli di γ-tubulina

- contiene due centrioli fatti di MT

FUNZIONE DELLE PROTEINE MULTIMETRICHE

- Si legano ai MT e li collegano tra di loro

- CHINESINE e DINEINE durante mitosi separazione favorita da queste proteine

muovono verso muovono verso

polo (+) polo (-)

Capacità di movimento dovute alla continua fosforilazione ADP e defosforilazione ATP.

CITOCHINESI: (divisione del citoplasma)

invaginamento sup cellulare (solco di clivaggio) che divide in due la cellula. Operato da

microfilamenti di actina (anello contrattile) che interagiscono con molecole di miosina.

PRAGMOPLASTI: vescicole che operano divisione citoplasma nelle cellule vegetali.

CONTROLLO DEL CICLO CELLULARE

Fusione cellulare:

G1 + S → il G1 va in fase S

S + G2 → G2 rimane G2 e S rimane S

G1 + G2 → G2 rimane G2 e G1 rimane G1

(G1/S/G2) + M → entrano in fase M

punti di controllo del ciclo cellulare:

1. inizio fase M

2. fine fase M

3. inizio fase S (o fine fase G1)

Controllo ciclo cellulare da due famiglie di proteine

a) Cinasi ciclina dipendenti (CdK)

attivate da cicline → inducono processi a cascata di fosforilazione proteine (inibizione o stimolo)

b) Cicline: si legano a CdK per attivarle

- Ribonucleotide riduttasi (house keeping) presente in tutto il ciclo cellulare da sostegno alla

cellula

- [ ] cicline varia durante il ciclo cellulare (picco di massima tra fase G1 e S)

quattro classi di cicline: 1) Cicline G1 → S: legano la Cdk alla fine della fase G1 rendono cellule

pronte alla fase S (Cicline E)

2) Cicline S: legano la Cdk2 durante la fase S fondamentali per la

duplicazione (Cicline A)

3) Cicline M: promuovono la mitosi (Cicline B)

4) Cicline G1: favoriscono superamento del punto di restrizione in G1

ATTIVAZIONE CINASI: legata a formazione complesso Cinasi-Ciclina + Gruppo fosfato

(attivatore) .

MPF (Mitosi Promoting Factor) = Ciclina B – Cdk1

CICLO CELLULARE

- Ciclina A e Ciclina B sintetizzate in interfase poi degradate

- Degradazione : A) Ubiquitina si lega alla proteina

B) funziona da segnale per proteasomi

C) proteasomi contengono enzimi proteolitici

- Complesso APC promuove l'anafase stimolato quando MPF è elevato

CONTROLLO MITOSI: rilevamento problemi

Checkpoints possiedono trasduzione del messaggio

bersaglio

Mutazione checkpoints → Cancro

2 FASI IRREVERSIBILI : 1) Fine G2 → M : rottura membrana nucleare

2) metafase → anafase: disgiunzione cromosomica

2) metafase → anafase

cellule aneuploidi: se la cellula entra in anafase prima che tutti i cromosomi si siano attaccati al

fuso.

Se ciò accade il cromosoma rilascia un segnale che fa aspettare le cellule per la transizione

metafase → anafase

il bersaglio è associato al fuso

se l'anafase inizia in un fuso induce l'anafase in un fuso adiacente.

SEGNALE “ASPETTA L'ANAFASE” INIBISCE:

La disgiunzione dei cromatidi → previene distruzione coesine

 uscita dalla mitosi → previene degradazione Ciclina B => inattivazione Cdk 1



Per l'avvio dell'anafase è necessario che i complessi APC's (situati nel fuso mitotico prev ai poli)

 Ubiquitino bersagli come:

 Coesine => se assenti i cromatidi fratelli si separano

 Ciclina B => Se assente il complesso attivato MPF (Ciclina B-Cdk1) diventa INATTIVO

Cdk1 → APC → AVVIO → ANAFASE → INATTIVAZIONE CICLINA B

Attivo o Inattivo: dipende dai filamenti a corona che si trovano nel centromero del cromosoma

(NON legato al fuso)

Filamenti a corona → agiscono da siti catalitici per convertire MAD2 da inattivo ad attivo che a sua

volta lega ed inibisce CDC20 (attivatore APC)

=>

terminati i siti CDC20 ATTIVA tutti centromeri attaccati al fuso => APC ATTIVA

Checkpoint:

a) verifica attaccamento centromeri

b) MAD, BUB, CDC20 via trasduzione del segnale

c) inibita APC ipedendo ubiquitinazione di quelle proteine che debbono essere degradate per

consentire transizione Metafase → Anafase

P53 E CONTROLLO INTEGRITA' DNA (Checkpoint)

Se cellula presenta danno a DNA la p53 percepisce il danno.

Attivazione Cinasi → fosforilazione p53 → dissociazione subunità → attivazione catalisi di

trascrizione specifica → traduzione proteine → Blocco cinasi-ciclina (effettuato da p27) → arresto

del ciclo cellulare → arresto del ciclo cellulare

Recettori cellulari + ligando → modifica conformazionale →

influenza sul nucleo → controllo dellla produzione di proteine che

favoriscono la progressione del ciclo cellulare → modificazione sito

di legame integrina → legame integrina-substrato → attivazione di

segnali cellulari.

CHECKPOINTS:

(1) Fase G1: - Verificano che la cellula sia aumentata di dimensioni

- Verificano che non ci siano danni al DNA

(2) Fase S: - DNA sia replicato correttamente

(3) Fase G2: - Verificano che la cellula sia aumentata di dimensioni

- Che non ci siano danni al DNA

(4) Mitosi: - Verifica collegamento cromosomi con fibre del fuso (p53)

MORTE CELLULARE

Apoptosi: morte cellulare programmata, principali eventi apoptici:

Condensazione cromatina (+ visibile)

 Frammentazione nucleo e citoplasma

 formazione corpi apoptici

 eliminazione corpi apoptici



Necrosi: morte cellulare per cause naturali o per agenti esterni, pressione elevata fino a far

scoppiare la cellula e spargere il suo contenuto nello spazio intracellulare.

Eventi legati alla necrosi: rigonfiamento

 dilatazione REL

 perdita ribosomi dal RER

 Esfoliazioni contenenti citoplasma

 grave dilatazione più corpi densi

 rigonfiamento rottura e infiammazioni locali



Degradazione DNA durante apoptosi

- La quantità di DNA deve essere pari ad 1 se è minore, DNA viene degradato.

- struttura DNA degradata da enzimi esonucleasici.

Inibizione e attivazione apoptosi

- Modificazione della membrana plasmatica delle cellule apoptiche.

- la fosfatidilserina si mette sulla membrana e funziona da marcatore cellulare per una proteina

annessina V => si lega ad essa => segnala ai macrofagi di fagocitare la cellula morente

◦ blocca infiammazione causata dai fagociti

◦ inbisce produzione delle prot (citochine) che inducono

l'infiammazione

Via intrinseca → mitocondri

Via estrinseca → membrana plasmatica

Classi proteiche coinvolte nel processo apoptico:

1. Anti-apoptotic Bcl-2 protein: → Bcl-2, Bcl-X L

2. Pro-apoptotic BH 1 2 3 protein: → Bax, Bak

3. Pro-apoptotic BH 3 only protein: → Bad, Bim, Bid, Puma, Noxa

Meccanismi pro e anti apoptici

1. Proteine BH 1 2 3 sono sulla membrana mitocondriale, ricevendo segnale da proteine Pro-

apoptotic BH 1 2 3, formano un canale ionico che si riversa nel citosol dove passa citocromo

c => inizio apoptosi

2. Può essere inibito da Bcl-2 Anti-apoptotic protein

3. ma Bcl-2 può essere inibito da Pro-apoptotic BH 3 only protein

Cascata capsasica

La proteina BAD (pr