Dispense appunti complete di Citologia

Il trasporto all'interno del nucleo e tra organuli cellulari

Il trasporto all'interno del nucleo avviene tramite i pori nucleari. Il trasporto ai mitocondri e ai perossisomi avviene attraverso le membrane, non per diffusione, ma tramite delle "porte" che permettono l'ingresso delle proteine in questi organuli. Questo meccanismo funziona anche nel RER. Invece, dal RER al Golgi, dal Golgi ai lisosomi o dal RER ai lisosomi, il trasporto avviene sempre mediante trasporto vescicolare.

Segnale proteico → peptide segnale

La scoperta della presenza di un peptide segnale è avvenuta in seguito a un esperimento. Vengono prese due proteine:

• Una proteina citoplasmatica sprovvista di una sequenza segnale
• Una proteina con destinazione finale RER provvista di sequenza segnale

Alla proteina citoplasmatica è stata aggiunta una sequenza segnale che indicava come destinazione finale il RER; alla proteina già provvista della sequenza segnale le è stata tolta. Studiando le due proteine, è stato osservato che quella che inizialmente era

proteinacitoplasmatica aveva raggiunto il RER, mentre quella che inizialmente era destinata al RER rimaneva nel citoplasma. Perciò si è dedotto che la cellula, ad ogni famiglia di proteine, mette un'etichetta che corrisponde alla loro destinazione finale → peptide segnale. Questa è la condizione minima, ma necessaria, affinché la cellula capisca dove deve essere destinata la proteina. Le proteine senza peptide segnale rimangono nel citoplasma.

Per questioni di efficienza, il peptide segnale viene localizzato all'estremità ammino-terminale, ovvero quella che viene sintetizzata per prima → in questo modo la cellula sa fin da subito la sua destinazione finale.

Per alcune proteine (non per quelle destinate al RER) il peptide segnale, a livello della struttura primaria, può non essere costituito da amminoacidi adiacenti gli uni agli altri. L'importante però è che il peptide segnale, una volta raggiunta la struttura terziaria,

Sia rivolto verso la periferia della cellula stessa, in modo tale che la cellula possa leggere il segnale.

Smistamento delle proteine destinate al nucleo (assemblate nel citoplasma)

Il trasferimento delle proteine al nucleo avviene tramite i pori nucleari → le proteine che entrano vengono precedentemente sintetizzate in modo completo sui poliribosomi del citoplasma e, dopo aver raggiunto la loro struttura terziaria (non per forza), vengono destinate al nucleo grazie alla presenza del peptide segnale.

Esperimento

Lo Xenopus Laevis è un animale utilizzato in laboratorio come cavia per gli esperimenti → questo perché i suoi ovociti (uova non fecondate) sono facili da ricavare e da vedere a occhio nudo.

Sono state prese le sue uova, non fecondate, da usare come incubatori dell’esperimento: hanno preso una proteina, la nucleoplasmina (=proteina diretta al nucleo) e l’hanno iniettata nel citoplasma. La proteina nell’immagine viene rappresentata come uno spillo.

testa-coda. Poi hanno preso una proteina radioattiva, l'hanno iniettata e, dopo averla lasciata nel citoplasma per un po' di tempo, hanno eseguito l'annerimento → tecnica per capire da quale compartimento cellulare arrivasse l'annerimento. In questo caso, l'annerimento arrivava dal nucleo.

In esperimenti successivi, la proteina veniva tagliata in due (testa e coda) e, sempre dopo essere stata sintetizzata in vitro con un elemento radioattivo, iniettata nel citoplasma:

• In una parte di ovociti è stata iniettata la testa;
• In una parte di ovociti è stata iniettata la coda.

Solamente la parte di proteina che si riferiva alla coda finiva nel citoplasma, l'altra no. Quindi avevano dedotto che ci doveva essere una parte di informazione che risiedeva nella testa.

Così, nei successivi esperimenti hanno preso le code, le hanno fatte sintetizzare in modo radioattivo e le hanno coniugate con delle nano particelle d'oro, molto elettrondense. Poi,

tramite l'acquisizione di immagini in microscopia elettronica a trasmissione, hanno visto che le particelle di oro si localizzavano a livello dell'involucro nucleare non in modo omogeneo lungo la membrana nucleare esterna ma in particolari distretti. Studi successivi hanno portato a verificare che proprio in queste parti di involucro nucleare ci fosse la presenza di proteine del poro nucleare. Con tutti questi esperimenti, molto complessi, sono arrivati alla conclusione che: non è la proteina a dare il segnale, ma un determinato segnale situato sulla proteina che indirizza la proteina stessa verso il poro nucleare. Trasporti a livello del poro nucleare: Poro nucleare → ottagono di proteine citoplasmatiche + 8 proteine filamentose. Svolge due tipi di trasporti: - Passivo: il poro, anche quando è "chiuso", ha dei punti molto piccoli da cui le proteine con dimensione inferiore ai 10 nm possono passare. Questo passaggio attraverso il poro nucleare avviene inmodo passivo, secondo gradiente e senza il bisogno di energia chimica. Attivo: La maggior parte delle proteine dirette al nucleo deve andarci con un trasporto attivo, in quanto troppo grandi. Come avviene il trasporto? La proteina destinata al nucleo si aggancia con il peptide segnale che resta esposto esternamente (nella figura in rosso). Poi, una famiglia di proteine presenti a livello del citoplasma chiamata importine, riconoscono (sempre con il meccanismo chiave serratura) la parte segnale della proteina. L'agganciano e l'accompagnano verso il poro nucleare. Una volta giunte a destinazione, le proteine filamentose aiutano il complesso in modo tale che questo si fermi a livello del poro nucleare così che la proteina ci entri dentro. A questo punto, l'importina si stacca e rincomincia il ciclo prendendo un'altra proteina. Il trasporto all'interno del poro nucleare necessita di energia che viene presa dall'idrolisi di GTP → proteina che idrolizza il.GTP: RAN. Questo processo che viene usato per l'importazione viene utilizzato anche per l'esportazione. Cosa può essere esportato? Subunità ribosomiali, mRNA, tRNA, rRNA -> sintetizzati nel nucleo ed esportati nel citoplasma. Cosa può essere importato? Tutte le proteine che servono all'interno del nucleo: elicasi, nucleasi, DNA e RNA polimerasi. Smistamento delle proteine destinate ai mitocondri (assemblate nel citoplasma) Non c'è una vera proteina che accompagna la proteina destinata al mitocondrio nei pressi della membrana mitocondriale interna ma, a livello membranamitocondriale esterna, c'è una proteina transmembrana (non più citoplasmatica ma transmembrana) che riconosce il segnale del peptide segnale della proteina da importare. Per poter far passare la proteina dal citoplasma alla matrice mitocondriale c'è bisogno di un canale, formato da due complessi traslocatori: - Uno situato sulla membranamitocondriale interna → TIM- Uno situato sulla membrana mitocondriale esterna → TOM Se non ci sono proteine da importare nel mitocondrio, i due complessi traslocatori non sono allineati. Quando ci sono le proteine, i due si allineano e la proteina può passare: il recettore situato sulla membrana esterna la riconosce e questa entra nel mitocondrio. La proteina da importare nel mitocondrio però deve perdere la sua struttura terziaria → intervengono quindi le hsp70 (Heat shock proteins), proteine citoplasmatiche che che srotolano la proteina in modo che entri "come filo e non come gomitolo". Le hsp70 però hanno bisogno di energia per permettere l'ingresso in TOM → dopo che avviene lo srotolamento, le hsp70 si staccano e idrolizzano una molecola di ATP. I due traslocatori sono allineati, la proteina è srotolata e così può entrare. Una volta arrivata nella matrice, la proteina è srotolata e il peptide segnale.può essere tagliato → il taglio lo esegue una proteasi specifica. Nella matrice mitocondriale esiste un altro pool di hsp70 → le hsp70mitocondriali. Quando la proteina sbuca a livello della matrice mitocondriale, questa deve riacquistare la sua struttura terziaria → è proprio grazie all'associazione delle hsp70 mitocondriali alla proteina che ciò può avvenire. Quando questa riacquista la sua struttura terziaria, le hsp70 si dissociano idrolizzando altro ATP. L'ATP quindi non serve per far traslocare la proteina tra TOM e TIM, ma serve per far perdere la conformazione della proteina a livello del citoplasma e fargliela riacquistare a livello della matrice mitocondriale. Smistamento delle proteine destinate ai perossisomi (assemblate nel citoplasma) La proteina viene sintetizzata completamente a livello del citoplasma e in questo caso il peptide segnale è molto corto → serina, lisina e leucina formano il tripeptide SKL. La famigliadelle perossisomine (proteine del lume dei perossisomi) viene trasferita ai perossisomi dal RER attraverso la formazione di vescicole. Questo processo di trasporto vescicolare è un processo attuato dai lieviti, dai mammiferi e dalle piante → in tutti e 3 esiste quindi una zona del RER in cui vengono sintetizzate proteine che poi vengono portate ai perossisomi mediante il processo di vescicolazione. Per tutte le altre proteine sintetizzate a livello dei ribosomi del citosol e destinate al lume dei perossisomi, invece, funziona in modo diverso. Risulta comunque un trasporto semplice in quanto nei perossisomi non è presente una doppia membrana. Prendiamo l'esempio della catalasi: la catalasi è un enzima tetramerico e ogni sua subunità lega un gruppo eme. Inizialmente si pensava che ogni singola subunità della catalasi venisse internalizzata attraverso un recettore che riconosceva la subunità e che funzionava anche da traslocatore. SolamenteUna volta importate, le singole subunità si associavano all'eme e poi venivano assemblate fino a raggiungere la struttura quaternaria, caratteristica della proteina multimerica. Recentemente, però, si è scoperto che la catalasi si assembla nel citoplasma. Cosa avviene con la catalasi? I peptidi segnale SKL, a livello del citoplasma, si associano ad ogni subunità del tetramero che, a sua volta, si associano ad un gruppo eme. In prossimità del perossisoma, il complesso incontra una perossisomina → essa fa da recettore riconoscendo il peptide SKL sulla catalasi. A questo punto la perossisomina viene riconosciuta dal traslocatore e la catalasi può entrare nella matrice mitocondriale. Una proteasi stacca i peptidi segnale e libera la proteina nell'ume. Smistamento di proteine all'i