Diagnostica microbiologica

Diagnostica microbiologica

Introduzione alla diagnostica microbiologica

Si parte a parlare di diagnostica microbiologica come risultato di esperimenti e valutazioni di Robert Koch, dove con diagnostica microbiologica intendiamo la capacità di essere in grado di ricavare da un campione biologico umano informazioni affidabili relative alla diagnosi di uno stato di salute di un individuo.

Inoltre, non è da pensare strettamente la diagnostica come il fare un esame clinico di un campione in cui chiunque può farlo una volta imparata la tecnica, comunicando poi il referto, ma ci sono a monte e a valle una serie di ragionamenti che solo chi è esperto nel campo della microbiologia può fare e arrivare alle conclusioni precise e sensibili di quella determinata infezione.

Ora, l’evoluzione della diagnostica microbiologica viene direttamente dai postulati di Koch perché è colui che ha per primo determinato quelle procedure sulle quali ancora oggi, e per sempre, gli scienziati quando vedono nuove epidemie si basano per poter identificare univocamente il tipo di patogeno che causa quella infezione e malattia.

Questi postulati riguardano il fatto che quando si vuole scoprire se un paziente ha una certa infezione, il 1^° postulato dice che il microorganismo deve essere sempre trovato in tutti i casi del paziente che ha quella malattia; il 2^° postulato dice che se quel patogeno dà quella malattia, quel patogeno deve essere cresciuto o isolato in coltura pura in vitro, da tutti i pazienti che hanno quella malattia, mentre nei pazienti che non hanno malattia non ci deve essere; nel 3^° postulato si dice che tale microorganismo può essere inoculato in un animale che deve riprodurre per filo e per segno la stessa patologia; il 4^° postulato dice che anche in questo animale deve essere isolato di nuovo solamente in coltura pura il patogeno determinante la malattia, e sulla base di questi 4 postulati, Koch dice è vero che la malattia è basata su quel patogeno.

Con l’evoluzione delle tecniche questi stessi postulati sono poi stati visti in forma genomica, ad oggi parliamo non solo di microorganismo, ma possiamo anche parlare di genoma o segmento genetico di un microorganismo presente solo nei pazienti malati, quindi riadattando i postulati sul concetto di genoma o frammento genetico, potendo estrarre acidi nucleici applicando le tecniche di biologia molecolare.

Con l’evoluzione della diagnostica microbiologica si passa dalle colture batteriche su piastre che si eseguivano semplicemente su bancone, alla preparazione dei terreni facendolo con polveri e sterilizzando il materiale. Così come l’evoluzione ha permesso l’isolamento virale che è stato reso possibile con le colture cellulari, ma anche ha portato alle tecniche di tipizzazione automatizzata dei batteri e tecniche di biologie molecolari.

Alle origini della diagnostica si pensava che i giusti equipaggiamenti di un laboratorio microbiologico fossero microscopi e incubatori per coltivare batteri, e ci voleva la pazienza del microbiologo per aspettare il tempo sufficiente a identificare il patogeno, era infatti un percorso molto lungo di settimane, era ovviamente meno precisa e meno automatizzabile di oggi, però forse a quei tempi c’era anche la consapevolezza che il microbiologo che faceva questa indagine doveva essere un vero esperto microbiologo.

È importante fare la diagnosi di agenti infettivi perché la cosa principale è fornire una diagnosi eziologica, ovvero dire quel paziente che ha quella malattia, se è data da virus, batterio e da quale specifico virus o batterio, però è anche importante per poter adottare una terapia mirata per quel determinato agente infettivo trovato nel fare la diagnosi eziologica, ed è importante saperlo perché non tutti gli agenti infettivi hanno una terapia conosciuta e per altro aggiungendo il problema della resistenza è importante scegliere la terapia corretta.

Poi è importante anche per individuare quelli che sono detti casi sentinella nei casi di epidemie e pandemie che possono apparire all’improvviso e per i primi tempi non far capire da cosa siano date, e questo comporta che in rari casi, ma possono succedere, le epidemie possono diventare pandemie, quindi capire all’inizio i casi sentinella che danno quella malattia, se sono legati a agenti infettivi normalmente circolanti o agenti infettivi nuovi, è importante.

Infine, è molto importante la diagnostica anche nel caso dell’ambito epidemiologico, tipico esempio è quello dell’influenza in cui è importante capire come circola e come varia perché ogni anno su questi dati ci si basa per fare i vaccini anti-influenzali.

Campi della microbiologia clinica e diagnostica

• Batteriologia, quindi la ricerca dei batteri, che studia sia i batteri aerobi che anaerobi.
• Microbatteriologia, che è un ramo della batteriologia specifico per i batteri solo acido resistenti, e si chiama anche Acid-fast bacteriology (detta anche come AFB) che studia quindi un ramo molto selettivo della batteriologia.
• Micologia, che studia i funghi.
• Parassitologia.
• Virologia.
• Sierologia, in cui si comprende tutti quanti i test sierologici per qualsiasi tipo di infezione, ricercando gli Ab.
• Diagnosi molecolare, in cui si fa PCR e quindi si parla soprattutto di tecniche di biologia molecolare per la ricerca di genomi di batteri, virus e altro.

Quindi in tecniche di metodiche abbiamo la microscopia, per vedere morfologia di cellule batteriche, fungine o parassitarie, e vediamo come alcune tecniche che si basano solo sull’osservazione microscopica possono essere fondamentali e immediate per dare la risposta diagnostica, quindi anche se una tecnica semplice e molto antica, è sicuramente una delle tecniche più immediate e spesso sufficiente.

Poi importanti sono tutte le colorazioni, analisi biochimiche, come analisi delle caratteristiche metaboliche e biochimiche di un agente infettivo, batteri e funghi in primis, poi importante la crescita di microorganismi in presenza/assenza di antibiotici, per cercare resistenza e sensibilità.

Importante anche la ricerca genomica o anche la spettrometria di massa, e in genere sono tutte tecniche utilizzabili, ma il microbiologo deve sapere quale è quella immediata da usare in base al tipo di agente infettivo da ricercare, e spesso la tecnica più adatta in certi casi è anche la più semplice. Lo scopo è infatti è sempre di fornire in tempi brevi, in modo accurato e specifico una risposta al clinico, con alta sensibilità e specificità, permettendogli ovviamente di dare la decisione del trattamento da dare al paziente in analisi. Non ultima importante è anche la parte economica, ovvero basso costo/efficacia nella risposta diagnostica, ovvero che se possiamo trovare risposte senza usare tecniche innovative che costano tanto, è molto importante e vale la pena allora usare tecniche che ci fanno spendere di meno.

Quindi, gli obiettivi come detto sono la dimostrazione eziologia dell’infezione, associazione con la malattia (correlazione della diagnosi eziologica con il quadro clinico e anamnestico) e poi il follow-up del paziente, ovvero capire quando l’infezione sparisce, oppure se è cronica serve seguirla nel tempo per capire gravità e attività del patogeno, poi serve a capire la risposta a una terapia, soprattutto in infezione cronica, serve anche in caso di comprensione della trasmissione materno-fetale, e anche molto utile nel caso di infezioni in pazienti trapiantati o immunocompromessi.

Approcci diagnostici

Ora, gli approcci diagnostici, qualsiasi tipo sia la metodica che scegliamo, sono divisi in due categorie, possiamo avere una diagnosi diretta, ovvero sono le tecniche che vanno o alla ricerca del patogeno, per esempio isolandolo e cercandolo in quanto tale, oppure una ricerca di parti del patogeno come proteine, acidi nucleici o anche suoi componenti o prodotti, in questo caso però potrebbe anche dirci che c’è stato il patogeno, ma potrebbe non essere più in fase infettiva.

Per esempio il Coronavirus di oggi a cui un paziente risulta positivo, all’inizio si faceva quarantena di 20 e più giorni, perché cercando acidi nucleici il paziente era positivo non solo in fase acuta quando manifestava anche le varie manifestazioni cliniche, ma era positivo anche dopo settimane, ma per cautelare che il paziente non potesse trasmettere il virus, si teneva a casa. Tuttavia, gli studi dei virologi che hanno seguito in molti ospedali pazienti, isolando acidi nucleici e virus nel tempo, si sono accorti una cosa che vale anche per tanti altri agenti infettivi come l’influenza, ovvero che se dopo 5 gg se il paziente è positivo possiamo anche isolare il virus, ma nella gran parte dei casi dopo il 7^°/10^° giorno, i casi in cui si riesce a isolare il virus erano molto bassi, quindi in sostanza non era isolabile, però facendo test di biologia molecolare per gli acidi nucleici o anche facendo un test antigenico, il paziente era positivo anche dopo 30-40 giorni. Ma ovviamente i pazienti positivi ancora dopo settimane capaci di infettare erano molto remoti.

Quindi il messaggio è che in analisi diretta possiamo trovare tracce del virus anche dopo tantissimo dall’infezione, ma non è detto che sia più infettivo. L’altra parte della diagnostica è la diagnosi indiretta, che è l’ideale in certi casi, in cui si prende il siero del paziente cercando la presenza della risposta immunitaria all’infezione, e quindi se c’è possiamo essere sicuri che l’infezione c’è, però è anche importante capire che non sia una risposta immunitaria passata.

Però per esempio per certi virus o patogeni si usa direttamente la diagnosi indiretta, come per fare diagnosi da HIV che serve sempre a capire la positività o meno, ma sempre nel caso per esempio di Coronavirus non si può fare una semplice analisi una volta di siero, perché in questo caso dovremmo fare ricerca anticorpale al momento 0 e poi anche più tardi per capire se la risposta è aumentata, diminuita, cosa che ci fa capire anche in che momento siamo dell’eventuale infezione.

Questo è importante però la diagnosi indiretta non possiamo farla su neonati perché hanno Ab che non sono loro, ma sono di origine materna, allora per neonati si fa ricerca diretta, così come nei pazienti che sono immunocompromessi non possiamo fare ricerca indiretta perché non hanno Ab ovviamente.

Per la diagnosi diretta vedremo che abbiamo metodi convenzionali basati sull’isolamento in coltura del patogeno e la sua identificazione, e poi anche si ha metodi rapidi, per batteri potrebbe anche essere la sola osservazione microscopica, ma anche ricerca di antigeni e del genoma. I campioni nella diagnosi diretta sono tanti, ovvero sangue, urina, feci, espettorato, biopsie, e in genere tutti liquidi e cellule prelevabili, sia in modo invasivo che non invasivo. I campioni naturalmente devono però essere prelevati dal sito reale dell’infezione, nel momento giusto e prima dell’inizio della terapia, ed è il microbiologo che fornisce dettagli su che tipo di tessuto è importante prelevare in base al tipo di patogeno, infatti il patogeno potrebbe essere in tanti tessuti, ma è importante prenderlo nel tessuto che so che mi possa dare la massima resa.

Inoltre altra cosa importante è che i campioni devono essere conservati adeguatamente al metodo usato per la ricerca diretta, questo perché non tutti i campioni che uno preleva con determinati metodi sono idonei a fare tutto, lo stesso sangue per esempio, se lo preleviamo senza anticoagulanti, dopo un po’ coagulerà e quindi non potremmo ottenere per esempio le cellule, potremmo prendere il siero, ma non la parte cellulare. Inoltre anche nello stesso anticoagulante che invece potremmo decidere di usare, ci sono certi anticoagulanti che usiamo in certe condizioni sperimentali piuttosto che in altre.

Nell’ambito dei metodi convenzionali per esempio troviamo isolamento dell’agente infettivo, identificazione e saggio di sensibilità ai farmaci, e in particolare l’isolamento prevede che i batteri, quasi tutti, possono essere isolati con terreni artificiali, spesso fatti direttamente dalle ditte, ma ci sono anche però alcuni batteri non coltivabili, altri batteri invece addirittura hanno necessità di colture perché sono per esempio parassiti obbligati, così come i virus che possono essere isolati soltanto in colture cellulari, però anche nei virus non tutti sono coltivabili, o meglio, non tutti sono coltivabili facilmente.

Il microbiologo quindi deve anche rispettare alcune procedure però nel poter eseguire tutto questo, quindi è importante vedere che collabora con la figura del clinico per definire i protocolli diagnostici disgiunti dei percorsi clinici condivisi, questo per stabilire un certo percorso diagnostico, poi deve anche garantire requisiti di qualità, tutto è infatti tracciabile, poi deve aderire ai progetti di accreditamento (sempre ambito di controllo).

E volendo vedere punto per punto vediamo che abbiamo una fase pre-analitica, in cui si fa la richiesta dell’indagine che viene fatta dal clinico, poi si esegue il prelievo del campione, conservato nel modo migliore possibile, viene trasportato in modo ottimale, e poi deve essere accettato e segnato quando è arrivato in laboratorio.

Dopo la fase pre-analitica c’è la fase analitica, eseguiamo quindi l’esame e poi validiamo il risultato; infine c’è la fase di tipo post-analitica con refertazione del risultato e elaborazione statistica che per esempio è importante per capire se in una serie di risposte un patogeno diventa predominante e quindi è importante per capire un inizio di incremento di positività, questo sapendo anche per esempio il periodo e la stagione, o anche conoscendo l’area geografica, importante sempre in contesti epidemiologici, ma poi anche importante per capire se possono esserci errori nell’analisi. Infatti se mi trovassi un risultato particolarmente diverso dalle casistiche generali allora potrebbe essere un errore.

Isolamento virale

La cosa fondamentale per isolare un virus è sapere dove si può trovare e quale campione clinico va prelevato e nel momento in cui va prelevato, sennò si rischia di fare un insieme di metodiche che non portano a nulla perché abbiamo sbagliato il campione clinico da utilizzare.

Per esempio per i virus influenzali e adenovirus siccome riguardano l’apparato respiratorio allora possiamo prendere tamponi nasali, aspirati nasali, ma c’è anche l’urina perché alcuni di questi virus come il citomegalovirus e morbillo, in certi momenti della loro infezione, essendo virus persistenti, li troviamo anche in campioni diversi dalle vie respiratorie e quindi dobbiamo sapere che ce li possiamo trovare ma solo in certi momenti dell’infezione. L’apparato gastroenterico abbiamo rotavirus soprattutto nei bambini e l’adenovirus che possiamo ottenerli con tampone rettale, feci o urine.

La cute è un organo bersaglio per quanto riguarda il papilloma virus sottoforma di verruche che possono essere fonte di campione clinico per ottenere questi virus. Il morbillo lo possiamo anche trovare in campione di liquido cefalo-rachidiano se quel paziente ha una sospetta meningite o encefalite con compromissione del SNC. E poi ci sono certi virus che si ritrovano facendo tamponi uretrali, vaginali o nella cervice perché sono trasmessi per via sessuale.

Ora, l’isolamento del virus, sia in animali e ultimamente anche in colture cellulari, esiste uno spartiacque che sono gli anni ’80, perché prima nell’era detta pre-molecolare, le colture cellulari ne facevano da padrone, era uno dei modi in cui potevamo amplificare il virus di interesse per studiarlo o analizzarlo, dopo gli anni ’80 iniziarono a essere convalidate anche in diagnostica, oltre che ricerca, le metodiche molecolari e quindi sono metodiche che non richiedono isolamento perché sono loro ad amplificare il bersaglio che cerchiamo.

Quindi, agli inizi del ‘900 le cellule umane iniziarono ad essere propagate in vitro pensando di usare questo supporto per amplificare e coltivare i virus, le prime tecniche furono applicate intorno al 194 quando per le prime volte furono coltivati virus del vaiolo, della febbre gialla, poliovirus ecc… Dal 1970 le colture cellulari diventarono il vero gold standard per la diagnosi dell’infezione da virus, a fronte anche della nascita di altre nuove tecniche. Sono poi passati altri 20 anni per vedere la presa di sopravvento della biologia molecolare che ad oggi infatti sono diventati sicuramente il vero gold standard.

La colture virali hanno avuto un’evoluzione nel tempo, passando dalle colture cellulari tradizionali, in cui il vantaggio era l’isolamento virale, ma con svantaggio che era una metodica abbastanza lunga e necessitava di esperienza dell’operatore per capire se il virus si stava replicando o meno.

Dopo questa metodica, negli anni ’80 sono nate colture dette shellvials in cui veniva fatta una metodica che rendeva più rapida la coltivazione virale sulle cellule, quindi come vantaggio è che c’era un minor tempo che trascorreva dalla semina del campione al risultato finale, ma come svantaggio si ha che queste metodiche non richiedevano e richiedono, dato che ancora si usano, l’isolamento del virus.

Nel ’90 sono poi nate co-coltivazioni in cui si potevano fare più infezioni e quindi come vantaggio è che ci possiamo seminare vari virus ma ovviamente lo svantaggio è che come le shellvials poi non richiedevano isolamento virale. Dopodiché sono nate anche le colture transgeniche che permettono l’isolamento di determinati virus meno replicanti su cellule normali, però anche queste colture sono molto laboriose e costose rispetto alle altre. Tutte queste tipologie di colture tutt’oggi sono pochissimo usate perché ci sono tante altre metodiche molecolari che le hanno ormai sovrastate.

E quindi si può parlare di un laboratorio multi specialistico in cui ci sono tantissime tipologie di indagine che si fanno e non necessariamente dobbiamo coltivare i virus per ottenere risultati diagnostici affidabili. Il progresso della biologia molecolare ha portato a metodi più rapidi e meno laboriosi, aumentando l'efficienza e l'accuratezza delle diagnosi.