Diagnostica

PROTEOMICA E METABOLOMICA

Le scienze omiche sono nate per identificare nuovi marcatori - inizialmente nella fase di discovery sono detti putativi, devono essere validati e costruiti test analitici per utilizzarli in laboratorio di diagnostica clinica. Devo fare una quantizzazione e una comparazione tramite diverse tecniche che possono riguardare lo studio del proteoma, metaboloma e genoma. L'obiettivo è cercare di comprendere la biologia dei sistemi. Nel '75 si aveva a disposizione la spettrometria di massa, l'elettroforesi su gel e iniziavano i primi sequencing genomico - le tecniche avanzavano ognuna lungo la propria strada, entrano in stretta connessione quando sono stati introdotti gli algoritmi - nasce la proteomica: studiare e analizzare in un unico contesto proteine e peptidi estratti da tessuto o fluido biologico. C'erano anche altre tecnologie come NGS, tecnologie su chip - si inizia a valutare in senso omico anche i metaboliti.

metabolomica. Si è ancora lontani dalla system biology → bisogna mettere insieme tutto. I dati genomici sono ben conosciuti, quelli proteomici e metabolomici di meno.

Genomica: il campo della ricerca scientifica che usa tecnologie ad alto throughput (HT) per identificare e/o caratterizzare tutti i geni in una determinata cellula o tessuto o organismo (il genoma)

Proteomica: il campo della ricerca scientifica che usa tecnologie ad alto throughput (HT) per identificare e/o caratterizzre tutte le proteine e i peptidi inclusi le modificazioni post transduzionali in una determinata cellula, tessuto o organismo (il proteoma)

Metabolomica: il campo della ricerca scientifica che utilizza tecnologie ad alto throughput (HT) per identificare e/o caratterizzare tutte le piccole molecole o metaboliti in una determinata cellula, tessuto o organismo (il metaboloma).

PROTEOMICA

La proteomica è quella branca della scienza diretta allo studio delle proteine. Nel 1994 è stata definita

metodo scelto4. Range dinamico della MS usata che nel migliore dei casi non supera i 2 ordini di grandezza→ Più metodologie vanno combinate per avere successo

Si semplifica frazionando il campione:

• Per poter riconoscere tutte le proteine
• Per ridurre la complessità
• Per vedere anche le proteine meno abbondanti

ANALISI PROTEOMA

Esistono due schemi:

1. top down proteomic: studio pp intatte, prendo pp, le denaturo riducendole alla struttura primaria e le separo in base al punto isoelettrico e alla massa molecolare. Le identifico poi estraendole dal gel e trattandole con proteasi. Richiede molti più passaggi di bottom up
2. bottom up proteomic: prendo le pp estratte da un tessuto, digerisco tutto, taglio con tripsina, faccio colonna con HPLC ed analizzo interfacciando con spettrometro di massa → ricostruisco in silico il campione originario. Ci sono spettrometri di massa molto raffinati che permettono di differenziare per poco. E’ complicato però

importante → esistono appositi programmi. Bisogna non solo identificare la pp ma anche compararla con una situazione fisiologica o patologica. Quindi lo user:

1. Caricamento del dato
2. Impostazione dei parametri di:
• DESIGN sperimentale (es. tipologia digestione, marcatura, specie)
• ANALISI (es. strumento impiegato, MS2, MS3, frazionamento…)

Il software:

• MaxQuant corregge le imprecisioni generate durante la misura delle masse peptidiche → Mass calibration/Peaks detection
• Le masse dei peptidi vengono confrontate con quelle presenti in un database di sequenze e quindi valutate con un approccio probabilistico → Peptide Scoring
• Un approccio statistico basato sul false discovery rate viene utilizzato per limitare le identificazioni errate → FDR correction
• Le identificazioni peptidiche sono raggruppate in identificazioni proteiche e in base ai parametri di analisi viene effettuata la quantificazione → Protein quantification

VALIDAZIONE BIOMARKER

Bisogna avere sistemi

Per validare il biomarcatore ELISA e immunoblotting, ci sono tecnologie che permettono di analizzare il peptide putativo come biomarcatore. Una di queste tecnologie è la SRM (Selected Reaction Monitoring), che richiede l'utilizzo di uno standard interno. Gli standard interni sono sintetizzati e per questo sono costosi.

La SRM permette di monitorare in maniera specifica delle transizioni di un ben specifico peptide. Si tratta di una spettrometria di massa in tandem, ma viene utilizzata in clinica per monitorare i biomarcatori. È un modo molto rapido e preciso per quantizzare, selezionando specificatamente, il peptide che si desidera analizzare.

È importante riuscire ad estrarre solo il peptide di interesse da una miscela complessa. Si va a cercare proprio il peptide proteotipico che caratterizza la proteina che si vuole cercare. Una volta che è stato fatto il setup, è possibile utilizzare sempre quelle condizioni.

Inoltre, è possibile identificare più di un peptide utilizzando la tecnica MRM (Multiple Reaction Monitoring). Questa tecnica è adatta per tutte le tecniche per le quali si dispone di uno standard, ad esempio.

fosfolipidi che sono commercializzati, ho in commercio dipeptidi ma non sono caratteristici di alcune pp.

Nell spettrometria di massa per SRM devo scegliere un peptide proteotipico (20-25 aa) per una determinata pp → devo vedere solo quel determinato peptide: sistemo le condizioni per far sì che in spettrometria di massa passi solo quello specifico peptide.

Maldi imaging

Posso ad esempio differenziare tessuto sano da tessuto tumorale. È un sistema che utilizza una specie di piastrina di metallo conduttiva, su questa piastrina viene depositato il campione, dopo di che il campione viene coperto con una matrice che lo ingloba per evaporazione e lo porta dentro. La matrice è resistente all'azione del raggio laser, e quindi protegge il campione che voglio analizzare e nel momento in cui acquisisce l'energia del raggio non brucia il campione, ma la trasferisce delicatamente al campione. A questo punto le goccioline entrano nella camera da vuoto e si ha il

trasferimento degli ioni dalla matrice al campione, in questo modo il campione si ionizza e viene raccolto in base alla sua energia cinetica (frammenti leggeri arrivano prima di quelli pesanti). Le informazioni sono poi elaborate da un software. A ciascun colore corrispondono dei ben precisi ioni e quindi riesco ad attribuire una distribuzione ionica e di conseguenza una distribuzione peptidica e una distribuzione proteica sovrapponendo le due immagini che ho, cioè quella che ottengo dal MALDI e quella che ho colorando il tessuto con ematossilina eosina. Questo tipo di tecnica è importante perché la distribuzione dei peptidi è così precisa che permette di dire se si sta risecando un tumore si sta tagliando al punto giusto o se resecare anche i margini. Viene anche utilizzata per la biotipizzazione - riconoscere individui accomunati dallo stesso genotipo di una colonia batterica. Al momento l'identificazione di colonie batteriche è basata su

Determinate caratteristiche fenotipiche che le rendono riconoscibili e distinguibili da altre (crescita su differenti mezzi di coltura, morfologia della colonia, colorazione di Gram, reazioni biochimiche, caratteristiche nutrizionali). Tali tecniche permettono di ottenere identificazioni molto accurate per un gran numero di specie batteriche ma sono costose e richiedono molto tempo.

Si acquisiscono tutti gli spettri che corrispondono a biotipi diversi → si piastra la coltura sul vetrino, si lascia asciugare, si passa nello spettrometro che lo confronta col database dando una risposta immediata. Posso anche purificare la coltura facendo precipitazioni e usando il surnatante → spetti più puliti.

Il database permette di individuare un genus → deve aver uno score di identificazione superiore a 1.7, se ho campioni purificati ho score alti, ma anche se non purifico posso ottenerli.

METABOLOMA

Per metabolita intendiamo ogni molecola inorganica determinabile nell’organismo