Diagnostica di laboratorio delle malattie da infezione

ESAME MICROSCOPICO DIRETTO IN INCHIOSTRO DI CHINA:

L’inchiostro di China è utilizzato come mezzo di contrasto per evidenziare la presenza di microrganismi

capsulati (Cryptococcus neoformans) in campioni di liquor, urine, altri fluidi biologici o da colture. Cellule

lievitiformi gemmanti provviste di capsula (da 1 a 50-100 µm della specie Cryptococcus escludono

l’inchiostro, creando un alone intorno alla cellula di lievito). La procedura prevede di porre su un vetrino

portaoggetto una goccia del materiale o delle sospensioni cellulari da esaminare e una goccia di inchiostro

(diluito 1:3 con soluzione fisiologica).

Collocare un vetrino coprioggetto sulle due gocce evitando di imprigionare bolle d’aria. Le due sospensioni

si mescolano formando vari gradi di concentrazione delle particelle di carbone. Successivamente esaminare

il vetrino al microscopio in contrasto di fase a basso ingrandimento cercando l’area a densità ottimale di

inchiostro. La capsula appare come un alone chiaro intorno alla cellula fungina.

CRIPTOCOCCOSI L’agente eziologico è il Criptococcus neoformans var. neoformans

(sierotipo D) e var. gatti (sierotipi B e C); patogeno opportunista.

Contrariamente agli altri agenti eziologici di micosi sistemiche il

dimorfismo non è implicato nella patogenesi di C.neoformans,

crescendo come lievito (sferico, ovale) capsulato in coltura a 25°, 37°

e nei tessuti.

Sopravvive bene negli ambienti secchi (escrementi e resti di piccioni-

la sua presenza è strettamente correlata all’habitat dei piccioni).

Agente di micosi sistemiche; il polmone è la sede principale di

infezione; seguono cervello e meningi, prostata, lesioni cutanee e

osteomielite (infezione disseminata).

La criptococcosi è diffusa in tutto il mondo e le infezioni subcliniche

sono molto comuni.

Campioni clinici: liquor, pus e altri essudati.

Viene effettuato l’esame microscopio, colturale e test di agglutinazione per rivelare e quantificare l’antigene

capsulare polisaccaridico nel liquor o nel siero - particelle di lattice rivestite di anticorpi anti–criptococco di

coniglio.

ESAME MICROSCOPICO DOPO COLORAZIONE IN FLUORESCENZA:

Il Calcofluor white è un colorante fluorescente per il rilevamento di funghi nei campioni.

Il colorante si lega ai polisaccaridi che presentano legami beta 1-3 e 1-4 come cellulosa e chitina, quest’ultima

presente nella parete cellulare fungina, e fluoresce quando esposto a radiazioni UV.

La procedura prevede di porre su un vetrino il materiale da esaminare.

Il campione può essere colorato immediatamente o lasciato asciugare e fissato al calore.

Aggiungere una goccia di Calcofluor white e coprire con un vetrino coprioggetto e lasciare a temperatura

ambiente per circa tre minuti.

Esaminare il vetrino al microscopio a fluorescenza con una lampada ai vapori di mercurio.

A lunghezza d’onda tra 340 e 380 nm e con un filtro a 430 nm il materiale fluorescente sarà blu (con sfondo

rosso se si utilizza un colorante di contrasto), mentre a lunghezza d’onda tra 420 e 490 nm con un filtro a 515

nm il materiale fluorescente sarà verde.

ASPERIGILLUS spp.

Vi sono varie specie di Aspergillus (famiglia Moniliaceae della classe Hyphomicetes) (estremamente comuni

nell’ambiente). Di 900 specie identificate A.fumigatus, A.flavus, A.niger, A.terreus. sono quelle più spesso

associate a malattia invasiva. Il soggetto normale sano non è suscettibile all’aspergillosi sistemica. Si tratta di

un’infezione opportunista. Il tipo di malattia dipende dallo stato immunitario e fisiologico locale e

generale dell’ospite (fattori di debilitazione). Gli agenti eziologici sono

ubiquitari dell’ambiente, crescono in forma di muffe filamentose

producendo un numero impressionante di conidiospore (teste

conidiali) e non sono parte della normale flora microbica dell’uomo.

L’infezione avviene per inalazione di spore.

Aspergillosi allergica: inizialmente processo benigno per diventare

grave con il passare dell’età. La dispnea aumenta con l’età, portando a

bronchiectasie (dilatazione cronica delle vie aeree). Il collasso di un segmento polmonare può evolvere a

fibrosi. Nella colonizzazione secondaria: situazione cronica con sintomatologia lieve, ad eccezione di attacchi

di emottisi e modificazione patologiche del polmone che portano alla formazione di un “aspergilloma”: massa

sferica di elementi ifali settati attorcigliati e ramificati.

Aspergillosi sistemica: grave nel paziente immunocompromesso; il fungo diffonde attraverso i vasi ematici

dove le ife possono causare infarti ed emorraggie [Otomicosi (A. niger), Micotossicosi (A. flavus – aflatossine

= intossicazione per ingestione di vegetali contaminati = forse causa di cirrosi e epatocarcinoma in aree a

forte contaminazione alimentare da aflatossine).

Diagnosi di laboratorio:

• Esame microscopico con ematossilina-eosina o con colorazione di Gram per evidenziare le ife settate (o

argento metenamina di Gomori da preparati istologici per Aspergillus fumigatus)

• Esame microscopico con immunofluorescenza

• Esame colturale: identificazione presuntiva di genere è fatta sulla base delle caratteristiche morfologiche

(colonie cotonose bianche nelle prime 8 ore).

Diagnosi di aspergillosi invasiva viene considerata quando si osservano

nel campione clinico ife settate che si diramano ad intervalli regolari e

che tendono ad essere orientate nella stessa direzione.

(Colorazione mediante fluorescenza di un lavaggio broncoalveolare da

un caso clinico di aspergillosi)

COLORAZIONE DI GRAM:

Non è la colorazione elettiva per i miceti. I funghi sono generalmente Gram-positivi, anche se spesso

possono risultare scarsamente colorati.

COLORAZIONI EMATOLOGICHE: GIEMSA

Possono essere utili per evidenziare la presenza di forme intracellulari di Histoplasma capsulatum nel

sangue periferico, in campioni di midollo osseo, biopsie linfonodali o campioni da lesioni cutanee o

mucose. L’aspetto è quello di cellule lievitiformi colorate in blu, circondate da un alone chiaro,

dovuto alla presenza di parete incolore.

COLORAZIONI ISTOLOGICHE: IMPREGNAZIONE ARGENTICA DI GOMORI-GROCOTT

Le cisti si colorano dal blu rossastro fino al porpora scuro su fondo blu che si può decolorare con

tampone solfato. I trofozoiti non si colorano. L’esame microscopico più importante viene effettuato

soprattutto per pneumocistosi polmonare.

PNEUMOCISTOSI – Pneumocysti carinii/jiroveci

Pneumocysti carinii/jiroveci per anni è stato considerato un protozoo opportunista, inserito recentemente

nei funghi dell’uomo e di roditori, cani e gatti. E’ un microrganismo opportunista cosmopolita per l’uomo e

per gli altri mammiferi, molto comune nell’ambiente, si trasmette per inalazione di goccioline e un contatto

stretto.

Eucariote, unicellulare, privo di ergosterolo (componente essenziale della membrana fungina).

P.jiroveci è agente di infezioni respiratorie anche letali,

polmonite interstiziale, opportunista nei soggetti con

AIDS, non coltivabile in vitro (diagnosi attraverso

microscopia o diagnosi molecolare).

Il campione idoneo è il broncolavaggio.

Ubiquitario: anticorpi nella quasi totalità dei bambini nel

mondo. La malattia non è trasmessa a livello interumano,

sembra sia una riattivazione di infezione latente, cellule

quiescenti preesistenti nel parenchima polmonare.

Pneumocistosi – polmonite interstiziale plasmacellulare:

morte per soffocamento dovuta a reazione essudativa e

iperplasia delle pareti alveolari causate dall’invasività del

germe che porta all’inibizione degli scambi gassosi a livello

alveolare.

Forme incistate: infiammazione degli alveoli con formazione di essudato

che blocca scambi gassosi. Tipico il reperto radiografico.

Diagnosi: microscopia diretta di biopsie polmonari o secreto bronchiale

o BAL (Lavaggio bronco alveolare).

Terapia con trimethoprin-sulfametossazolo anche come profilassi dei

pazienti con AIDS.

3.4 ESAME MICROSCOPICO DIRETTO SU CAMPIONE FRESCO NELLA DIAGNOSI DI MALATTIE PARASSITARIE

L’identificazione del parassita è basata quasi esclusivamente sul riconoscimento dell’aspetto morfologico.

• A FRESCO: Acanthamoeba sp, Negleria sp., Entamoeba histolytica, Giardia sp.

• COLORAZIONE DIFFERENZIALI:

Giemsa (miscela di blu di metilene, azzurro B e eosina). Gli ioni di eosina carichi negativamente

colorano le componenti basiche della cellula dall’arancione al rosa, gli altri coloranti colorano le

strutture acide della cellula con varie gradazioni dal blu al porpora),

Ziehl-Neelsen -> Esaminare i vetrini al microscopio (40x e 100x). Le oocisti assumono una colorazione

variabile che va dal rosa, al rosso e al porpora intenso.

• Cryptosporidium: all'interno dell'oocisti, di forma rotondeggiante od ovale, sono visibili formazioni

puntiformi o a "virgola" di colore nero (sporozoiti); il colore rosso intenso delle oocisti spicca sul fondo

blu del preparato.

• Isospora: nelle oocisti mature sono visibili 2 sporocisti colorate in rosso, contornate da un alone chiaro

che le separa dalla parete dell'oocisti.

• Cyclospora: in media solo 1 oocisti su 4 assume il colore e appare tinta dal rosso al rosa; le restanti

oocisti appaiono come "fantasmi" rotondeggianti e incolori. Per colorare tutte le oocisti si può

utilizzare un metodo di colorazione con safranina che richiede però l'utilizzo di un forno a microonde.

• COLORAZIONE CON SOLUZIONE DI IODIO PER LA RIVELAZIONE DI PARASSITI NELLE FECI.

Essenziale pretrattamento con 10% formalina al fine di preservare la morfologia dei parassiti e

concentrazione mediante sedimentazione in etilacetato di formalina o flottazione con solfato di zinco

che consentono di separare le cisti protozoarie e le uova di elminti dal grosso del materiale. Segue

colorazione con soluzione di iodio.

• COLORAZIONE PERMANENTE: tricromica, ematossilina ferro, ematossilina-acido fosfotungstico di

Mallory. I vetrini vengono preparati da strisci di materiale fecale fissati con soluzione di Schaudinn.

L’esame microscopico diretto su feci viene effettuato per il riconoscimento di uova, larve di elminti e protozoi

intestinali. Poiché l'eliminazione dei parassiti non è continua è può presentare una fase di eclissi, viene

raccomandata la raccolta di 3 campioni, in giorni non consecutivi e al massimo nell'arco di 10 giorni.

Viene effettuato a fresco con sol. fisiologica o soluzione di iodio al fine di evidenziare trofozoiti e larve

(Strongiloides sp), ma anche uova di elminti, cisti di protozoi e cellule dell’ospite quali leucociti ed eritrociti

(per valutare il tipo di motilità).

STRONGILOIDES STERCORALIS

Verme nematode ad uncino che penetra nella cute entra in circolo e segue la via polmonare.