Diagnostica immunologica

Diagnostica immunologica

Professori Cosmi e Liotta - A.A. 2022/2023

Parte 1 – Prof. Liotta

Autoanticorpi per la diagnosi di malattie autoimmuni

Lezione 1 – 07.10

In particolare ora parliamo di autoanticorpi e malattie autoimmuni e in che modo è di aiuto un laboratorio per fare le diagnosi. Intanto con il termine malattia autoimmune intendiamo delle condizioni morbose in cui il sistema immunitario aggredisce uno o più organi o interi apparati, ovvero accade che l’immunità acquisita nello specifico attacca un autoantigene, riconoscendo un antigene self come estraneo, attaccandolo. E acquisita è sia linfociti T che B, quindi si producono Ab ma poi si ha azione citotossica e cellulare. L’attività è diversa però perché può essere data da una risposta prevalentemente Ab che produce certi danni, oppure da una risposta cellulare dando altri danni.

Detto questo, abbiamo malattie autoimmuni dette organo specifiche quando in modo discreto si colpisce un solo organo e casomai collateralmente organi diversi separati, oppure sistemiche quando invece, per definizione, sono coinvolti più organi e interi apparati, come artrite reumatoide, lupus eritematoso sistemico, ecc. Facciamo un esempio di organo specifiche come la tiroide, uno degli organi più vulnerabili e soprattutto le malattie autoimmuni sono frequenti maggiormente nel sesso femminile dove la fertilità è una condizione in cui in genere il quadro migliora, indicando che c’è un rapporto ormonale.

Di tiroiditi autoimmuni ce ne sono due, il morbo di Basedow come ipertiroidismo e l’ipotiroidismo in cui la tiroide funziona meno ed è detta tiroidite di Hashimoto. Nel primo caso abbiamo auto-Ab verso antigene TSH, per cui si legano sul recettore di un ormone che attiva i tireociti mimando il ligando, il TSH, e stimola il recettore. Ma se il legame ligando recettore in genere è reversibile e labile, il legame Ab-antigene non è reversibile, infatti ci sono interazioni che sebbene non covalenti, essendo deboli e multiple, instaurano un legame molto forte. Per cui un Ab quando lega un antigene ogni braccio lega l’antigene con 6 punti, almeno 6 livelli di interazione, allora è un legame molto stabile. Allora quando l’Ab anti-TSH-R lo lega, allora non si stacca e stimola in continuazione la tiroide e quindi si ha ipertiroidismo.

Nella forma di Hashimoto e quindi ipotiroidismo invece abbiamo l’opposto perché si ha morte dei tireociti allora si ha ipotiroidismo. Un’altra condizione è il diabete di tipo 1 con linfociti T CD4 e soprattutto CD8 che riconoscono antigeni pancreatici self come non self e uccidono le cellule β che producono insulina e quindi si genera diabete 1. Altro esempio è la miastenia grave che vede Ab che giocano un ruolo importante, legando il recettore per l’acetilcolina, l’Ach-R, e il muscolo si contrae quando si percepisce il rilascio di Ach, allora in questa malattia ci sono Ab che legano il Ach-R e non lo stimolano, ma creano un ingombro sterico che impedisce il legame dell’Ach e quindi il muscolo non si contrae, infatti miastenia significa debolezza muscolare. Altri esempi sono la vitiligine, anche in questo caso una reazione autoimmune in cui i linfociti uccidono i melanociti e quindi la cute in quel punto perde il pigmento e diventa bianca.

Esempi invece di malattia sistemica sono il lupus eritematoso sistemico (LES), che è detta la malattia autoimmune prototipica che può interessare ogni organo e tessuto dell’organismo facendolo con diversi sistemi, tra cui formazione di auto-antigeni che producono immunocomplessi che generano per esempio glomerulonefriti, oppure anche condizioni dati da auto-Ab che possono portare a emolisi, oppure aggressione cellulare generando dermatiti o sinoviti nelle articolazioni. La sclerosi sistemica invece è una condizione con un danno progressivo del microcircolo con infiltrazione infiammatoria e progressiva fibrosi dopo prima reazione infiammatoria e la fibrosi porta a rigidità dei tessuti, e sono colpiti sia la cute che gli organi interni. Inoltre tra le più frequenti abbiamo la sindrome di Sjogren che nel più delle volte è una malattia poco grave che interessa le ghiandole esocrine soprattutto salivari e lacrimali con secchezza agli occhi e al cavo orale, ma si interessano anche altre mucose, poi ci sono artriti anche se non frequentemente e con una certa frequenza danno linfomi con una probabilità di 40% maggiore di persone senza questa malattia autoimmune.

Parliamo degli autoanticorpi

Sono quelli che in laboratorio si utilizzano per arrivare a confermare la diagnosi di malattia autoimmune e sono di fatto Ab verso autoantigeni. Questi auto-Ab si trovano nei pazienti con malattia autoimmune, ma c’è una quota di pazienti perfettamente sani con questi Ab in circolo, e questo perché c’è stata una prima intolleranza contro un autoantigene e sono stati prodotti questi Ab, ma non c’è malattia, quindi se non è un Ab con ruolo patogenetico questo può permanere nel paziente senza dare malattia. Di fatto questi auto-Ab possono vedere delle molecole di superficie in membrana, oppure molecole della matrice extracellulare o anche delle molecole intracellulari dove in questo caso la cellula prima deve morire e lisarsi e quindi poi solo a questo punto avviene l’innesco della malattia autoimmune, malattia allora che richiede come pretesto il danno e morte cellulare. Allora gli auto-Ab sono marcatori della malattia sia organo specifica che sistemica e qualche volta possono essere fondamentali nel ruolo patogenetico, ovvero quando un auto-Ab è patogenetico è perché è causa della malattia, altrimenti se non patogenetico si parla di auto-Ab come marker non patogenetici. Ci sono poi invece Auto-Ab epifenomeni per cui si accompagnano a patologie a patogenesi non immunitaria.

In senso di patogeneticità possiamo avere Ab anti-AchR, oppure anti-recettore del TSH e vari esempi, ma in generale gli auto-Ab patogenetici si associano sempre a malattia, può accadere che siano visti quando ancora la malattia non è presente ma se son patogenetici di lì a poco la malattia compare. E questi auto-Ab se patogenetici se usati in un modello murino compatibile danno malattia. È chiaro che l’antigene del ratto sia molto simile al nostro perché lo riconosca, ma il ratto per molti antigeni ha molta omologia con l’uomo. Inoltre, questi auto-Ab sono anche correlati all’andamento clinico della malattia.

L’auto Ab è però possibile sia anche un marcatore non patogenetico e quindi lo troverò sempre associato alla malattia e quasi mai nei soggetti sani, infatti altrimenti non sarebbe un buon marcatore. Tuttavia, non essendo patogenetico non è lui la causa della malattia e se inserisco il siero in un modello animale non riproduco la malattia come il caso precedente, e in questo caso se la concentrazione di questi Ab marker aumenta non è indice di peggioramento di malattia, quindi il titolo è del tutto indipendente dall’andamento della malattia. Inoltre, possono essere presenti in soggetti sani, anche se raramente e senza sviluppare malattia autoimmune. Sempre nella tiroidite di Hashimoto ci sono auto-Ab che sono però diretti verso una proteina detta tireoglobulina e posso trovarli anche in soggetti senza associazione clinica, quindi sono frequenti nella popolazione e non ci possiamo dare un peso clinico, mentre gli anti-TPO, ovvero perossidasi tiroidea possiamo attribuirgli un senso clinico perché raramente li troviamo in soggetti sani. Sono Ab che agiscono contro una perossidasi tiroidea, un enzima che è interno alle cellule, allora si richiede per forza la lisi del tirocita per cui si pensa ci possa essere una tiroidite infettiva con morte cellulare e innesco della malattia autoimmune.

Gli auto-Ab come epifenomeni intendiamo come fenomeno di superficie, ad esempio un infarto miocardico con liberazione di enzimi muscolari, possono comparire Ab anti-actina, ma non ci indicano se sta per avere un infarto, ma che c’è già stato e non hanno una correlazione con la malattia come patogeneticità, quindi cose causa, o come marcatore, e poi sono anche Ab transitori che vanno via. Ci sono però altri con un peso diverso che compaiono sempre in modo di epifenomeno, ovvero gli Ab anti trans glutamminasi che troviamo nella celiachia e quindi ha senso diagnostico ma ancora in modo transitorio li troviamo anche nelle malattie infettive respiratorie e anche in questo caso in genere dopo 1 mese non li troviamo più.

Nelle malattie organo specifiche è chiaro che l’organo colpito è quello colpito dagli Ab-autoimmuni, ma nel caso sistemico non sempre abbiamo un Ab che agisce nei confronti della cellula colpita, in genere si parla di ANA, ovvero Ab-Anti Nucleare e anche gli ENA che sono sempre Ab-antinucleo Estraibili. E in genere sono Ab contro il nucleo cellulare e li troviamo praticamente sempre eccetto nell’artrite reumatoide, nella sindrome di Sjogren per esempio contro il nucleolo ma è sempre nucleo, poi lo troviamo nel LES ecc. Questi auto-Ab sia organo specifici che gli ANA li troviamo mediante sistemi immunoenzimatici come ELISA o immunoblotting o con immunofluorescenza indiretta:

• Sistemi enzimatici (ELISA), può essere un antigene naturale estrattivo preso da animali o anche piante e insetti, anche se il più delle volte è ricombinante. Una volta allora trovato l’antigene, purificato e prodotto, nell’ELISA si fissa in un pozzetto in cui si mette il siero del paziente dopo opportuni lavaggi e diluizioni, allora si mette un Ab rilevatore che avrà un enzima che fa una reazione colorimetrica rendendolo visibile, allora posso dire se abbiamo l’Ab e ce lo titola e quantifica anche. L’immunoblotting ci permette di usare anche un unico campione di siero che si mette in una strisciolina che assorbe il siero e la striscia è fatta da vari rilevatori e in base alla striscia che si colora posso dire che auto-Ab era presente. Il vantaggio dei sistemi immunoenzimatici è che sono molto rapidi e facili da leggere, non richiedono che l’operatore sia formato in modo specifico e sono molto ridotti i rischi di male interpretazione dei risultati, sono infatti anche molto standardizzati. Il limite è che posso attuarli solo per Ag noti e per altro prodotti nel commercio.
• Immunofluorescenza indiretta, ovvero si usano vetrini con substrato cellulare o anche tessuti direttamente usati come substrato per vedere se il siero del paziente vi lega qualcosa, ciò implica che le cellule devono essere permeabilizzate (saponina) perché spesso nel caso sistemico si parla di ANA che lega il nucleo e quindi elementi intracellulare, ma anche malattie organo specifiche, abbiamo citato la tireoperossidasi. Il siero allora viene testato in diluizioni, e se qualcosa viene legato dalla diluizione 1:160 in su allora possiamo stabilire che ci sono gli auto-Ab. Il secondo passaggio allora è usare un Ab rilevatore, in genere una Ig di coniglio, ovvero un rabbit anti-human coniugato a un fluorocromo, di norma fluoresceina e lo vediamo nel microscopio a fluorescenza dove attraverso il monitor del microscopio posso vedere la fluorescenza. Vedendo le tre immagini in figura sotto, vediamo che la prima immagine è il caso in cui si ha negatività, in cui quindi dopo aver preso il tessuto di interesse e aggiunto il siero non abbiamo reazione di fluorescenza. Tuttavia, in genere nel caso della negatività possiamo vedere che proprio tutto nero non è, ma abbiamo delle ombre di fluorescenza che un po’ si vedono, ovvero significa che in modo del tutto normale un po’ di siero è rimasto legato in modo aspecifico oppure anche un po’ di Ab secondario è rimasto in modo aspecifico, ma possiamo comunque attribuire come negativo, ci dice soltanto come controllo che l’Ab è stato messo, mentre avessi tutto nero potrei immaginare che allora non è stato messo nulla, e quello sarebbe un problema. Vedendo allora le due immagini accanto sono esempi di positività dove è il nucleo che si colora, in freccia gialla si vede anche nuclei in duplicazione, per cui se è il nucleo a essere colorato mi dice che sicuramente qui ci sono degli anticorpi ANA, rimane da capire cosa stanno legando, ma sicuramente stanno legando qualcosa che sta nel nucleo. Tuttavia vediamo delle differenze tra l’immagine di destra e quella centrale, nell’immagine al centro vediamo infatti una colorazione omogenea ed è tipica di quando l’Ab sta legando un antigene presente in tutte le porzioni del nucleo che di norma posso immaginare sia il DNA oppure gli istoni, che sono le due molecole più fittamente rappresentate dentro a un nucleo. In genere questo caso lo trovo nel LES, ovvero nel lupus, dove in genere si formano degli ANA anti-DNA. Infatti quello che succede è che il tessuto va in necrosi (NON apoptosi), si libera il DNA e allora si forma questi immunocomplessi Ab-DNA. A destra abbiamo un quadro più punteggiato e frastagliato e lo troviamo nel LES (ma non lega il DNA in questo caso), o nella S. di Sjogren, o sclerosi sistemica.

Nel caso seguente è invece un caso particolare, in questo caso si parla di ACA, ovvero Ab anti-centromero in cui vediamo che abbiamo puntini sono molto ben distinti per ogni cellula, e se gli contassimo ci accorgeremmo che sono 46 puntini perché legano i centromeri ed è tipico della sclerosi sistemica nella variante limitata, dove non colpisce tutta la cute ma solo le parti distali, a differenza della sclerosi sistemica diffusa che colpisce tutta la cute invece. Allora è chiaro che in questo caso anche senza fare immunoblotting o ELISA capisco lo stesso che si tratta di un quadro molto tipico della sclerosi sistemica. Oppure nel caso di destra vediamo invece delle cellule tumorali (di carcinoma faringeo in questa immagine) in cui vediamo in genere un nucleo molto grosso e non vediamo solo un nucleolo, ma vediamo anche 4/5 nucleoli. In genere comunque la colorazione con anticorpi ACA anti centromero la usiamo per nella sclerosi sistemica insieme al centromero, ma il centromero nella variante limitata mentre nella colorazione multi nucleolo nella forma diffusa.

Allora una volta fatta una immunofluorescenza, posso già pensare che allora vedo degli ANA, allora mi posso sbilanciare un po’ dicendo che potrebbe essere una condizione di malattia autoimmune sistemica, ma a questo punto lo verifico andando a fare ELISA o un immunoblotting. Molto particolare è un caso in cui potrei da una parte vedere degli ANA molto netti in immunofluorescenza, ma in ELISA o immunoblotting non vedo più l’auto-Ab e la spiegazione a questo potrebbe essere che non conosco l’antigene, perché ricordiamo che nei sistemi enzimatici devo conoscere l’antigene, per questo è sempre utile l’immunofluorescenza, perché nei sistemi enzimatici potrei non vedere l’antigene nonostante abbia impermeabilizzato la cellula e quindi mi aspetto in teoria di vedere lo stesso ANA che ho in immunofluorescenza, ma questo accade solo a patto che lo conosca e siano prodotti degli antigeni che possa fissare sul supporto per esempio dell’ELISA. Quindi è molto importante la colorazione a DNA, ed è molto importante saperlo perché vuol dire lupus a rischio per esempio di fare glomerulonefrite. Tuttavia bisogna capire se quella marcatura nucleare è davvero frutto di una marcatura del DNA, perché un ANA che marca il nucleo è vero che se è omogeneo in teoria mi aspetto che sia marcatura del DNA, ma non è detto, potrei aver colorato altre cose sempre nucleari ma non il DNA. Allora un metodo per capire se è un ANA anti-DNA è di usare un microrganismo detto Crithidia Luciliae che è un protozoo flagellato che essendo protozoo ha un nucleo come gli eucarioti, e in più essendo flagellato è anche fatto da un grosso mitocondrio perché il flagello ha necessità di ATP e questo grosso mitocondrio si trova alla sua base fornendoglielo. Il mitocondrio però ha DNA che non è associato a istoni, è libero, allora se il mitocondrio si colora è sicuramente stato colorato il DNA mitocondriale e non proteine.

Allora colorando questo protozoo con il siero del paziente, se il microrganismo si colora sia nel nucleo che nel mitocondrio (immagine A) sono sicuro che la marcatura dentro al nucleo è stata fatta da ANA anti-DNA che infatti hanno anche colorato il DNA mitocondriale, altrimenti se non si colora il mitocondrio (immagine B), ma solo il nucleo, e quindi ho solo uno spot, sono sì degli ANA nucleari, ma non anti-DNA, per esempio mi aspetta possano aver colorato proteine o altre molecole nucleari. Possiamo fare gli anticorpi anti-DNA anche in ELISA e in genere in questo caso però se l’ELISA viene negativa allora è davvero negativo il campione, ma se viene positivo spesso in ELISA abbiamo falsa positività, per cui se viene un ANA anti DNA positivo in ELISA non per forza è detto che ci sia realmente.

Diagnosi mediante immunofluorescenza

Ora vediamo i principali tipi di fluorescenza, ovvero abbiamo finora visto alcuni tipi di substrati che possono essere viste in fluorescenza, ma capiamo adesso come possiamo diagnosticare mediante immunofluorescenza. Per farlo ci affidiamo ai tessuti di organo di ratto, e infatti abbiamo detto che soprattutto per le malattie organo specifiche è importante usare organi specifici, in genere i tessuti più usati sono di tiroide, fegato, stomaco e rene.

Vediamo allora alcuni esempi di varie malattie autoimmuni per vedere come appaiono nel tessuto di ratto una volta che a questo tessuto unisco il siero del paziente che stiamo analizzando e di cui vogliamo testare gli auto-Ab:

• Tiroidite autoimmune, allora dal topo prelevo il tessuto tiroideo e quello che posso ben distinguere è che vedo i tireociti che formano dei grandi buchi neri vuoti che è lo spazio in cui i tireociti accumulano gli ormoni, ovvero sono i follicoli tiroidei. Quello che vedo è che ci sono casi i cui i tireocita si colorano, e sono Ab-anti tireoperossidasi. Volendo potremmo fare una ELISA ma il quadro è talmente tipico che in genere è sufficiente così. In genere in caso di tiroiditi di Hashimoto o ipotiroidismo potrei vedere Ab anti-tireoglobulina allora in quel caso si colorano anche tutti i foll