Cromatografia chirale

Cromatografia chirale

Isomeri e loro classificazione

Gli isomeri che possiamo incontrare sono:

• Isomeri strutturali: Proprietà chimiche e fisiche diverse, separati con fasi stazionarie già viste.
• Steroisomeri: Si dividono in:
  • Diasteroisomeri: Proprietà chimiche differenti e possono esser separati con più difficoltà rispetto agli isomeri strutturali con le fasi stazionarie achirali.
  • Enantiomeri: Immagine speculare l’uno dell’altro, hanno proprietà chimiche e fisiche identiche in un mezzo achirale, ma differenti in uno chirale, come ad esempio i fluidi biologici. Dal punto di vista farmacologico sono considerati come due molecole differenti poiché possono avere attività differenti e dunque uno dei due dovrà esser presente in quantità < 0.5% o anche meno se ha proprietà tossiche.

Importanza della separazione degli enantiomeri

È molto importante avere un metodo analitico che permetta di separare gli enantiomeri (non si possono usare dunque le fasi stazionarie achirali già viste). La talidomite è stata commercializzata come miscela racemica, ma solo l’enantiomero R ha attività ipnotica, mentre quello S è teratogeno. Dunque, per ovviare a questo problema era necessario commercializzare solo l’enantiomero R, ma questo problema venne fuori troppo tardi. Altro esempio è il propanololo che è commercializzato come racemato anche se la forma S è attiva come β-bloccante mentre quella R è inattiva, dunque per risparmiare denaro si preferisce utilizzare anche la forma R poiché non tossica.

Incidenza della chiralità nei farmaci

L’incidenza della chiralità nel "pool" farmaceutico è la seguente: nel 1999 su 1398 farmaci, 398 sono naturali o semisintetici (di cui 3 achirali e 395 chirali, dunque la natura sintetizza in maniera chirale e di queste 391 sono enantiomeri singoli e 4 sono racemati), mentre 1000 sono sintetici (390 chirali e 610 achirali); la chiralità molecolare riguarda tutte le classi di farmaci.

Metodi di separazione degli enantiomeri

Possiamo separare due enantiomeri con un approccio intramolecolare che prevede la formazione di diasteroisomeri che hanno un legame stabile verso un legame covalente, elettrostatico ecc. Si prende una miscela scalenica (ossia quando il rapporto tra gli enantiomeri non è 1:1) e si fa reagire con una molecola chirale ad elevatissimo eccesso enantiomerico, si formano i due sali dei due diasteroisomeri e si separano mediante distillazione, cromatografia, cristallizzazione ecc.

Limitazioni dell'approccio intramolecolare

Questo approccio però non è indicato per i nostri scopi perché:

• Per avere eccessi enantiomerici alla fine dobbiamo utilizzare un derivatizzante chirale in teoria al 100% (che non lo è mai), l’impurezza dell’altro enantiomero presente verrà ritrovata nel prodotto finale che andremo a separare.
• Prevede 3 step: il 1° consiste nella preparazione del diasteroisomero, 2° separazione dei due diasteroisomeri, 3° rigenerazione dell’enantiomero, però in questo caso può avvenire racemizzazione (si perde quello che avevamo ottenuto col processo di purificazione, è l’inconveniente di questo “approccio intramolecolare”).

Approccio intermolecolare

L’ideale è utilizzare un “approccio intermolecolare” che consiste nella formazione di diasteroisomeri transienti, ossia instabili, che si formano durante il processo di separazione o aggiungendo nel mezzo un agente chirale o meglio ancora, legando con un legame covalente, sulla superficie di una fase stazionaria, una molecola chirale (questa molecola chirale fa il suo lavoro mentre gli analiti passano in colonna ed escono separati come enantiomeri e non come diasteroisomeri, quindi non abbiamo più nessun inconveniente).

Tecniche cromatografiche utilizzate

Per applicare questo concetto si possono impiegare le tecniche cromatografiche:

• Gascromatografia: La fase chirale è la fase stazionaria.
• SFC ed HPLC: O fase mobile chirale e fase stazionaria achirale oppure fase stazionaria chirale e fase mobile achirale oppure entrambi chirali ma ciò sarebbe superfluo.

In questo caso siamo in grado con una tecnica cromatografica, con fase stazionaria chirale (è l’ideale perché fase mobile chirale vuol dire aggiungere continuamente agente chirale alla colonna e buttarlo). Nell’approccio indiretto, chiameremo “selectands” la coppia di enantiomeri da separare ed agente derivatizzante chirale la molecola chirale che utilizziamo per preparare diasteroisomeri stabili che poi separiamo per cristallizzazione, questo approccio non ci interessa.

Approccio diretto

Quello che si applica è il seguente: abbiamo il selectands (racemato o la miscela scalenica), aggiungiamo un selettore chirale che non dà legami covalenti o interazioni stabili, ma darà interazioni labili (rappresentati da 3 linee ondulate poiché servono 3 interazioni direzionali per fare una ricognizione nello spazio in 3 dimensioni, queste interazioni possono essere legami ad H, VDW, dipolo-dipolo) formando diasteroisomero labile che è separabile con tecniche di separazione. Sono 3 le interazioni per principio, cosiddetta “regola di Dalgliesh” o “regola dei 3 punti”: sulla superficie della silice ancoriamo con un legame covalente il nostro selettore chirale che è in grado di interagire con i selectands (due enantiomeri presenti nel campione da separare) mediante interazione con 3 siti del selettore.

Per rigenerare l’enantiomero è sufficiente invertire la posizione dei due sostituenti, cambierà una delle 3 interazioni (se coinvolge un legame ad H si perdono 3 Kcal) e dunque si avrà energia differente di interazione; questo è il principio dell’approccio diretto che prevede la formazione di diasteroisomeri transienti (perché differiscono soltanto per quel centro stereogenico) con diverse stabilità, quello più stabile sarà responsabile dell’enantiomero con maggior fattore di ritenzione (esce più tardi perché interagisce di più stereoselettivamente con la fase stazionaria). Il potere discriminante della fase stazionaria chirale è sempre descritto dal fattore di enantioselettività (a).

Fasi stazionarie chirali

Possiamo avere fasi stazionarie chirali per gascromatografia (poco impiegata perché limitata a molecole volatili e termostabili), cromatografia liquida e SFC; queste fasi stazionarie possono essere derivati degli amminoacidi, di ciclodestrine, per GC enantioselettiva di complessazione; per HPLC possiamo avere: fasi stazionarie CSP (Chiral Station Phases) che prevedono molecole con P.M. medio-basso, molecole di sintesi, molecole naturali (amminoacidi, ciclodestrine ecc.) o di natura polimerica (naturali: polisaccaridi, derivati della cellulosa, proteine; di sintesi: molecole con cavità chirale).

Caratteristiche delle fasi chirali

Le caratteristiche fondamentali che deve avere una fase chirale sono:

• Ampio campo di applicazione: Costano il triplo rispetto alle FS achirali (2500 € contro 600-700 €).
• Compatibile con il maggior numero di FM.
• Alto livello di enantioselettività, ossia un ampio potere discriminante.
• “Loading” elevato, ossia possiamo separare la maggior quantità possibile in ogni iniezione (importante quando dobbiamo raccogliere il prodotto di due enantiomeri separati che ci servono).