Cromatografia chirale

Cromatografia chirale

Gli isomeri che possiamo incontrare sono:

1. Isomeri strutturali: proprietà chimiche e fisiche diverse, separati con fasi stazionarie già viste

2. Steroisomeri: si dividono in

2.1 Diasteroisomeri: proprietà chimiche differenti e possono esser separati con più difficoltà rispetto

agli isomeri strutturali con le fasi stazionarie achirali.

2.2 Enantiomeri: immagine speculare l’uno dell’altro, hanno proprietà chimiche e fisiche identiche in

un mezzo achirale, ma differenti in uno chirale, come ad es. i fluidi biologici. Dal punto di vista

farmacologico sono considerati come due molecole differenti poiché possono avere attività

differenti e dunque uno dei due dovrà esser presente in quantità < 0.5% o anche meno se ha

proprietà tossiche.

Molto importante è dunque avere un metodo analitico che permetta di separare gli enantiomeri (non si

possono usare dunque le fasi stazionarie achirali già viste).

La Talidomite è stata commercializzata come miscela racemica, ma solo l’enantiomero R ha attività

ipnotica, mentre quello S è teratogeno, dunque per ovviare questo problema era necessario

commercializzare solo l’enantiomero R, ma questo problema venne fuori troppo tardi; altro esempio è il

Propanololo che è commercializzato come racemato anche se la forma S è attiva come β-bloccante mentre

quella R è inattiva, dunque per risparmiare denaro si preferisce utilizzare anche la forma R poiché non

tossica. L’incidenza della chiralità nel “pool” farmaceutico è la seguente: nel 1999 su 1398 farmaci, 398

sono naturali o semisintetici (di cui 3 achirali e 395 chirali, dunque la natura sintetizza in maniera chirale e

di queste 391 sono enantiomeri singoli e 4 sono racemati), mentre 1000 sono sintetici (390 chirali e 610

achirali); la chiralità molecolare riguarda tutte le classi di farmaci.

Possiamo separare due enantiomeri con un approccio intramolecolare che prevede la formazione di

diasteroisomeri che hanno un legame stabile verso un legame covalente, elettrostatico ecc. si prende una

miscela scalenica (ossia quando il rapporto tra gli enantiomeri non è 1:1) e si fa reagire con una molecola

chirale ad elevatissimo eccesso enantiomerico, si formano i due sali dei due diasteroisomeri e si separano

mediante distillazione, cromatografia, cristallizzazione ecc. Questo approccio però non è indicato per i

nostri scopi perché:

1. Per avere eccessi enantiomerici alla fine dobbiamo utilizzare un derivatizzante chirale in teoria al 100%

(che non lo è mai), l’impurezza dell’altro enantiomero presente verrà ritrovata nel prodotto finale che

andremo a separare.

2. Prevede 3 step: il 1° consiste nella preparazione del diasteroisomero, 2° separazione dei due

diasteroisomeri, 3° rigenerazione dell’enantiomero, però in questo caso può avvenire racemizzazione

(si perde quello che avevamo ottenuto col processo di purificazione, è l’inconveniente di questo

“approccio intramolecolare”)

L’ideale è utilizzare un “approccio intermolecolare” che consiste nella formazione di diasteroisomeri

transienti, ossia instabili, che si formano durante il processo di separazione o aggiungendo nel mezzo un

agente chirale o meglio ancora, legando con un legame covalente, sulla superficie di una fase stazionaria,

una molecola chirale (questa molecola chirale fa il suo lavoro mentre gli analiti passano in colonna ed

escono separati come enantiomeri e non come diasteroisomeri, quindi non abbiamo più nessun

inconveniente). Per applicare questo concetto si possono impiegare le tecniche cromatografiche:

- Gascromatografia: la fase chirale è la fase stazionaria

- SFC ed HPLC: o fase mobile chirale e fase stazionaria achirale oppure fase stazionaria chirale e fase

mobile achirale oppure entrambi chirali ma ciò sarebbe superfluo.

In questo caso siamo in grado con una tecnica cromatografica, con fase stazionaria chirale (è l’ideale perché

fase mobile chirale vuol dire aggiungere continuamente agente chirale alla colonna e buttarlo).

Nell’approccio indiretto, chiameremo “selectands” la coppia di enantiomeri da separare ed agente

derivatizzante chirale la molecola chirale che utilizziamo per preparare diasteroisomeri stabili che poi

separiamo per cristallizzazione, questo approccio non ci interessa.

Quello che si applica è il seguente: abbiamo il selectands (racemato o la miscela scalenica), aggiungiamo un

selettore chirale che non dà legami covalenti o interazioni stabili, ma darà interazioni labili (rappresentati

da 3 linee ondulate poiché servono 3 interazioni direzionali per fare una ricognizione nello spazio in 3

dimensioni, queste interazioni possono essere legami ad H, VDW, dipolo-dipolo) formando diasteroisomero

labile che è separabile con tecniche di separazione. Sono 3 le interazioni per principio, cosiddetta “regola di

Dalgliesh” o “regola dei 3 punti”: sulla superficie della silice ancoriamo con un legame covalente il nostro

selettore chirale che è in grado di interagire con i selectands (due enantiomeri presenti nel campione da

separare) mediante interazione con 3 siti del selettore. Per rigenerare l’enantiomero è sufficiente invertire

la posizione dei due sostituenti, cambierà una delle 3 interazioni (se coinvolge un legame ad H si perdono 3

Kcal) e dunque si avrà energia differente di interazione; questo è il principio dell’approccio diretto che

prevede la formazione di diasteroisomeri transienti (perché differiscono soltanto per quel centro

stereogenico) con diverse stabilità, quello più stabile sarà responsabile dell’enantiomero con maggior

fattore di ritenzione (esce più tardi perché interagisce di più stereoselettivamente con la fase stazionaria). Il

potere discriminante della fase stazionaria chirale è sempre descritto dal fattore di enantioselettività (a).

Possiamo avere fasi stazionarie chirali per gascromatografia (poco impiegata perché limitata a molecole

volatili e termostabili), cromatografia liquida e SFC; queste fasi stazionarie possono essere derivati degli

amminoacidi, di ciclodestrine, per GC enantioselettiva di complessazione; per HPLC possiamo avere: fasi

stazionarie CSP (Chiral Station Phases) che prevedono molecole con P.M. medio-basso, molecole di sintesi,

molecole naturali (amminoacidi, ciclodestrine ecc.) o di natura polimerica (naturali: polisaccaridi, derivati

della cellulosa, proteine; di sintesi: molecole con cavità chirale). Le caratteristiche fondamentali che deve

avere una fase chirale sono:

 Ampio campo di applicazione: costano il triplo rispetto alle FS achirali (2500 € contro 600-700 €)

 Compatibile con il maggior numero di FM.

 Alto livello di enantioselettività, ossia un ampio potere discriminante.

 “Loading” elevato, ossia possiamo separare la maggior quantità possibile in ogni iniezione (importante

quando dobbiamo raccogliere il prodotto di due enantiomeri separati che ci servono per fare test

farmacologici, test in vivo ecc.).

 Robuste e stabili: hanno dunque una maggior durata lavorativa.

 Eluizioni veloci: nel caso delle colonne chirali, tutto quello che abbiamo detto riguardo la transizione tra

HPLC e UHPLC è lo stessa, ossia non è termodinamica, ma cinetica; saranno commercializzate dall’anno

prossimo dal prof, le colonne con FS chirale per UHPLC.

 Alta efficienza: alta efficienza è legata allo spostamento della Van Deemter verso velocità lineari più

alte.

 Vantaggio di FS di sintesi rispetto a quelle naturali: nel caso della FS chirale è molto importante avere

a disposizione i due enantiomeri per avere due colonne a chiralità opposta (una con FS con

enantiomero R e l’altra con l’S) ciò è possibile solo con FS di sintesi poiché in natura è solo uno

l’enantiomero predominante. Cambiando la chiralità della nostra colonna cromatografica senza toccare

la chimica del sistema (ossia senza cambiare FS) si ottiene l’inversione dell’ordine di eluizione

dell’analita, ciò è importante per il calcolo dell’eccesso enantiomerico che viene oggigiorno sempre

richiesto dagli organi regolatori.

Il primo enantiomero che interagisce con la fase stazionaria avrà un’energia libera di interazione, il secondo

∆