Corso completo di genetica medica

ESEMPI:

1. Discinesia Ciliare Primaria (PCD)→mutazione di DNAH5

un caso di 2 fratelli avevano questa malattia in aggiunta alla sindrome di Miller;

clinicamente non capivano che sindrome fosse a causa dell'espressività variabile dovuta,

in questo caso, a 2 geni diversi. Sindrome di Miller

Mutazione di DHODH, un enzima mitocondriale che catalizza le reazioni di sintesi delle

pirimidine.

La proteina prodotta è ubiquitaria, cioè espressa in molti o tutti i tessuti; è importante nello sviluppo

embrionale.

2. (et. di locus)→sequenziamento esoma di pazienti (non imparentati) che presentano lo stesso

fenotipo: si è giunti ad una sindrome chiamata di Kabuki:

disabilità intellettiva

• fisionomia del volto caratteristica (simile alle maschere del teatro

• giapponese “Kabuki”

suscettibilità alle infezioni.

•

L'exome sequencing ha individuato MLL2 come gene causativo della sindrome di Kabuki;

furono analizzati 10 pazienti ma non si trovò nessuna mutazione che fosse comune a tutti,

allora si restrinse il campo e si trovò una mutazione de novo loss of function in 4 pazienti!

Nei restanti 6 casi è un fenotipo Kabuki-like dovuto a mutazioni in altri geni (et. di locus).

Con l'utilizzo di NGS si stanno scoprendo sempre più cause genetiche di malattie prima

sconosciute.

Riassunto:

Per trovare un gene causativo di una condizione patologica a base mendeliana si ricorre

all'analisi linkage→Occorre identificare un numero di famiglie in cui segrega quella condizione

per definire in quale regione del genoma il gene causativo sia localizzato;

Una sola famiglia, con numerosi membri sia affetti che sani, può arrivare ad identificare

la regione dove il gene mutato cosegrega con I marcatori utilizzati ma questa regione è

in genere troppo grande per poter arrivare a identificare il gene causativo;

L’analisi di altre famiglie aiuta a diminuire la taglia della regione critica a una dimensione

In cui sono presenti solo poco geni.

Exome sequencing (next generation sequencing):

Occorre identificare quali sono le varianti uguali ed in eterozigosi negli affetti della Famiglia A

o quelle uguali ed in eterozigosi composta negli affetti della famiglia B ed in eterozigosi nei loro

genitori;

In famiglie con genitori consanguinei il numero di geni in omozigosi è comunque alto sia

nei figli sia affetti che sani e occorre filtrare analizzando una serie di altri familiari;

La presenza della mutazione nello stesso gene in soggetti con la stessa condizione

conferma il dato.

A B

aa

Aa Aa Aa

aa Aa aa aa

Ω Ω Ω

Caso familiare→ 1 coppia ha 3 figli: il I morto alla nascita, il II aborto volontario (ipoplasia

cerebellare, aplasia del radio, problemi cardiaci) e il III nato con gravi difetti

congeniti (tetralogia di Fallot, aplasia del radio rene singolo...)

la diagnosi è: “Associazione di Vacterl” (sindrome data da difetti congeniti associati);

si esegue il whole exome del trio (padre, madre e figlio) e si è individuato come causativo un

gene associato alla famiglia dei geni Fanconi.

Le cellula FA sono caratterizzate da incapacità di riparare i danni causati da agenti che provocano

difetti e intergiunzioni cromosomiali; ciò avviene perché le proteine FA sono parte di un

complesso di riparo, e se una di esse è mutata risulta compromesso l'intero pathway.

Per confermare la diagnosi si mettono le cellule in coltura DEB e si osserva se le strutture dei

cromosomi in metafase presentano rotture e scambi intercromosomiali.

Sindrome di Cushing

Adenomi adrenalici→ tumori benigni delle ghiandole adrenaliche con un'incidenza del 3% nelle

persone oltre i 50 anni. Alcuni di questi adenomi non producono ormoni

quindi non ci si accorge facilmente della loro presenza. Una parte di essi

invece produce cortisolo e sono associati alla Sindrome di Cushing; portano

a ipertensione e osteoporosi.

Quali sono le cause molecolari che portano alla produzione di cortisolo?

Mutazioni della subunità (GNAS1) attivante della proteina G somatica causano adenomi o

• iperplasie che portano alla S. di Cushing nel contesto della più vasta Sindrome di McCune-

Albright;

mutazioni germline e somatiche del gene PRKAR1A sono state identificate in alcuni

• pazienti Cushing e in un piccolo numero di adenomi adrenalici che producono cortisolo.

Tuttavia queste cause spiegano solo una piccola parte di casi:

216 pz. Cushing con ipercortisolismo (181 unilaterali; 35 bilaterali)→ eseguito NGS in 10 casi di

tumori adrenocorticali in pz. Con evidente S. di Cushing: 8 avevano la mutazione di PRKACA;

allora si è sequenziato PRKACA in altri 129 casi di adenomi e si è riscontrato che 14 avevano la

stessa mutazione (non riscontrabile nel sangue periferico). Si sono poi eseguiti gli array su 35 pz.

Con tumori/iperplasie adrenocorticali bilaterali: 5 avevano una duplicazione germline di diverse

dimensioni ma tutte comprendenti PRKACA.

Questa mutazione (Leu206Arg) infatti comporta che le subunità catalitiche non siano più in

grado di legarsi alle sub. regolatorie, così queste ultime rimangono sempre attive!

Conclusione:

L'exome seq. ha rivelato una mutazione di PRKACA, che codifica per la sub. catalitica

• principale del complesso protein-kinasi cAMP dipendente, in 8/10 adenomi;

complessivamente le mutazioni somatiche di PRKACA sono state identificate anche nel

• 37% degli adenomi dei pz. Cushing, mentre non sono state riscontrate in condizioni cliniche

non-Cushing (ipercortisolismo, tumori adrenalici);

tra 35 pz. con iperplasia e produzione di cortisolo solo in 5 avevano una gain of function,

• nella linea germinale, nella regione contenente anche PRKACA.

PRKACA gain of function porta alla S. di Cushing, con tumori adrenalici (manifestazione del

complesso di Carney).

PRKACB amplification è associata con gli altri sintomi del complesso di Carney: pigmentazione

della cute, acromegalia, mixomi ed adenoma pituitario.

↓

IPOTESI: l'adenoma pituitario è causato dalla gain of function di PRKACB?

Ω Ω Ω

Un approccio genomico alla medicina permette di “sezionare” ogni condizione patologica (ID,

malattie mendeliano, tumori...) nelle sue componenti di base più semplici, aprendo così la strada

a trattamenti mirati a “bypassare” ogni determinata alterazione cellulare e arrivare così alla

cura complessiva. Citogenetica Umana

Nel 1956 un ricercatore giapponese (Hin Tjio) mise per sbaglio dei cromosomi in metafase in una

soluzione ipotonica anziché fisiologica, ottenendo l'esplosione delle cellule e lo “spargimento” dei

cromosomi su una vasta superficie del vetrino; i chr. così dispersi si poterono per la prima volta

contare ben distintamente, e si stabilì con sicurezza a 46 il cariotipo umano.

Nel 1960 a Denver la citogenetica fu proclamata branca della medicina:

Jerome Lejeune→identificò la S. di Down nella trisomia 21

• Jacobs →XXY e S. di Klinefelter

• Ford →X0 e S. di Turner

•

Lejeune dedicò la vita a cercare una terapia per migliorare l'ID nella trisomia 21; non ricevette il

Nobel perchè le sue ricerche erano ostacolate dal fatto che fosse un deciso oppositore delle diagnosi

prenatali.

Negli anni '60 divenne chiaro che le aneuploidie cromosomiche sono responsabili di malformazioni

congenite multiple e morti neonatali quando riguardano i chr. autosomici, e di specifiche sindromi

compromettenti la fertilità quando riguardano i chr. sessuali.

Queste scoperte fecero sospettare alla comunità scientifica che almeno una parte degli aborti

spontanei fosse dovuta ad aneuploidie cromosomiche letali già nell'embriogenesi.

Negli anni '70 e '80 fu dichiarata l'epidemiologia delle anomalie cromosomiche (Patricia Jacobs,

Terry Hassold, Dorothy Warburton).

Frequenza e distribuzione delle anomali cromosomiche:

ABORTI SPONTANEI “STILLBIRTHS” NATI VIVI POSSIBILITÀ DI

SOPRAVVIVENZA

(fino a 20 settimane)

50% 5% 0,6% 5%

Lo 0,6% dei neonati presenta anomalie cromosomiche.

La trisomia è l'anomalia chr. più comune ed è la causa più frequente di aborti spontanei (vedi

slide 47/48, lez.8).

Furono analizzate 85.000 gravidanze per ricerche sulla citogenetica:

lo 0,6% dei neonati aveva anomalie chr.

• il 35% degli aborti spontanei aveva anomalie chr. (a cui si devono aggiungere gli aborti

• avvenuti talmente presto che non sono stati analizzati)

circa lo 0,2-0,3% dei neonati ha trisomie , la maggior parte delle aneuploidie infatti sono

• fatali nella vita embrionale

non si sono riscontrati aborti spontanei con monosomie di autosomi, non perchè non

• avvengano ma perché sono letali nelle prime divisioni cellulari

le trisomie sono meno letali delle monosomie e sono compatibili almeno in parte con la vita

• embrionale Come insorgono le aneuploidie?

Un gamete con un chr. sovrannumerato può essere dovuto a una non-disgiunzione tra omologhi

nella meiosi I o II.

Per capire le origini (paterne o materne) di un chr. sovrannumerario bisogna analizzare le varianti

(microsatelliti) dei Dna del trio (padre,madre e figlio): la grande maggioranza (~70%) delle

trisomie avviene nella meiosi I materna.

Solo nei casi XXY c'è un'elevata (50%) frequenza di non-disgiunzione paterna.

Le aneuploidie embrionali di solito derivano dalla cellula uovo e non dallo spermatozoo; la

frequenza degli errori aumenta all'aumentare dell'età materna: il rischio di avere un figlio con

S. di Down aumenta esponenzialmente all'aumentare dell'età materna (di solito i figli Down sono gli

ultimi di una coppia); nelle donne intorno ai 20 anni è del 2-3%, a 35 anni è oltre il 35%!

Non si sa bene perché l'avanzare dell'età influenzi l'insorgenza delle trisomie. Siccome nella donna

gli ovociti si formano nell'embrione poi si bloccano in fase di crossing-over con gli omologhi

incrociati uniti dalla proteina coesina e riprendono il ciclo nella pubertà, si ritiene che con

l'avanzare dell'età la coesina si dissolva e quando l'ovocita matura non avviene correttamente

la disgiunzione in meiosi I. Un'altra possibilità è la mancanza di giunzioni nel crossing-over.

Il cariotipo 45 X0 (Turner) è la seconda anomalia causa di aborti spontanei! sopravvive solo l'1%.

Tuttavia i soggetti Turner non hanno malformazioni evidenti.

Come si forma X0?

Per ogni gamete trisomico che si forma, se ne forma anche uno monosomico. Quindi si presume

che anche in questo caso il rischio aumenti con l'età; in realtà la letteratura indica un'età

d'incidenza piuttosto giovane (2