Corso completo di genetica medica

Corso di genetica, UNIPV Medicina e Chirurgia (Golgi)

2 individui si distinguono per:

• 3,5 milioni di SNPs (0,1% del DNA; da 500 Kb a 1 Mb);
• 1000 CNVs (da 500 bp a 1 Mb).

“SNPs” (“single nucleotide polymorphism”)

Si formano per errori della DNA polimerasi; si dividono in 2 tipi:

1. “SNP o SNV”: es. invece di una base C-G, sostituzione con T-A; possono dare 2, 3 o 4 alleli differenti.
2. “Insertion-Deletion” (Indel): riguardano da 1 a 50 paia di basi (bp).

Alcuni SNPs si sono formati migliaia di anni fa per errori nella gametogenesi, rimanendo nel genoma umano poiché non hanno causato mutazioni nocive; in alcuni casi addirittura sono stati favorevoli. In ogni caso essi danno un maggior “fitness”.

Piccoli SNPs e Indel con frequenza =>1% sono considerati comuni. La funzione della maggior parte di essi è ancora sconosciuta.

Gli SNPs possono provocare:

• Aumento/eliminazione delle sequenze di stop;
• Variazioni di introni;
• Variazioni frameshift (quando gli Indel non sono 3 o multipli di 3);
• Variazioni geniche downstream: in posizione 3';
• Variazioni geniche upstream: in posizione 5';
• Variazioni missenso.

La frequenza degli SNPs varia tra diverse popolazioni, infatti essi sono utili per gli studi di popolazione.

Gli alleli di rischio individuano in una persona (o popolazione) che lo possiede nel genoma, una maggior possibilità di sviluppare una certa patologia; sebbene la sua presenza non implichi la certezza di sviluppo di tale patologia nell'individuo, dalla sua assenza ne consegue l'impossibilità di svilupparla.

Esempio di SNP

Un polimorfismo omozigotico nel gene FTO predispone all'obesità (SNP benigno); esso comporta difficoltà nell'abbassamento dei livelli di “grelina” nel sangue alla fine dei pasti, di conseguenza l'individuo “affetto” non prova la sensazione di sazietà che normalmente lo indurrebbe a terminare il pasto.

Tuttavia l'obesità è una condizione causata da più alterazioni genomiche (geneticamente eterogenea).

FTO è quindi un “gene di rischio obesità”, autosomico recessivo (è infatti necessaria l'omozigosi).

Si ritiene che tale SNP si sia sviluppato ancestralmente e si sia mantenuto poiché garantiva maggior sopravvivenza agli uomini cacciatori-raccoglitori.

“CNVs” (copy number variation)

Sono pezzi di DNA (da 50 bp a più Mb) che variano nel numero di copie, cioè non sono in corredo diploide. Ciò influisce anche sul totale del genoma umano, che infatti non è diploide al 100%!

Possono avvenire su qualsiasi tratto di DNA, contribuendo alla variabilità genica.

Esistono appositi database coi quali è possibile verificare se un certo CNV è riscontrato in tante persone sane (benigno), o se è collegato a delle patologie.

I CNV sono provocati da diversi fattori, tra cui errori nella ricombinazione meiotica: piccoli tratti di DNA molto simili tra loro (>95%), detti LCR (Low Copy Repeats), si appaiano in modo “sfalsato” tra loro; questo processo è chiamato “NAHR” (Non Allelic Homologue Ricombination), e può portare a 2 risultati opposti:

1. Duplicazione del gene (eccesso).
2. Delezione del gene (difetto/mancanza, aploinsufficienza).

La NAHR porta spesso all'insorgenza di patologie, infatti è una condizione autosomica dominante! (che avvenga “de novo” o sia “ereditaria”).

Es. di NAHR: se avviene sul gene PMP22 (sensibile al dosaggio) può portare a 2 patologie:

1. Duplicazione gene → triplo dosaggio = Charcot-Marie-Tooth (CMT);
2. Delezione gene → singolo dosaggio = HNPP (paralisi da pressione, meno grave di CMT).

Inoltre:

• CMT può essere causata anche da mutazioni dell'enhancer;
• HNPP può essere causata anche da mutazioni frameshift.

Il gene PMP22 codifica per proteine mieliniche (rivestimento neuroni), e in queste sindromi non è mutato, il problema riguarda bensì il dosaggio della proteina per cui codifica! Molti geni umani non sono sensibili al dosaggio!

Altri esempi di NAHR: ipertensione; daltonismo; talassemia; emofilia.

Le LCRs sono duplicazioni segmentarie altamente ripetute:

• Hanno “identità” >95%;
• Costituiscono il 5% del genoma umano;
• Dimensioni da 1 Kb a più di 1 Mb;
• Si sono originate nell'evoluzione dei primati;
• Sono spesso associate a riarrangiamenti cromosomici benigni e/o patologici.

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Mutazioni “germ-line” = presenti in tutte le cellule del corpo (non solo in quelle autosomiche).

Mutazione cromosomica = >10 Mb.

ID = intellectual disability (variazioni puntiformi).

Array CGH (aCGH)

La scoperta delle CNVs è avvenuta grazie all'avvento di una nuova tecnica di analisi: “Array CGH” (aCGH), ossia Array Comparative Genomic Hybridization.

È una tecnica che permette l'analisi di migliaia di porzioni di DNA in un singolo esperimento, con una grandissima risoluzione (fino a poche paia di basi):

1. Si preparano separatamente i DNA con gli enzimi di restrizione;
2. Si colorano: DNA di riferimento (verde), DNA probando (rosso);
3. Si “ibridizzano” insieme in uguali quantità;
4. Si analizzano ponendoli in piccole striscette contenenti migliaia di “cellette” in cui si insinuano le porzioni specifiche del DNA ibridizzato.

Risultato: analizzando il colore visibile da ogni celletta, si può individuare in che rapporto è presente il DNA probando rispetto a quello di riferimento:

• 2:1 → VERDE (rif) (prob);
• 1:1 → GIALLO;
• 2:3 → ROSSO.

Se la differenza è maggiore di zero allora si ha una duplicazione; se è minore di zero si ha una delezione.

Sindrome dei geni continui

Nei difetti di dosaggio si può avere la CNV di un solo gene, o di più geni continui.

La citogenetica è in grado di individuare sbilanci cromosomici maggiori di 10 Mb!

Queste tecniche di analisi aiutano a capire le correlazioni tra fenotipo e genotipo, uno degli obiettivi fondamentali della medicina.

Variazione genomica: 0 910 bp 10 bp mutazioni puntiformi, mutazioni cromosomiche (>5 Mb), “aneuploidia strutturale”, 93x10 bp.

Genoma umano aploide: le differenze genomiche (SNPs e CNVs) tra individui di etnie diverse sono le stesse che tra 2 individui della stessa etnia.

NON esistono razze!

“Severe ID”

La disabilità intellettiva grave è causata da mutazioni X-linked. Spesso nei maschi è associata a una duplicazione di Xq28, gene MECP2 (Xq28 syndrome → ricorrenti infezioni, pseudoostruzioni intestinali).

400 Kb sono sufficienti per i sintomi, ma si può arrivare alla duplicazione di 2 Mb.

“Alzheimer precoce”

La precoce insorgenza dell'Alzh. è causata da una mutazione puntiforme, in particolare una mutazione del gene APP che si trova sul Chr. 21; infatti i soggetti Down sviluppano Alzh. precoce.

La proteina precursore della β-amiloide (APP) si può scindere nei 2 più piccoli polipeptidi: Aβ40 e Aβ42; quest'ultimo porta all'Alzheimer.

Le mutazioni in APP o nei geni presenilina (che codificano per le proteasi responsabili della scissione dell'APP) possono portare a un aumento della produzione di Aβ42!

La microftalmia con difetti lineari della pelle è dovuta a mutazioni loss of function.

“Sindrome dei geni continui”

Autosomica recessiva.

Un soggetto maschio è sordo (gene STRL) e infertile (gene CATSPER2): sono 2 sintomi molto diversi tra loro, tuttavia entrambi i geni si trovano in 15q!

Se un individuo è autosomico recessivo, ma sull'allele “sano” si presenta una CNV, allora insorge la patologia.

CNV può imitare una mutazione puntiforme se nella zona CNV c'è un solo gene sensibile al dosaggio; se invece c'è più di un gene, si ha una sindrome dei geni continui!

“Delezioni in Chr. Yq”

Sono frequenti nella popolazione e associate a problemi nella spermatogenesi.

L'Y umano è altamente variabile nella dimensione del braccio lungo; le varianti sono ereditate e sono costituite da eterocromatina non codificante (eterocromatina sostitutiva).

L'Y è altamente instabile a causa delle numerose Low Copy Repeats.

“Anomalie del cromosoma sessuale”

47, XXY e Yq deletion.

I fattori di controllo della spermatogenesi sono stati individuati sulla porzione non fluorescente del braccio lungo dell'Y (Tiepolo e Zuffardi, 1976).

Yq deletion → manca una parte (o tutto) del braccio lungo di Y; ancora non si conosce la funzione dei geni presenti in questa zona deleta, ma portano ad azoospermia (AZF, factors).

Più microdelezioni ci sono su Yq, più sarà grave l'azoospermia.

Sull'Y avvengono tante delezioni a causa dell'alto numero di LCRs che si ricombinano facilmente, causando l'eliminazione del gene (NAHR).

Sul braccio corto di Y (Yp) c'è il gene AMELY, molto simile ad AMELX che si trova su Xp; c'è quindi un alto rischio di ricombinazione.

N.B. Nelle sindromi prevale il tasso di delezione del gene causativo sul tasso di duplicazione!

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Elevato numero di copie per una data variante

Cosa comporta un elevato numero di copie per una data variante?

Es: il gene AMY1 codifica per l'amilasi salivare, quindi più copie di questo gene si hanno più facilmente si digerisce l'amido.

Dunque alcune varianti sono favorevoli allo sviluppo anche se non si trovano in stato diploide.

AMY1 varia molto all'interno di una popolazione, e le popolazioni che consumano molto amido hanno in media più copie di questo gene.

Uno studio sugli scimpanzé (frugivori) ha evidenziato che hanno soltanto 2 copie di AMY1. Quindi la variabilità in numero di copie di questo gene ha permesso all'uomo di svilupparsi, migliorandone il fitness.

I cani hanno introdotto nel loro genoma alcuni geni per la digestione di amidi e grassi (a differenza dei lupi selvatici) a partire dai primi insediamenti umani (rivoluzione agricola), dove trovavano cibi di scarto della dieta umana.

Se ne deduce che le CNVs sono state fondamentali per l'evoluzione delle specie.

Il 5/12% del genoma umano è suscettibile alle CNVs.

“Penetranza incompleta e variabilità di espressione”

Uno studio di 48 casi ha evidenziato che il retinoblastoma è un tumore causato da 2 eventi mutazionali.

• Nella forma ereditata: 1 mutazione si eredita per via germinale, la seconda si sviluppa nelle cellule somatiche (Second Hit).
• Nella forma “De Novo”: entrambe le mutazioni avvengono nelle cellule somatiche.

Quindi l'ipotesi del secondo hit spiega sia le differenze del numero di tumori sia l'età in cui si sviluppa.

A causa dell'alta probabilità di sviluppare il II hit, la maggior parte dei soggetti col primo hit ereditato sviluppa il retinoblastoma; se ne deduce che si eredita il rischio di sviluppare il cancro, e non il cancro stesso.

La penetranza incompleta c'è quando:

1. O non avviene il secondo hit;
2. O entrambi gli hit sono mutazioni missenso, permettendo il funzionamento (anche solo parziale) della proteina per cui codificano (N.B. è un gene oncosoppressore!).

Lo sviluppo del tumore, siccome richiede entrambi gli hit, è recessivo!

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“TAR”

Episodi di sanguinamento nel primo anno di vita me che si ridimensionano con l'età (non si sa il perché).

La gravità della sindrome può variare: dalla assenza del solo radio, a malformazioni di tutti gli arti.

In tutti i pazienti TAR si è notata una microdelezione in 1q, ma anche nel 25/30% dei loro familiari seppure non fossero affetti da TAR.

Tale mutazione non è presente però nelle famiglie senza casi di TAR.

Se ne dedurrebbe che la TAR è una sindrome autosomica dominante con penetranza incompleta.

Per trovare quale fosse il secondo hit si è fatto un next generation sequencing, ma: scartando gli SNPs con frequenza >1% non si è trovata nessuna mutazione negli esoni dei geni sul cromosoma “sano” (nella regione corrispondente a quella deleta nel cromosoma “malato”) → (paziente TAR con delezione eterozigotica in 1q).

Allora: abbassando la soglia degli SNPs scartati a >5% si è trovata la causa nel gene RBM8A, a volte in 5', a volte nella sequenza intronica iniziale.

Quindi gli SNPs e la delezione sono stati ereditati da diversi parenti in salute.

La sindrome di TAR è quindi in realtà autosomica recessiva, legata al gene RBM8A, deleto o con mutazione loss of function su un allele, e con una mutazione ipomorfica (SNP) sull'altro.

RBM8A codifica per una proteina presente nelle piastrine: chi ha solo una delezione non ha il fenotipo (TAR) grazie al secondo allele “sano”; ma se anche questo viene mutato (secondo hit) allora si presenta la TAR.

Il secondo hit può avvenire per delezione, ricombinazione, perdita del cromosoma o per mutazioni.

La stessa mutazione può avere un vastissimo spettro fenotipico, con sintomi più o meno gravi e che si possono esprimere in diverse quantità.

Questa variabilità è data dalle diverse possibilità di insorgenza del secondo hit.

La TAR

2007, Eva Klopocki: identificò, come causa della TAR, alcune microdelezioni in 1q, in alcuni casi ereditate dal padre, in altri dalla madre.

Tuttavia i genitori che trasmisero le microdelezioni ai figli TAR, non erano malati! (variante benigna rara, 1:4000).

Quindi si ipotizzò che la delezione fosse una condizione necessaria ma non sufficiente; ci vuole un secondo fattore moltiplicativo.

Come si individuarono le condizioni genetiche che portano alla TAR?

Verificarono la frequenza di chi aveva una delezione su un allele (in pochi casi una mutazione loss of function) e uno SNP sull'altro (il gene “incriminato” è RBM8A).

Risultato: 1:240`000 che coincide con la frequenza degli affetti TAR nella popolazione!

RBM8A codifica per la proteina Y14. La sola delezione di un allele non provocherebbe la TAR, poiché il suo omologo produrrebbe sufficiente Y14; tuttavia uno SNP su quest'ultimo abbassa la produzione di Y14 sotto la soglia critica, portando all'insorgenza della patologia.

Come agisce lo SNP?

Lo SNP può presentarsi all'estremità 5' di RBM8A, o nella sua prima sequenza intronica.

Agisce da sito di attacco per una proteina che silenzia il gene successivo (in questo caso RBM8A poiché lo SNP si trova al suo inizio), provocando così una drastica diminuzione della produzione della proteina (Y14).

Infatti in caso di omozigosi dello SNP, in totale vi è una produzione di Y14 sufficiente al normale sviluppo dell'embrione; casi di omozigosi della delezione invece non sono stati mai osservati poiché è una condizione incompatibile con la vita (totale assenza di Y14).

N.B. RBM8A è espresso in tutte le cellule dell'organismo, tuttavia (non si sa perché) la sua carenza provoca problemi solo nelle piastrine e nelle ossa periferiche.

Gli SNPs causativi della TAR non sono stati riscontrati nel genoma della popolazione africana, nella quale tuttavia sono stati registrati casi di TAR; ciò suggerisce la possibilità che esistano diverse varianti di insorgenza e trasmissione della TAR.

In conclusione la sindrome di TAR è causata dall'eredità del complesso biallelico:

• I allele → 1 o 2 SNP (5' e intronico);
• II allele → delezione o mutazione loss of function (raramente).

Le 2 varianti dello SNP spiegano la possibile penetranza incompleta della TAR.

Sindrome velo-cardio-facciale (“Di George”)

È causata da una microdelezione in 22q, non identificabile con la citogenetica convenzionale.

La sua frequenza elevata (1:2000) è dovuta al fatto che in quel punto del Chr. 22 c'è un'architettura genomica incline a creare tali delezioni: ci sono LCR altamente omologhe a distanza di 3 Mb; infatti la microdelezione consiste:

• 90% dei casi → 3 Mb (40 geni coinvolti);
• 10% dei casi → 1,5-3 Mb;

Tuttavia gli unici geni sensibili al dosaggio sono compresi in quel 1,5 Mb che viene sempre deleto!

È una delezione a penetranza completa: chiunque abbia tale mutazione presenta almeno alcuni dei sintomi previsti; tuttavia è una sindrome con espressività estremamente variabile: ci sono circa 180 sintomi correlati alla s. Di George, tuttavia sono rarissimi i casi in cui si presentano tutti assieme.

Un genitore affetto ha 50% di possibilità di avere un figlio malato.

I sintomi più comuni (>70%) sono:

• Difetto del setto atrio-ventricolare (dovuto ad aploinsufficienza del gene TBX1);
• Parlata con voce nasale.

In tutti gli affetti c'è un ritardo psico-motorio con disabilità intellettiva (ID).

Nel 20% dei casi circa si presentano problemi comportamentali (schizofrenia, depressione, fobie...); si calcola che l'1% degli schizofrenici abbia la delezione in 22q.

A questa sindrome è inoltre associata, alcune volte, la polimicrogiria (mancato sviluppo delle involuzioni cerebrali).

Charcot Marie Tooth (1A)

È causata da una duplicazione in 17p.

Provoca:

• Progressiva atrofia muscolare;
• Diminuzione della Velocità dello Stimolo Nervoso (NCV) → questo sintomo è a penetranza completa, infatti si presenta in tutti i soggetti CMT fin dalla nascita;
• Polineuropatia Simmetrica Distale (DSP).

L'età di insorgenza di tale malattia è variabile.

N.B. Nonostante il genotipo delle CMT sia lo stesso per tutti gli affetti, ogni individuo presenta sintomi relativi