Corso avanzato di biologia cellulare

Corso avanzato di biologia cellulare

Lezione 1 - 19/02: Introduzione al corso

Testo: Biologia molecolare della cellula Alberts, Molecular cell biology James Darnell.

Struttura di un articolo

Nomi degli autori: vengono messi in base al contributo apportato. Il primo autore è quello che ha dato il contributo maggiore dal punto di vista sperimentale. L’ultimo autore è il responsabile della ricerca. Se si vogliono trovare articoli sul medesimo argomento è più facile trovarli ricercando articoli dell’autore in ultima posizione rispetto agli altri.

Struttura dell'abstract

• Ci deve essere una prima parte (non molto lunga) che introduce l’argomento.
• La parte centrale, più corposa, descrive in cosa consiste il lavoro e quali sono i risultati.
• Conclusione.

In seguito al titolo e all’abstract in un articolo troviamo:

• L’introduzione, che presenta in modo approfondito l’argomento
• Materiali e metodi: dove vengono esposte tutte le tecniche utilizzate
• Risultati: dove vengono presentati i risultati ottenuti
• Discussione: dove i risultati vengono analizzati e si giunge a delle conclusioni
• Riconoscimenti: persone che hanno apportato un contributo all’articolo

Lezione 2 - 21/02: Il ciclo cellulare

Video introduttivo: Cell cycle and mitosis.

Il ciclo cellulare inizialmente venne osservato nel 1800 quando grazie ai primi microscopi si osservarono le prime cellule vive e vennero identificati i processi che partecipavano alla divisione delle cellule. Flemming osservò le cellule della salamandra e disegnò le fasi della divisione che era riuscito a osservare. Da lì si iniziò a capire che c'erano diversi processi che avvenivano durante la divisione cellulare. Solo molti anni dopo, con la scoperta del DNA, si iniziò a comprendere davvero cosa accadeva e in che fase il materiale veniva duplicato. Si identificò la fase di duplicazione come fase S (sintesi) in cui il genoma viene copiato per poi essere diviso nelle due cellule figlie.

Gli studi iniziali utilizzavano l'autoradiografia con granuli d'argento. Durante la sintesi di DNA servono nuovi nucleotidi da incorporare, per cui ne venivano forniti di marcati radioattivamente. Questi emettevano radiazioni che, grazie all'emulsione fotografica messa sui vetrini che faceva precipitare i granuli d’argento, permettevano l'osservazione. Quindi le cellule che avevano il nucleo in fase S risultavano marcate. Questi esperimenti presentavano diversi problemi: smaltimento materiale radioattivo, danni alla salute per lo sperimentatore ecc.

Oggi si usano due tecniche: l'incorporazione di BRDU e EdU. Queste tecniche sfruttano ancora l'incorporazione di nucleotidi marcati all’interno del DNA che si sta formando. Il vantaggio è che non viene utilizzato un marcatore radioattivo, bensì un nucleotide con una modificazione chimica. In particolare viene utilizzata una bromo deossiuridina che viene incorporata nel DNA. Nel caso del BrdU, dopo l'incorporazione, si mette nelle sezioni un anticorpo rivolto verso il nucleotide modificato. Quest'ultimo viene a sua volta riconosciuto in genere da un secondo anticorpo che è marcato fluorescentemente (immunoistochimica). Questa tecnica si può usare sia per cellule in vivo che per cellule direttamente in vivo.

La BrdU la si può mettere anche nel mezzo: ad esempio nel mezzo di ZebraFIsh e questa viene incorporata. In alcuni casi si può usare invece l'incorporazione della EdU: il principio è lo stesso. Il vantaggio è che si elimina il rumore di fondo. Non si usa un anticorpo per riconoscere il nt incorporato ma si usa una molecola chimica che si appaia con il nt marcato, la molecola ha una sua fluorescenza e quindi permette di vedere il nucleo in fase S. Infatti a volte anche l'anticorpo può sbagliare perché può riconoscere antigeni simili o molecole simili. La EdU in vivo risulta però più tossica dell'altra.

Il ciclo cellulare è una serie di eventi organizzati nel tempo. Prima di poter passare da una fase all'altra si deve avere la conclusione della fase precedente e per questo sono necessari i punti di controllo. Se si ha il blocco di una fase cellulare, la cellula si blocca e può andare incontro a apoptosi. Il passaggio da una fase all'altra è regolato dai complessi ciclina-chinasi che sono specifici per ogni fase del ciclo. È importante anche che ci sia un controllo che determina l'uscita dal ciclo cellulare (se la cellula si continua a dividere si ha il tumore).

L'ingresso in mitosi è stato un processo difficile da capire e furono fatti diversi tentativi e osservazioni. Ad esempio, furono fatti esperimenti in cui venivano fatte fondere cellule in divisione con cellule che erano in fase G1 (fase di riposo, cromatina non addensata). Se si forzava tale processo anche i cromosomi delle cellule in fase G1 si iniziavano a condensare: venne quindi l'idea che ci fossero dei fattori che inducevano tale processo.

I fattori furono chiamati complesso MPF (Mitosis promoting factor - maturation promoting factor per esperimenti in oociti immaturi di Xenopus). Per identificare tali fattori ci è voluto molto tempo e diversi approcci sperimentali. Inizialmente vennero fatti studi su embrioni di Xenopus e su riccio di mare. Da questi lavori si iniziarono a definire le proteine cicline (perché avevano a che fare con il ciclo cellulare e perché dagli studi biochimici nel riccio di mare si vide che la loro [ ] variava nelle varie fasi del ciclo cellulare). Il riccio di mare fu utile perché l'embrione del riccio di mare ha le prime divisioni sincronizzate. Tutte le sue cellule sono quindi nella stessa fase, estraggo le proteine, aspetto e ne estraggo di nuove: se lo facessi con cellule che non sono sincronizzate avrei delle estrazioni di proteine diverse che derivano da tutte le varie fasi delle varie cellule di partenza.

Si notò che la ciclina B ad esempio aveva bassa [] in G1 e aveva un suo picco prima dell'entrata in mitosi. La E invece aveva un picco tra la G1 e la S mentre la ciclina A aveva un picco tra la fase S e la G2. Il modo migliore per regolare la loro [] è la regolazione della loro degradazione (lavoro sulla sua emivita). È stato visto che se si prendono le varie cicline tutte hanno nel N terminale una sequenza super conservata che venne chiamata Destruction box. Essa viene riconosciuta dall'enzima ubiquitina ligasi (processo di degradazione attraverso il proteasoma di biochimica). Questa estremità è sempre esposta in modo che appena la proteina si accumula venga subito degradata.

Dopo molto tempo si è riusciti a capire meglio qual è l'azione delle cicline, in particolare è stato usato un altro sistema modello: i lieviti. Sono organismi eucariotici, sono unicellulari con una fase aploide e con un ciclo cellulare che è coordinato con cambiamenti morfologici della cellula stessa (si possono guardare e capire in che fase sono). In S.cerevisiae quando si passa dalla fase G1 a S si forma una gemma, poi questa si allunga in fase M. In S.Pombe, invece prima della fase M si raddoppia il suo citoplasma.

Inoltre i lieviti producono spontaneamente mutazioni che sono temperatura-sensibili: mutanti che a una certa temperatura sopravvivono mentre a altre la mutazione non consentiva la sopravvivenza (questa roba è sul libro di genetica o di molecolare). In questo modo sono stati identificati i geni necessari per il passaggio tra le varie fasi del ciclo cellulare. Ad esempio, fu identificato un mutante dove se veniva mantenuto a 22° sopravviveva, se veniva passato a 36° le cellule si bloccavano e non riuscivano più a produrre gemme (non riuscivano a passare dalla fase G1 alla S). Ottenendo una linea mutante di questo tipo si è potuto ipotizzare che la mutazione ricada in un gene che codifica per una proteina importante per il passaggio da G1 a S.

Furono identificati anche mutanti dove se si aveva il passaggio da 22° a 36° le cellule si arrestavano con gemme, in questo caso quindi il gene colpito era un gene importante per una fase successiva, infatti riuscivano a fare il passaggio da G1 a S ma non quello successivo. I ricercatori quindi iniziarono a isolare tutti questi ceppi mutanti con caratteristiche differenti, questi mutanti furono tutti classificati con la sigla CDC seguita da un numero progressivo. I mutanti più “interessanti” erano quelli che si arrestavano in una fase specifica.

Per isolare i mutanti si partiva facendo crescere in coltura i lieviti a 23°, veniva poi aggiunto un mutageno dopo di che la coltura veniva aliquotata e ogni aliquota veniva piastrata e fatta crescere a 23°. Veniva effettuata una replica della piastra e una delle due piastre veniva posta a 36°, le colonie con mutazioni temperatura sensibili non riusciranno a crescere. Si deve identificare in questa colonia che presenta una mutazione temperatura-sensibile qual è il gene che è stato mutato.

Per identificare il gene, prima dell’era post-genomica, veniva utilizzato il saggio di complementazione. Questo consiste nell’utilizzo di banche genomiche contenenti il genoma del lievito spezzettato e inserito in plasmidi, viene quindi effettuata una trasformazione sul lievito utilizzando un plasmide contendente un frammento di genoma, se all’interno di questi plasmidi vi è il gene di interesse e quindi il mutante viene trasformato con esso si ha la reversione ad un fenotipo normale. Si identifica quindi il gene mutato. Il plasmide veniva riestratto e a questo punto si effettuava il sequenziamento tramite Sanger.

Tra i vari geni identificati fu trovato quello che complementava per la mutazione CDC28. Una volta identificato cercarono di capire il suo prodotto a quale altra molecola già conosciuta somigliava. Videro che assomigliava alle chinasi. Ciò andava dimostrato: estrassero le proteine, fecero un saggio di immunoprecipitazione, le isolarono e tramite saggi biochimici videro che effettivamente era una chinasi.

Il passaggio successivo fu cercare di capire se ciò che si verificava nel lievito era verificato anche nell'uomo. Venne effettuato un esperimento di complementazione in lievito con un plasmide che conteneva geni umani. Il risultato fu che ciò che era stato visto in lievito era presente in tutti gli eucarioti, uomo compreso. Il gene nei mammiferi venne chiamato cdk1 (corrisponde a quello dei lieviti, CDC2 pombe, CDC28 cerevisae).

La domanda successiva fu quella relativa alla possibile correlazione tra queste chinasi e l'MPF. Attraverso esperimenti in oociti di Xenopus indotti ad entrare in mitosi si cercava di verificare se la cdc2 (o cdk1) erano presenti. La proteina che isolarono però non era una sola: una era la chinasi cdk1 mentre l'altra era una ciclina. Si iniziò a capire che entrambe le componenti erano importanti per l'entrata in mitosi e che l'MPF era l'eterodimero formato proprio da queste due proteine. Nell'uomo per l'entrata in mitosi il dimero è formato da cdk1 e la ciclina B.

Vennero poi trovati complessi simili anche nelle altre fasi del ciclo cellulare: il passaggio tra le varie fasi era quindi regolato da questi complessi. Queste chinasi sono particolari perché di solito le chinasi agiscono da sole, queste sono cicline dipendenti. Furono identificate anche altre mutazioni che non cadevano nei geni che codificano per le cicline o per le chinasi ma in geni che regolano la funzionalità e la degradazione di questi complessi.

Altri due mutanti importanti di lievito furono quelli che rimanevano bloccati in G2 e quelli che si dividevano prima di aver raddoppiato il volume. I geni mutati coinvolti in questi casi codificavano per molecole che regolavano l'azione del complesso chinasi-ciclina. Il complesso una volta formato aveva due siti, una tirosina e una treonina, che erano suscettibili alla fosforilazione (chinasi Wee1). Se venivano fosforilati restavano inattivi. In seguito all'attività di una fosfatasi (CDC25) che elimina la fosforilazione più vicina al sito attivo del complesso si ha l'attivazione del complesso (tirosina 15).

La doppia regolazione (la doppia fosforilazione) che avviene è necessaria perché replicare una cellula difettiva è così pericoloso per l'organismo che è meglio perdere quella cellula piuttosto che rischiare la sua replicazione. Questo doppio meccanismo nasce dal fatto che la cellula nel suo percorso può accumulare danni sul DNA che non sono andati ad inficiare sull’espressione della ciclina e della chinasi, la cellula è quindi in grado di formare il complesso ciclina chinasi ma esistono altri sistemi di controllo che verificano l’integrità del genoma e se sono presenti mutazioni vanno a bloccare la fosfatasi CDC25. In questo modo si evita di replicare una cellula che ha danni sul DNA.

Quale è l'azione del MPF? Va a fosforilare una serie di proteine che sono importanti per entrare in mitosi: le condensine per compattare i cromosomi, le lamine per far disgregare il nucleo e proteine che attivano i microtubuli necessari per far comparire il fuso.

• Lamine: filamenti intermedi. Sono un'eccezione perché non sono tessuto specifiche e non stanno nel citoplasma ma nel nucleo. Si dispongono sotto alla membrana nucleare e danno forma e struttura alla membrana nucleare, servono per l'interazione con altre proteine che determinano la posizione dei cromosomi nella cellula e sono famose perché loro mutazioni, specialmente nella A, portano alla formazione della progeria. In questa malattia i cromosomi non hanno più la loro corretta disposizione, la trascrizione risulta influenzata e si hanno così problemi generalizzati che portano a un invecchiamento precoce.
• Condensine: (vedi biol. Mol. 2.) proteine che legandosi al DNA mediano interazioni e compattano la struttura. Esse devono essere attivate all'inizio della mitosi proprio tramite fosforilazione.
• Cosesine: mantengono vicini i cromatidi fratelli.

Lezione 3 - 26/02/19

Figura utile per studiare. Fasi della mitosi sulle slides

Deve essere regolata anche l’uscita dalla mitosi. Si sa che il complesso ciclina B/cdk1 ha un picco di accumulo della proteina a livello dell’entrata in mitosi e che appena si entra nella mitosi la ciclina B deve essere degradata. Un modo per degradare la ciclina è quello tramite la sua destruction box che viene riconosciuta dall’ubiquitina ligasi. Quindi si deve avere un sistema di controllo che regola le ubiquitina ligasi. Esse sono regolate da un complesso proteico chiamato APC (Anafase Promoting Complex). APC è un sistema di poliubiquitine che si agganciano ai residui della ciclina facendola degradare. Quando il complesso della ciclina B si attiva e raggiunge i suoi massimi livelli va a fosforilare anche la stessa APC, attivandola (è una sorta di feedback). In questo modo il sistema di regolazione è molto efficiente. In questo modo i livelli di ciclina B in fase G1 saranno prossimi allo zero.

Bisogna ricordare che il proteasoma degrada proteine singole, non riesce a smaltire complessi proteici (problema dell’invecchiamento). APC non degrada solo la ciclina B, infatti ha anche un'altra funzione fondamentale: media l’inizio della anafase. In anafase si deve avere la separazione dei cromatidi fratelli, quindi le coesine devono essere rimosse. L’enzima separasi si occupa proprio di tale processo e risulta attivato proprio da una APC. La separasi si trova infatti inibita dal legame con la proteina securina. L’APC quindi degrada (poliubiquitina) la securina.

La APC a sua volta viene attivata in tal senso da un sistema di un ulteriore controllo: è necessario un cofattore per la sua attività che si chiama CDC20 (è una di quelle proteine identificate con i mutanti del lievito). Quest’ultimo può interagire con la APC sono quando i cromosomi sono tutti allineati nella piastra metafasica. Nota: in questo schema non c’è CDC20. CDC20 è necessario per entrambe le funzioni. Altri schemi sulle slides.

Tutto questo poi è stato confermato anche da studi effettuati sulle cellule di mammifero. In particolare poi è stato studiato come si entra in fase S in tali organismi (studi in coltura). È stato abbastanza facile studiare questo processo perché si usava mezzo base per la cultura e poi si somministrava un fattore di crescita che ne induceva la divisione. È stato visto quanto tempo impiegava una cellula che stava in G0 o in G1 a entrare in fase S dopo aver dato il fattore di crescita (facendo anche vari test tipo: lo do per un’ora e poi lo tolgo, lo lascio per due ore e poi tolgo ecc). È stato individuato un punto definito restriction point che è un certo periodo di tempo dalla somministrazione del fattore di crescita per il quale, anche se tolgo il fattore, le cellule ormai sono indirizzate verso la fase S. Il periodo identificato è di 14-16 h.

I fattori di crescita sono diversi, sono molecole che si legano a dei recettori di membrana di vario tipo (in genere sono dotati di attività tirosin-chinasica o in altri casi possono essere coinvolti ormoni o si può avere il legame recettori a 7 segmenti transmembrana legati a proteine G) ma in ogni caso attivano cascate di trasduzione che attivano dei fattori di trascrizione nel nucleo di geni implicati nell’entrata in fase S. Una delle vie più studiate della risposta a fattori di crescita o a mitogeni è la via di RAS, questa è molto studiata poiché si trovano diverse mutazioni a carico di questa via. Ras è una proteina che media lo scambio GDP con GTP e la sua attivazione fa sì che vengono attivati dei secondi messaggeri (MAP chinasi) che poi portano all’attivazione della trasduzione del segnale. Ras non è specifico di una determinata via, viene attivato per portare alla proliferazione cellulare. Ras può essere attivata anche da proteine G associate a recettori.

Quando si aggiungono fattori di crescita in colture, questi attivano i fattori di trascrizione e nella cellula possono accadere diverse cose a seconda del fattore di crescita.