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- Fornisce i dispositivi per la comunicazione cellula – cellula e per l'adesione cellulare

- Le membrane biologiche contengono colesterolo:

Una delle molecole presenti nella membrana

plasmatica è il colesterolo che interviene in

molte funzioni. Ha una struttura totalmente

diversa dai fosfolipidi. E' una molecola apolare

e rigida. L'unica parte polare è un gruppo -OH

posto esternamente alla molecola. E' una

molecola anfipatica con dimensioni più ridotte

di quelle del fosfolipide e si interpone tra un

fosfolipide e l'altro. La testa polare del colesterolo sta in

corrispondenza delle teste dei fosfolipidi. Il colesterolo serve a

rendere la membrana impermeabile alle piccole molecole solubili in acqua e mantiene la

membrana flessibile.

- Proprietà della membrana plasmatica:

• Asimmetria del doppio strato fosfolipidico: la composizione dei fosfolipidi dell'emistrato

extracellulare è diversa da quella dei fosfolipidi dell'emistrato intracellulare.

Quelle rivolte verso l'esterno contengono soprattutto fosfatidilcolina mentre quelle rivolte

verso l'interno contengono fosfatidilserina, fosfatidilinositolo e fosfatidiletanolammina.

Se si trovano fosfolipidi in posizioni opposte significa che la cellula sta andando incontro

alla morte per apoptosi (programma di morte che la cellula attua per suicidarsi).

Verso l'esterno vi sono sempre i glicolipidi (parte lipidica unita a uno zucchero) mentre il

colesterolo si trova in entrambi gli emistrati della membrana plasmatica.

• La membrana plasmatica è fluida: la fluidità è fondamentale per i processi di trasporto e

per le attività enzimatiche; a seconda della temperatura possiamo avere:

- lo stato cristallino, i fosfolipidi sono ordinati e si ha con una temperatura bassa

- lo stato fluido, i fosfolipidi non sono ordinati e si ha con una temperatura più alta

La fluidità è influenzata da:

- temperatura: a temperature più alte lo stato è più fluido e viceversa;

- lunghezza e insaturazione della catene degli acidi grassi (catene lunghe e sature

favoriscono la stato cristallino mentre catene corte e insature favoriscono lo stato fluido)

- colesterolo (ad alte temperature contrasta un'eccessiva fluidità e a basse temperature

impedisce il congelamento

[I batteri non hanno il colesterolo e per evitare che alte temperature rendano la membrana

troppo fluida sintetizzano fosfolipidi saturi e viceversa].

- proteine: diminuiscono la fluidità.

Il doppio strato fosfolipidico è un fluido bidimensionale: questo permette ad alcune

molecole di muoversi, ad esempio i fosfolipidi si muovono lateralmente e possono ruotare

attorno al proprio asse, possono fare anche un altro movimento (che è molto raro): il flip-

flop è la diffusione trasversale, ossia il passaggio di un fosfolipide da un emistrato all'altro

(quello che avviene per attuare la morte per apoptosi).

Ci sono delle zone della membrana dove la fluidità è inferiore, essi vengono chiamati:

- microdomini raft quando abbiamo una particolare composizione dei fosfolipidi

- caveole che sono delle zone dove la membrana è meno fluida a causa della presenza

di caveoline che sono delle proteine. Le caveoline interagiscono con molecole segnale e

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costituiscono l’impalcatura per organizzare i preassemblati complessi della segnalazione.

Queste zone vengono anche dette invaginazioni.

- Modello di membrana di Singer e Nicolson (a mosaico fluido del 1972):

il modello di membrana è universale ed è detto “a mosaico fluido” e racchiude tutte le

descrizioni precedenti: è formato da un doppio strato fosfolipidico con le teste idrofile

orientate verso l’acqua e le code idrofobe in direzione opposta. In mezzo troviamo

proteine e carboidrati sulla superficie esterna che possono presentarsi attaccati a lipidi:

glicolipidi o attaccati alle proteine: glicoproteine.

- Composizione chimica:

A seconda del tipo di cellula e membrana la composizione varia

Tabella con composizione percentuale di alcune membrane:

Membrana Proteine Lipidi Carboidrati

Mielina 18 79 3

Eritrocita 49 43 8

Epatocita 44 52 4

Mitocondriale 76 24 0

interna

La stessa composizione in fosfolipidi cambia da cellula a cellula

DPG: cardiolipina presente solo nella membrana mitocondriale interna e nei batteri.

- Glicoproteine:

Proteine con attaccate molecole glucidiche (zuccheri). Se alle proteine abbiamo

attaccato un oligosaccaride si viene a formare la glicoproteina, se invece è attaccato un

polisaccaride si forma il proteoglicano.

In ogni caso la parte glucidica è rivolta verso l'esterno.

- Le proteine di membrana:

Tutte le membrane biologiche contengono proteine. Le proteine di membrana possono

essere: canali, enzimi, recettori e trasportatori. Le proteine di membrana svolgono la

maggior parte delle funzioni specifiche della membrana plasmatica. Possono essere

glicosilate sulla faccia esterna (glicocalice o rivestimento cellulare).

Vi sono due tipi generali di proteine di membrana:

- Integrali o transmembranali: attraversano completamente il doppio strato di fosfolipidi.

Possono essere monopasso (se attraversano la membrana una volta) o multipasso (se la

attraversano più volte).

- Periferiche: sono attaccate meno saldamente rispetto alle integrali, esse sono ancorate

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alla membrana mediante varie interazioni. Possono essere per esempio ancorate ai lipidi.

- Diffusione delle proteine nella membrana:

Le proteine diffondono nel piano della

membrana, l'esperimento per la

dimostrazione del “mosaico fluido” fu il

seguente: facendo la fusione tra una cellula

umana e una cellula di topo viene a formarsi

un eterocarionte (cellula che si forma dalla

fusione tra due cellule di 2 specie diverse) e,

riconoscendo attraverso delle sonde le

proteine dell’uomo e le proteine del topo,

hanno osservato che, dopo 1 ora, le proteine

risultano mescolate nell’eterocarionte.

Le proteine non sono distribuite

uniformemente su tutta la superficie della

cellula, la composizione in proteina di

membrana da un lato è diversa da quella

rivolta sull'altro lato (per esempio le cellule

dei villi intestinali hanno una funzione diversa

sui diversi lati della cellula: da una parte

assumono le sostanze e dall'altra parte le

rigettano le sangue per questo motivo le

proteine di membrana dovranno essere

diverse). Proteine e lipidi possono essere

confinati in domini specifici, mentre il

colesterolo è distribuito uniformemente nei due strati.

- Glicocalice:

Il glicocalice è formato da glicolipidi, glicoproteine e proteoglicani, esso è quindi uno

strato ricco di zuccheri. Ha due funzioni: protezione e idratazione (gli zuccheri richiamano

molta acqua).

- Gli oligosaccaridi legati a lipidi o proteine svolgono un ruolo antigenico:

Gli antigeni dei gruppi sanguigni presenti sugli eritrociti derivano dalla modificazione di

glicolipidi di membrana da parte di glicotrasferasi diverse:

- Enzima H: aggiunge fucosio all'estremità (antigene 0)

- Enzima A: aggiunge N-acetil-galattosammina (antigene A)

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- Enzima B: aggiunge galattosio (antigene B)

Antigene: molecola con una certa dimensione che se introdotta nell'organismo può

generare una risposta immunitaria, riconosciuta come non-self.

Trasporto attraverso la membrana:

E' un meccanismo essenziale per la sopravvivenza della cellula e può avvenire in quanto

la membrana plasmatica è una barriera semipermeabile.

Il trasporto è necessario per:

- Assunzione di sostanze nutrienti essenziali (es: glucosio)

- Eliminazione prodotti metabolici di rifiuto (es CO )

2

- Regolazione concentrazioni ioniche (Na , Ca , H … lo ione Ca per esempio è poco

+ 2+ + 2+

concentrato dentro alla cu7yellula)

- Il trasporto di piccole molecole si divide in due grandi categorie:

Non richiede energia:

Trasporto - Diffusione semplice esoergonico

passivo - Diffusione facilitata (si verifica spontaneamente)

Richiede energia:

endoergonico

- Trasporto attivo primario

Trasporto (si verifica solo quando

- Trasporto attivo secondario

attivo è accoppiato ad un processo

esoergonico)

1) Movimento spontaneo → secondo gradiente

di concentrazione (da più concentrato a

meno concentrato) ← diffusione semplice o

osmosi inversa, ad attraversare la membrana

sono molecole piccole apolari.

2) Movimento non spontaneo → contro

gradiente di concentrazione (da meno

concentrato a più concentrato)

Osmosi: il soluto non può oltrepassare la

membrana perciò è l'acqua a spostarsi

diluendo la soluzione.

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- Trasporto passivo:

La capacità di diffusione attraverso il doppio strato lipidico varia in funzione della

idrofobicità (solubilità in un mezzo idrofobico) e della dimensione delle molecole.

Molecole idrofobiche (C , CO , N , Benzene): riescono a passare per diffusione semplice

l2 2 2

Piccole molecole polari (acqua, urea): passano ma lentamente

Molecole polari abbastanza grandi: glucosio e saccarosio, non riescono a passare per

diffusione semplice.

Ioni H , Na , HCO ,K ,Ca ,Cl ,Mg : non riescono a passare perché risultano solvatati da

+ + 3- + +2 - +2

acqua e quindi la dimensione è molto più grande inoltre hanno una carica netta che non

le fa passare nel doppio strato.

La diffusione è il processo che permette alle molecole, tramite movimenti casuali, di

raggiungere uno stato di equilibrio, ovvero si ha un movimento netto di molecole da

regioni in cui hanno maggiore concentrazione verso regioni a minore concentrazione.

La velocità di diffusione dipende da tre fattori:

- diametro della molecola: più sono piccole più la diffusione è veloce;

- temperatura della soluzione: maggiore è la temperatura e più la diffusione è veloce;

- gradiente di concentrazione del sistema: maggiore è il gradiente di concentrazione e

più la diffusione è veloce. Nella cellula una sostanza più concentrata all’interno della

cellula diffonde all’esterno e viceversa.

- Diffusione semplice:

Alcune piccole molecole possono attraversare il doppio strato fosfolipidico per diffusione

semplice, in generale: più la molecola è liposolubile (idrofobica) tanto più rapidamente

diffonde attraverso la membrana.

Le molecole polari piuttosto grandi o dotate di carica elettrica (ioni) non riescono invece

a passare per diffusione semplice perché non sono solubili nella regione idrofobica e

formano legami a idrogeno con l’acqua e gli ioni presenti, questi impediscono alle

sostanze di spostarsi attraverso la membrana.

- Osmosi:

L’osmosi è il processo di diffusione delle molecole d’acqua grazie a canali specializzati

attraverso le membrane. In ogni soluzione più è alta la concentrazione totale di soluti, più

è bassa la concentrazione delle molecole d’acqua, che quindi si sposteranno attraverso

la membrana verso la soluzione che ha più bassa concentrazione di molecole d’acqua.

L’acqua attraverso questo processo si sposta continuamente attraverso la membrana.

Per confrontare le concentrazioni si utilizzano tre termini: soluzione ipertonica: la sua

concentrazione di soluti è maggiore di quella dell’altra soluzione; soluzioni isotoniche: la

loro concentrazione di soluti è identica; soluzione ipotonica: la sua concentrazione di

soluti è minore di quella dell’altra soluzione.

Nelle cellule animali dotate soltanto della membrana plasmatica quando si ha un

eccessivo ingresso di acqua la cellula può scoppiare in quanto la membrana non è in

grado di sopportare la pressione creatasi; mentre nelle cellule animali dotate di parete

cellulare questo no accade perché la parete è in grado di sopportare la pressione e di

limitare l’ingresso di acqua.

- Diffusione facilitata:

Vi è una proteina di trasporto che aiuta il passaggio della molecola che non riuscirebbe a

passare normalmente ma, comunque, avviene secondo gradiente di concentrazione.

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Le sostanze polari che non riescono a passare per diffusione semplice possono comunque

attraversare la membrana grazie all’aiuto di proteine che possono essere:

- Proteine trasportatrici: si legano al soluto specifico e subiscono cambiamenti di

conformazione per trasferire il soluto legato attraverso la membrana. La proteina

trasportatrice si alterna tra due conformazioni, in modo che il sito di legame del soluto sia

esposto sui due lati della membrana. E’ molto selettiva.

- Proteine canale: non devono legare il soluto ma formare un poro idrofilo per il passaggio

del soluto nel doppio strato lipidico. La proteina canale forma un poro pieno di acqua in

cui diffonde lo ione specifico. Il soluto non interagisce con la proteina canale. Questi

canali sono altamente selettivi, esiste infatti per ogni ione uno specifico canale.

Solitamente è chiuso e si apre soltanto sotto particolari stimoli, se lo stimolo consiste nel

legame di un segnale chimico si parla di canali ionici ligando – dipendenti; se lo stimolo è

un cambiamento di voltaggio prendono il nome di canali ionici voltaggio – dipendenti.

- I canali ionici:

I canali ionici trasportano ioni inorganici (fino ad un milione di ioni/sec, sono molto veloci e

vengono usati soprattutto dalle cellule nervose) con un trasporto di tipo passivo secondo

gradiente di concentrazione. Sono selettivi per un determinato ione, che deve avere

carica e dimensione adatta per riuscire a passare nel canale. Fluttuano tra uno stato

aperto ed uno chiuso.

Possono essere regolati da:

1) Cambiamenti di voltaggio attraverso la membrana, si aprono in risposta al

cambiamento del potenziale di riposo di membrana. Il potenziale di membrana si forma

quando vi è una differenza di carica elettrica sui due lati di membrana, dovuta ad un

lieve eccesso di ioni positivi su un lato e di ioni negativi sull’altro. Il potenziale di membrana

è -70mV (potenziale di riposo); se questo potenziale varia e inizia, per esempio, ad

assumere valori sempre più negativi, il canale ionico si apre e fa passare ioni.

2) L'attacco di un ligando (neurotrasmettitore, ione o nucleotide)

3) Uno stress meccanico

I canali ionici sono responsabili dell'eccitabilità elettrica della membrana e mediano i

segnali elettrici nel sistema nervoso. Sono presenti in tutti i tipi di cellule.

Quelli più comuni sono i canali del K+, che rendono la membrana preferenzialmente

permeabile a questo ione, servono a mantenere il potenziale di membrana, cioè la

differenza di voltaggio presente sulle membrane plasmatiche.

- Proteine trasportatrici:

In questo caso le sostanze trasportate devono legarsi ad una proteina di trasporto detta

carrier; queste proteine trasportano molecole polari come zuccheri ed amminoacidi.

Il glucosio ad esempio è la principale fonte di energia della cellula e quindi è necessari

che il suo ingresso nella cellula sia piuttosto rapido in modo da soddisfare i bisogni

energetici della cellula, questo è garantito da una proteina (trasportatore del glucosio).

Il glucosio si lega con la proteina e questo causa un cambiamento di conformazione

della proteina ed il rilascio del glucosio sull’altro lato della membrana. Questo processo

tuttavia è quasi sempre favorito da un forte gradiente di concentrazione che favorisce

l’ingresso nella cellula. Il trasportatore del glucosio consente inoltre al glucosio di entrare

nella cellula piuttosto rapidamente; questa velocità dipende dal gradiente di

concentrazione transmembrana, tuttavia ad un certo punto l’aumento del gradiente di

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concentrazione non influenza più la velocità di diffusione siamo quindi giunti a saturazione.

- Uniporto o cotrasporto: - Uniporto: viene trasportata una sola

molecola in una direzione

- Cotrasporto: vengono trasportate

due molecole e possono andare nella

stessa direzione (simporto) o in direzioni

opposte (antiporto).

- Trasporto attivo: movimento contro gradiente

Quando la diffusione di un soluto avviene contro il gradiente di concentrazione o, se ioni

carichi si spostano contro il gradiente elettrochimico (oltre alla concentrazione si tiene

conto anche della carica della molecola), si ha il trasporto attivo.

Il trasporto avviene attraverso proteine trasportatrici (e non canali) che sono accoppiate

ad una fonte di energia metabolica, in genere la fonte di energia è l’ATP che contiene

energia chimica immagazzinata nell’ultimo legame fosfato e quindi viene liberata

quando l’ATP è convertito in ADP (idrolisi).

Le proteine trasportatrici coinvolte devono sia trasferire i soluti che accoppiare il

trasferimento ad una reazione che cede energia (esoergonica).

Il trasporto attivo ha, principalmente, 3 funzioni:

1. Rende possibile l'assorbimento di sostanze nutritive dall'ambiente anche quando le loro

concentrazioni sono basse rispetto a quelle dentro le cellule.

2. Permette la rimozione di sostanze metaboliche di rifiuto quando la loro concentrazione

all'esterno è più anche che nella cellula.

3. Consente alla cellula di mantenere le concentrazioni intracellulari di ioni specifici, tra

cui K , Na , Ca , e H in una situazione di non equilibrio: in questo modo si bilancia

+ + ++ +

l'effetto del trasporto passivo, che tende a eguagliare le concentrazioni di soluti.

Il trasporto attivo è direzionale, e a direzione verso cui viene trasportata una sostanza

dipende dai bisogni della cellula.

Anche in questo caso esiste una proteina di trasporto specifica per ogni sostanza.

Vi sono due tipi di trasporto attivo:

- trasporto attivo primario: implica l’idrolisi diretta dell’ATP;

- trasporto attivo secondario: non utilizza direttamente l’ATP ma l’energia viene fornita da

un gradiente di concentrazione ionico o elettrico generato da un trasporto attivo

primario. Utilizza l’ATP in modo indiretto.

- Trasporto attivo primario:

Il movimento dei soluto o degli ioni da un lato della membrana viene accoppiato

direttamente ad una reazione esoergonica, normalmente l'idrolisi dell'ATP.

Le proteine di membrana che fungono da trasportatori sono chiamate pompe, perché

spostano in modo selettivo composti specifici da una massa fluida ad un’altra.

Le proteine di trasporto si trovano nella membrana e vengono attivate dall'ATP, queste

proteine sono dette ATPasi di trasporto o pompe ATPasi.

ATPasi Na /K → membrana plasmatica

+ +

ATPasi del Ca → membrana plasmatica

2+

ATPasi del H o ATPsintetasi → membrana mitocondriale.

+ 25

- La pompa Na /K :

+ +

La pompa Na /K è un trasporto detto antiporto (in direzioni opposte) che sposta tre ioni

+ +

Na fuori dalla cellula e due ioni K dentro. Consuma un terzo delle risorse energetiche di

+ +

una cellula. Il trasporto è accoppiato all'idrolisi di ATP.

Questa pompa lavora contro gradiente di

concentrazione e l'energia usata deriva

dall'idrolisi dell'ATP.

Fuori dalla cellula lo ione sodio è molto più

concentrato rispetto all'interno, al contrario

il potassio è più concentrato dentro alla

cellula, quindi la pompa sodio – potassio

pompa gli ioni sodio verso l’esterno della

cellula e gli ioni potassio verso l’interno

contro i loro gradienti di concentrazione.

Questa pompa è in tutte le nostre cellule, e

serve ad evitare che ci sia un ingresso

eccessivo di acqua nella cellula. Nella

cellula ci sono tante macromolecole e

questo comporterebbe l'ingresso

dell'acqua per osmosi per diluire le

macromolecole però, se questo

accadesse, la cellula esploderebbe. La

pompa sodio potassio serve proprio a

controbilanciare questa tendenza della

cellula a far entrare l'acqua.

( Funzionamento della pompa sodio-

potassio).

- Trasporto attivo secondario: Nel trasporto attivo secondario il

movimento di una sostanza contro il

suo gradiente di concentrazione è

sostenuto dall’energia “recuperata”

tramite il passaggio di ioni attraverso

la membrana secondo il loro

gradiente di concentrazione.

Nel trasporto attivo secondario in

alcuni caso sia lo ione che la

sostanza trasportata si muovono

verso la stessa direzione, in altri casi

si muovono in direzioni opposte.

Un esempio è il trasporto attivo

secondario del glucosio nel lume

intestinale:

il glucosio viene assorbito dalla

cellula intestinale epiteliale

mediante un tipo di trasporto attivo

secondario che non è altro che un

trasporto endoergonico (che

richiede energia) accoppiato ad un trasporto esoergonico; quello esoergonico è il

trasporto dello ione sodio, quello endoergonico è quello del glucosio che in condizioni

normali non potrebbe avvenire. L'energia che la cellula utilizza per poter mandare il

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glucosio dal lume intestinale verso l’interno della cellula del villo intestinale deriva quindi

dal trasporto contemporaneo dello ione sodio dal lume cellulare verso l’interno della

cellula (quello del sodio è un trasporto passivo perché lo ione sodio viene portato dal

lume dove è più concentrato all’interno della cellula dove è meno concentrato). Il sodio

verrà poi eliminato con la poma sodio – potassio per evitare che sia troppo concentrato.

Il glucosio successivamente esce per diffusione facilitata (dalla cellula al flusso ematico) in

quanto all'interno è molto concentrato e all'esterno meno, il passaggio avviene

comunque attraverso una proteina perché la molecola del glucosio è molto grande e

polare.

Disegno riassuntivo

Trasporto vescicolare (endocitosi e esocitosi):

Viene utilizzato per molecole di grandi dimensioni

che all’interno della cellula si trovano sempre

dentro ad una vescicola. Se la molecola entra

nella cellula si parla di endocitosi, se la molecola

esce dalla cellula si parla invece di esocitosi.

La membrana, sia nell’endocitosi che nell’esocitosi

forma delle invaginazioni.

Nell'esocitosi la membrana della vescicola si fonde

con la membrana plasmatica.

Nell'endocitosi la membrana plasmatica si invagina

e forma una vescicola.

- Endocitosi:

L’endocitosi è l’insieme dei processi che portano sostanze all’interno della cellula.

La membrana genera un’invaginazione, ovvero forma una piccola tasca intorno ai

materiali che devono essere introdotti; la tasca diviene sempre più profonda fino a dare

origine ad una vescicola che poi si separa dalla membrana plasmatica.

Vi sono tre tipi di endocitosi:

1. La fagocitosi è un tipo di endocitosi che riguarda

l'internalizzazione di particelle solide di grandi dimensioni o persino

intere cellule.

Questo processo viene svolto solo da alcune cellule, non da tutte.

Ad esempio i globuli bianchi utilizzano la fagocitosi per inglobare

cellule e sostanze di origine estranea, come batteri.

La vescicola che si forma successivamente si fonde con un

lisosoma che ne digerisce il contenuto.

2. Nella pinocitosi si formano vescicole di dimensioni più ridotte per

permettere l'internalizzazione di molecole fluide.

27

3. L'endocitosi mediata da recettori è un processo specifico svolto da tutte le cellule.

Questo processo dipende da recettori: proteine che

riconoscono la molecola che deve essere internalizzata e si

legano ad essa per poi avviare specifiche risposte cellulari.

I recettori sono proteine di membrana localizzate esternamente

in specifiche zone della membrana cellulare dette fossette

rivestite, ovvero piccole depressioni della membrana. Queste

zone internamente sono rivestite da un’altra proteina detta

clatrina. Quindi quando i recettori di una fossetta si legano alle

molecole da internalizzare, la fossetta si invagina fino a portare

alla formazione di una vescicola che presenta esternamente le

clatrine e per questo viene detta “vescicola rivestite da

clatrina” oppure soltanto “vescicola rivestite”.

La vescicola una volta giunta all’interno della cellula perde il rivestimento di clatrina e

può fondersi con un lisosoma che ne digerisce il contenuto. Questo processo viene

utilizzato dalla maggior parte delle cellula per assumere il colesterolo.

- Esocitosi:

è il processo con cui i materiali impacchettati in vescicole vengono secreti dalla cellula.

La vescicola che si forma si fonte con la membrana formando un apertura verso l’esterno

che permette l’uscita del materiali. Successivamente la membrana della vescicola viene

incorporata con la membrana plasmatica. Questo processo è molto importante per la

secrezione di enzimi digestivi, neurotrasmettitori e materiali per costruire la parete cellulare.

- Tutti gli organismi sono costituiti da cellule:

Gli organismi unicellulari sono costituiti da una sola cellula, mentre gli organismi

pluricellulari sono formati da più cellule.

La cellula può essere: procariote (più semplice) o eucariote (più complessa). Nonostante

ciò tutte le cellule hanno in comune tre aspetti fondamentali:

- un citoplasma (corpo della cellula, ambiente acquoso);

- un nucleoide o un nucleo (contenente materiale ereditario: DNA);

- una membrana plasmatica (definisce i confini della cellula).

Gli organismi possono essere classificati secondo due criteri:

Domini (3):

- Archebatteri o Archei: batteri unicellulari procarioti con parete di cellulosa.

- Eubatteri: batteri evoluti con parete di peptidoglicano.

- Eucarioti: protisti, funghi, piante e animali.

Regni (5):

- Monere: (batteri) unicellulari procarioti autotrofi o eterotrofi.

- Protisti: unicellulari eucarioti autotrofi o eterotrofi. Ad esempio ciliati o flagellati.

- Funghi: uni o pluricellulari eucarioti eterotrofi (saprofiti o parassiti).

- Piante: pluricellulari eucarioti autotrofi sessili (non dotati di movimenti propri apparenti).

- Animali: pluricellulari eterotrofi eucarioti con movimenti.

- I procarioti:

- Organismi unicellulari

- Dimensioni da 0,25 x 1.2 μm (micoplasmi, senza parete cellulare) a 1,5x 4 μm

- Hanno nucleoide che contiene DNA

- Membrana plasmatica, citoplasma

- Parete cellulare

- Capsula 28

- Flagello (di solito) per il movimento (anche la cellula eucariotica può averlo)

- Pili

- Plasmidi (pezzi di DNA circolare)

- Ribosomi (anche nelle cellule eucariotiche).

- Gli eucarioti:

Ha una compartimentalizzazione interna ossia ha dei compartimenti chiamati organuli:

- Nucleo (struttura sferica che sta, solitamente (non sempre), al centro e contiene il

materiale genetico)

- Reticolo endoplasmatico (può essere liscio o ruvido)

- Mitocondri

- Apparato di Golgi

- Lisosoma

- Perossisoma

- Parete cellulare:

- Funzione di protezione

- Composta da peptidoglicano (molecola complessa composta da una matrice di

zuccheri legati trasversalmente da peptidi/proteine)

- A seconda della struttura della parete i batteri si dividono in gram positivi e gram

negativi (suscettibilità a penicillina solo gram positivi), questa caratteristica viene

evidenziata con la colorazione di gram: Gram positivi (blu) e Gram negativi (rossi).

Colorazione di gram (procedimento):

1. Si pone nella piastra di coltura un colorante basico idrofilo (in genere cristalvioletto).

2. Passati tre minuti, si opera un lavaggio con liquido di Lugol (una soluzione di iodio e

ioduro di potassio denominata mordenzante perché fissa la prima colorazione), che

reagisce con il colorante basico formando un composto liposolubile, e si lascia agire per

circa un minuto.

3. Il preparato va poi trattato con decolorante (alcol o acetone) per una ventina di

secondi (agisce sui Gram negativi, ma se resta troppo tempo può alterare anche i Gram

positivi).

4. Poi si aggiunge un secondo colorante (fucsina o safranina) che dona un colore rosato

alle cellule che non hanno fissato il primo colorante viola.

5. A questo punto: i batteri Gram positivi avranno trattenuto il colorante basico (viola -

blu), poiché l'alcol non ha danneggiato a sufficienza la spessa parete cellulare (idrofila)

che non permette al colorante (idrofobo) di uscire; mentre i Gram negativi sono di colore

rosato perché l'alcol ha sciolto i lipidi della membrana esterna danneggiando la sottile

parete cellulare che non è più in grado di trattenere il complesso (effetto del mordenzante)

cristal violetto – ioduro (liposolubile – idrofobo).

Nei gram positivi la membrana plasmatica ha una percentuale di peptidoglicano molto

alta. Nei gram negativi vi sono due strati di membrana plasmatica con interposta una

porzione di peptidoglicano che quindi è in quantità minore.

- Archeobatteri:

- Possono essere considerati relitti viventi da qui la denominazione di archeobatteri

(arche = antico).

- Possono vivere in condizioni estreme (come quelle esistite ai primordi) quali le profondità

prive di ossigeno del mar nero (estremofili) e presso sorgenti vulcaniche in ebollizione

29

(Pyrolobus fumarii riesce a vivere a 113°C e non sopravvive a temperature inferiori a 90°C)

oppure in acque estremamente salate (alofili).

- Non presentano il peptidoglicano nella parete che li circonda. I lipidi che costituiscono

la membrana cellulare sono di tipo differente rispetto a quelli presenti nei batteri e

soprattutto i loro RNA e le proteine ribosomiali sono più simili a quelle degli eucarioti e non

a quella dei batteri.

Teoria evolutiva: gli archeobatteri si pensa che abbiano inglobato gli eubatteri e che poi

siano andati a costituire i mitocondri.

- Cianobatteri:

- Hanno strutture membranose simili ai tilacoidi che sono sede di attività fotosintetica

- Possono fissate l'azoto. L'N è un gas inerte.

2 Tutti i batteri sono inseriti nel

nostro organismo, ce ne sono

tante specie.

Microbiota = insieme di tutte

le specie batteriche nel

nostro organismo, sono

fondamentali per il nostro

benessere.

Microbioma = insieme di tutte

le sequenze di geni dei DNA

che hanno i batteri.

Le cellule eucariotiche

A seconda della loro ubicazione e della funzione che svolgono all'interno di un organismo

pluricellulare, le cellule si specializzano fenotipicamente, morfologicamente e

funzionalmente. Tutte le cellule, comunque, hanno lo stesso patrimonio genetico.

In pratica ogni tessuto si troverà ad esprimere solo quei geni che sono necessari a

svolgere le funzioni del tessuto.

Ad esempio, in un neurone difficilmente troverete mRNA per la sintesi di emoglobina e

questo non perchè il DNA sia diverso da quello delle cellule midollari ma perchè c'è una

diversa funzione e specializzazione della cellula.

- Tessuto epiteliale:

Funzione principale: rivestimento

Le cellule possono avere diversa morfologia, a seconda della zona che rivestono.

Dove troviamo il rivestimento epiteliale?

Esterno: la pelle, la cute ha principalmente una funzione protettiva, ed è formata da

diversi strati. 30

Interno: le mucose (rivestono, per esempio, l'apparato gastrointestinale, l'apparato

respiratorio, i vasi sanguigni …)

Non ha soltanto una funzione di rivestimento ma può avere anche una funzione

ghiandolare.

- Epitelio ghiandolare:

Costituisce il parenchima delle ghiandole la cui funzione consiste nella secrezione di

sostanze utili all’organismo:

- Ghiandole esocrine: riversano il loro contenuto in un dotto secretore collegato alle

superfici interne od esterne dell'organismo

- Ghiandole endocrine: riversano il loro contenuto (ormoni) nel sangue.

- Tessuto muscolare:

Funzione principale: movimenti volontari ed involontari del corpo, può essere liscio,

cardiaco o scheletrico.

- Tessuto nervoso: Funzione principale: ricezione, trasmissione ed

elaborazione di stimoli.

Le funzioni sono svolte dai neuroni e, a soste-gno,

nutrimento e protezione dei neuroni inter-vengono

le cellule gliali (che formano anche il rivestimento

mielinico). Il neurone è composto da: corpo

cellulare o soma; nucleo; assone: circondato da

strutture fatte da guaina mielinica; nodo di

Ranvier: punto dove manca la guaina

mielinica.

Le cellule gliali si distinguono in:

- Macroglia: oligodendrociti, cellule di

Schwann (queste costituiscono la guaina

mielinica) e astrociti (funzione trofica:

nutrimento per aiutare l’attività dei neuroni)

- Microglia (difesa immunitaria e capacità

fagocitaria).

Funzione della guaina mielinica:

- Isolamento elettrico dell'assone

- Aumento della velocità di conduzione

- sostegno fisico del neurone

L’impulso salta le guaine e va da un nodo di

Ranvier all’altro. Mediamente si possono

avere 25 avvolgimenti (50 strati di

membrana), ma possono arrivare fino a 160.

- Tessuto connettivo:

Le cellule sono immerse in una matrice extracellulare.

Funzione principale: connessione, nutrimento, strutturale e funzionale di tessuti/organi

In particolare a seconda della dislocazione e de la funzione svolta si distinguono dei sotto-

tipi con specifica morfologia.

Sotto-tipi principali del tessuto connettivo:

- Tessuto osseo

, ci sono le seguenti cellule: osteoblasti (producono la matrice ossea),

osteociti (funzione strutturale), osteoclasti (riassorbimento osseo, solubilizzazione della

matrice).

- Tessuto adiposo: è formato da adipociti che hanno all'interno una goccia di grasso

fatta da trigliceridi.

- Tessuto ematico , cellule circolanti nel flusso sanguigno: piastrine, eritrociti, granulociti,

31

macrofagi e linfociti (T e B), questi si formano da una cellula staminale che poi

successivamente si differenzia nelle varie cellule.

Dal progenitore linfoide

- Linfociti B: producono anticorpi

- Linfociti T: fanno la difesa cellulo-mediata

Dal progenitore mieloide

- Macrofago: può fare la fagocitosi, ha funzione di difesa.

- Granulociti: (globuli bianchi) possono essere basofili, eosinofili e neutrofili.

- Eritrociti: (globuli rossi), non sono vere e proprie cellule perché sono privi di nucleo,

hanno la funzione di trasportare l’ossigeno nell’organismo.

- Piastrine: sono elementi figurativi e derivano dal megacariocita, non sono vere e proprie

cellule e sono coinvolte nella coagulazione del sangue.

Acido desossiribonucleico: DNA

Nelle cellule eucarioti il DNA si trova associato a proteine per formare la cromatina che si

trova può trovare in una forma più rilassata (eucromatina) oppure in una forma più

compatta (eterocromatina). L'eucromatina è trascrizionalmente attiva mentre

l'eterocromatina è trascrizionalmente inattiva.

Il centromero dei cromosomi è sempre sotto forma di eterocromatina.

- Gerarchia strutturale della cromatina:

La cromatina comunque assume una gerarchia strutturale costituita da:

- fibra a collana di perle con diametro di 11nm

- fibra a 30nm

- fibra a 300nm

- fibra a 700nm

- fibra a 1400 nm (cromosoma): assume questa struttura per poter essere racchiuso nel

nucleo. 32 La prima struttura che vediamo è la

doppia elica di diametro pari a 2 nm,

subito dopo la doppia elica vi è

un’altra struttura (che ha diametro 11

nm, diametro circa 5 volte superiore al-

la prima). Dopo vi è un’altra struttura

che assume diametro ancora più

grande (30nm) fino ad arrivare ad un

diametro di 300 nm, seguito da uno a

700 nm ed infine 1400 nm.

Il DNA è un filamento lunghissimo e

quindi, per occupare meno spazio, si

attorciglia fino a formare un “gomitolo”

che ha un diametro molto più grande

rispetto al filo iniziale.

Il DNA deve assumere questa gerarchia

strutturale per riuscire a stare dentro al

nucleo (spazio ristretto).

Ogni molecola di DNA è associata a

molecole proteiche che possono esse-

re istoni oppure proteine non istoniche.

- Fibra a collana di perle con diametro di 11 nm:

Gli istoni insieme al DNA formano questa struttura che sembra una collana di perle in

quanto in questo stadio il DNA è avvolto attorno agli istoni, senza ulteriori ripiegamenti per

circa 2 giri.

L’unità fondamentale (ripetitiva) della collana di perle è quello che viene chiamato

nucleosoma ognuno dei quali contiene una particella core di proteine basiche (dette

istoni), che costituisce il nucleo centrale del nucleosoma, attorno a questo si “arrotola” il

DNA per 1.75 giri.

La particella core è un ottamero di istoni o nucleo istonico ottamerico e contiene due

molecole di ognuno dei seguenti istoni:

- istone H A

2

- istone H B

2

- isotone H 3

- istone H 4

Il nucleo centrale quindi è costituito da 8 tipi di proteine.

Il DNA che si collega tra un nucleosoma e l’altro è detto DNA linker (pezzo di DNA libero

che non è avvolto a formare il gomitolo). In questa zona c’è un altro istone chiamato H ,

1

che serve per fermare il DNA che si attorciglia intorno al nucleo ottamerico.

Un’altra caratteristica che hanno gli istoni è che sono altamente conservati ossia durante

l’evoluzione si sono conservate e la sequenza primaria degli amminoacidi è rimasta quasi

identica. Siccome queste proteine servono per compattare il DNA, e quindi interagiscono

con una struttura conservata, allora anche il DNA è conservato.

33

- Fibra a 30 nm:

La struttura a collana di perle comincia ad avvolgersi a spirale per formare la fibra a 30

nm. La formazione di questa fibra è mediata dall’istone H . Questa fibra mostra una

1

struttura spiralizzata con circa 6 nucleosomi per ogni giro e l’istone H è probabilmente

1

localizzato all’interno. La struttura che si forma prende il nome di solenoide.

La fibra da 30 nm è la struttura di base sia della cromatina interfasica che di quella

mitotica.

- Fibra a 300nm:

La Fibra 300nm è data dalla fibra 30 nm che forma delle anse e si attaccano ad una im-

palcatura centrale che è fatta di proteine non istoniche.

Cromosoma (duplicato): L’ultima struttura è il cromosoma, cromosoma duplicato o

cromosoma mitotico che è composta da due strutture dette

cromatidi ognuna delle quali ha un diametro di 700 nm; la

struttura quindi complessivamente ha un diametro di 1400

nm. Ciascuno dei due cromatidi che costituiscono il cromo-

soma è chiamato cromatide fratello questo perché le

sequenze dei nucleotidi sono identiche e quindi hanno

anche la stessa sequenza di DNA.

Il cromosoma duplicato si forma durante la mitosi.

I cromosomi possono colorarsi intensamente con coloranti

basici, da qui il nome cromosoma:

cromo = colore;

soma = corpo.

L’unico momento in cui si vedono i cromosomi al microsco-

pio ottico è quando raggiungono il diametro massimo (1400nm), il massimo grado di

compattamento. Ecco perché nei libri vengono rappresentati sempre come cromosomi

metafasici. In realtà, dentro ogni cellula, hanno anche struttura singola (visibile al micro-

scopio elettronico). 34

- Classificazione dei cromosomi:

I cromosomi possono essere classificati sulla base della:

- posizione del centromero o costrizione primaria (punto in cui il cromosoma si restringe)

- lunghezza Se la costrizione primaria si trova al cen-

tro, allora si chiama cromosoma meta-

centrico; se la costrizione primaria sta un

po' più verso un polo piuttosto che verso

l’altro, si chiama cromosoma sub-

metacentrico; il cromosoma che ha il

centromero molto spostato verso un

telomero, si chiama cromosoma acrocentrico; se ha il centromero in corrispondenza del

telomero, si chiama cromosoma telocentrico.

- Corredo cromosomico (cariotipo) umano: L’insieme di tutti i cromosomi viene

chiamato cariotipo.

Assetto cromosomico di una cellula

umana (diploide): 23 coppie di

cromosomi omologhi, di cui:

- 22 paia di AUTOSOMI, questi sono

identici nei due sessi

- 1 paio di ETEROCROMOSOMI o

cromosomi sessuali che sono

coinvolti nella determinazione del

sesso (23°); può essere X o Y a

seconda del sesso.

Ogni coppia di cromosomi contiene

un cromosoma di origine materna ed

uno di origine paterna.

I cromosomi sono ordinati io ordine di

grandezza anche se in realtà il più

piccolo è il cromosoma 21 e non il 22.

Le cellule dell’organismo possono avere assetto aploide oppure diploide:

23 cromosomi → assetto aploide

46 cromosomi → assetto diploide

Tutte le cellule nel nostro organismo hanno un assetto diploide da 46 cromosomi (2 serie

da 23), ad eccezione delle cellule della linea germinale (spermatozoi e oocita) che

hanno 23 cromosomi (assetto aploide).

Una cellula che ha un assetto di cromosomi superiore a 46, si chiama poliploide.

- Ogni specie ha un numero specifico di cromosomi:

Non c’è relazione tra numero di cromosomi e complessità dell’organismo, la quantità di

DNA che c’è nella varie specie animali, è diversa.

Anche all’interno dei gruppi c’è varietà di quantità di DNA: per esempio noi appartenenti

al gruppo dei mammiferi, abbiamo tre miliardi di nucleotidi, ma ci sono anche altri mam-

miferi che ne hanno meno.

Paradosso del valore C (quantità di DNA): le piante ne hanno più di noi.

35

Il DNA è il depositario dell’informazione genetica:

La trascrizione del DNA in RNA messaggero –

mRNA- (ci sono altri geni che servono a fare altri

tipi di RNA) e la traduzione da mRNA a protei-

dogma centrale della biologia.

na, si chiama

Ci sono però delle eccezioni: i retrovirus che

hanno genoma a RNA e quindi possono passa-

re da RNA a DNA (operazione inversa) tramite

la trascrittasi inversa.

Il motivo per cui il retrovirus deve convertire

l’RNA in DNA è dato dal fatto che il retrovirus

deve infettare la cellula che possiede e quindi

integrarsi al suo DNA.

Genoma umano

(3 miliardi di nucleotidi)

DNA genico DNA extra genico

(circa 35%, codificante circa 3%) (circa 65%)

A singola copia Ripetitivo

- Regioni di controllo

- Geni per mRNA (messaggero) In tandem Disperso

- Geni per rRNA (ribosomiale) SINE

satellite

- Geni per tRNA (transfer) LINE

minisatellite

- Geni per altri tipi di RNA elementi LRT

microsatellite

- Pseudogeni (inattivi) trasposoni

Percentuali dei geni sul genoma totale:

- Homo sapiens → 3%

- Ameba → 0,1%

- Lievito del pane → 70%

- Escherichia Coli → 85% (perché nei batteri i geni sono molto vicini tra loro)

La trascrizione:

E’ il processo in cui la sequenza nucleotidica del DNA (gene), che porta l’informazione

per una funzione, viene trascritta in una sequenza nucleotidica di RNA.

La sequenza di RNA è complementare alla sequenza del DNA stampo.

Lo scopo della trascrizione è di creare un polimero di nucleotidi legati con legame

fosfodiesterico.

- RNA polimerasi (enzima che polimerizza i nucleotidi):

L’RNA polimerasi sintetizza il filamento di RNA a partire da uno stampo di DNA.

La sintesi avviene in direzione 5’ → 3’, ciò significa che la sintesi avviene attaccando il

gruppo fosfato presente in 5’ del nucleotide substrato alla posizione 3’ della catena di

RNA nascente.

I substrati sono i nucleotidi trifosfati.

Per formare il legame fosfodiesterico tra i due nucleotidi serve molta energia che viene

fornita dall’idrolisi del legame tra l’α e il β fosfato, vengono quindi allontanati i due gruppi

fosfato β e γ (rimangono attaccati tra loro) che formano il pirofosfato.

- La trascrizione nei procarioti:

• RNA polimerasi procariotica:

L’RNA polimerasi procariotica è un enzima che ha un cuore centrale fatto da due

subunità e 2 subunità β. Queste 4 subunità costituiscono quello che viene chiamato

α

apoenzima (= è il nucleo centrale, molto stabile).

L’apoenzima può formare la struttura può arrivare anche alla quaternaria perché ogni

36

subunità è una sequenza amminoacidica (è una proteina).

L’apo-enzima può interagire con un’altra subunità, chiamata per

formare l’holoenzima. E’ nella globalità un complesso proteico ad alto peso atomico:

480000 D costituito da 5 subunità: due due β, e una

α,

Il fattore sigma serve per tenere la struttura attaccata al promotore.

Il nucleo enzimatico ha la capacità di sintetizzare RNA su uno stampo di DNA, ma non è in

grado di iniziare la trascrizione al sito corretto. Il fattore sigma ha una funzione ben

precisa: è responsabile del corretto riconoscimento del promotore e viene rilasciato non

appena inizia la trascrizione.

Il filamento di DNA che viene copiato, si chiama “filamento senso”. L’mRNA che si forma

avrà una sequenza nucleotidica opposta e viene detto filamento antisenso.

Prendendo come punto di riferimento il sito di inizio trascrizione (+1), intendiamo con

promotore prossimale quello più vicino alla zona +1, e con promotore distale quello più

lontano dalla zona +1, nei batteri il promotore distale non è molto evidente perché il

genoma è piccolo.

I tre momenti base della trascrizione: 1) Inizio: denaturazione locale del DNA e

inizio della polimerazione nucleotidica a

partire dalla posizione +1. La denaturazione è

momentanea per il passaggio dell’RNA, poi si

riforma la doppia elica.

2) Allungamento: si ha l’allungamento della

catena; la velocità non è costante perché

l’RNA polimerasi non procede alla stessa

velocità lungo tutto il tratto che sta

copiando, ma va incontro a pause in

corrispondenza di zone ricche di Guanina e

Citosina poiché vi sono 3 legami ad idrogeno

e quindi per “aprire” il DNA impiega più

tempo. L’RNA polimerasi legge il filamento in

direzione 3’ → 5’ ed addiziona i nuovi

nucleotidi sull’estremo 3’ del filamento in

crescita, quindi il primo nucleotide forma

l’estremità 5’ del nuovo filamento di RNA. La

RNA polimerasi addiziona nuovi nucleotidi al

trascritto di RNA in crescita mediante

l’appaiamento complementare con le basi del filamento di stampo del DNA.

3) Terminazione: la sintesi è finita. Vi sono due modalità:

- Terminazione rho-indipendente: in corrispondenza del sito di terminazione ci sono

sequenze palindromiche ricche di Guanina e Citosina. Si crea una struttura del DNA detta

ansa a forcina che è il segnale di distacco dell’RNA polimerasi perché si viene a formare

una struttura stabile.

Sequenze palindromiche: presenza di sequenze di terminazione (palindromiche), trascritte

lentamente e formano strutture a stelo. 37

- Terminazione rho-dipendente: è chiamata così perché dipende da una proteina che si

chiama Rho (proteina di circa 50000 Dalton). La proteina, approfittando dei rallentamenti

dell’RNA polimerasi lo raggiunge e in prossimità dell’ansa o loop (non è ricco di G e C)

permette il distacco dell’RNA nascente (si formano strutture a forcina poco stabili).

L'mRNA si dice monocistronico quando porta l'informazione per un solo gene, ed è una

caratteristica tipica degli eucarioti mentre nei procarioti l'mRNA è spesso policistronico e

cioè che porta l'informazione per più geni ed è prevista la formazione di proteine diverse.

- La trascrizione negli eucarioti:

• RNA polimerasi:

Negli eucarioti esistono tre RNA polimerasi:

- RNA pol I trascrive rRNA (ribosomiale) è la più abbondante;

- RNA pol II trascrive mRNA (messaggero);

- RNA pol III trascrive tRNA (transfer), 5S, rRNA e altri piccoli RNA.

Altri piccoli RNA (small RNA)

Sono suddivisi in:

- sRNA nucleari → snRNA – RNA polimerasi II e III (sRNA nucleari ovvero snRNA, che sono

codificati dall’RNA polimerasi due e tre).

- sRNA nucleolari → snoRNA – RNA polimerasi II

- sRNA citoplasmatici → (scRNA) – RNA polimerasi III di solito sono associati a proteine, nel

nucleo costituiscono le snRNP (small nuclear ribonucleoprotein particles) ovvero le

ribonucleoproteine.

- microRNA (piccolissimi; 18-25 nucleotidi) – RNA polimerasi II.

- Confronto tra RNA-polimerasi dei procarioti e degli eucarioti:

Le RNA polimerasi degli eucarioti hanno una struttura molto più complessa degli RNA

polimerasi dei procarioti.

Nella subunità L’ della polimerasi II negli eucarioti vi è un dominio CTD (l’estremità di una

sequenza di amminoacidi che termina con un gruppo carbossilico) molto importante

perché coinvolta nella trascrizione del DNA, nel capping della trascrizione dell’RNA e

nell’attaccamento alla spliceosoma per splicing dell’RNA.

- Confronto tra promotore procariotico e eucariotico:

La differenza principale è che negli

eucarioti sono presenti esoni ed introni.

Esoni (rosa) → danno origine alla

proteina.

Introni (azzurri) → vengono trascritti ma

non servono a fare la proteina.

Promotore (arancio) → zona dove si

attacca la RNA polimerasi. Può essere

prossimale o distale e può contenere

l’enhancers.

Enhancers (azzurro) → importante per

aumentare l'efficienza della

trascrizione, non c'è nei procarioti.

Una zona vicino agli esoni è il

promotore prossimale.

Il promotore prossimale negli eucarioti ha delle sequenze caratteristiche:

- Vicino allo start point (+1) vi è una zona chiamata TATA box, ricca di timine e adenine

- più a monte della TATA box vi sono GC box, CAAT box ed altri.

I loro nomi prendono ispirazione dai nucleotidi presenti e le loro posizioni possono variare a

sono comunque vicini allo start point (+1). 38

I geni non devono aver per forza lo stesso numero di esoni e introni, cosi come gli esoni e

gli introni non devono avere lo stesso numero di nucleotidi.

Un’altra sequenza importante è la sequenza iniziatrice (inr) che non è sempre presente e

se c’è è a ridosso dello start point.

- Fattori di trascrizione:

L’RNA polimerasi eucariotica non è capace di riconoscere da sola il proprio promotore, è

necessaria quindi la presenza di proteine specifiche, chiamate fattori generali di

trascrizione che permettono l’inizio della trascrizione.

I fattori di trascrizione sono proteine necessarie per l’inizio della trascrizione, ma che non

fanno parte della struttura dell'RNA polimerasi.

Si distinguono in:

- Fattori di trascrizione basali o generici: riconoscono il promotore e gli elementi di inizio

(TATA box, Inr) e le regioni più prossimali. Si attaccano al promotore prossimale e servono

ad avviare la trascrizione.

- Fattori di trascrizione specifici: riconoscono le regioni prossimali e distali di geni specifici;

sono in genere tessuto – specifici o comunque soggetti a regolazione. Questi fattori si

attaccano agli enhancer e aumentano l'efficienza della trascrizione.

- Inizio della trascrizione:

L’inizio richiede un promotore, cioè una speciale sequenza del DNA sulla quale si lega

molto strettamente l’RNA polimerasi. Per ogni gene c’è almeno un promotore.

I promotori sono importanti sequenze di controllo che dicono all’RNA polimerasi tre cose:

da dove far partire la trascrizione;

quale filamento di DNA trascrivere; in quale direzione procedere. Ogni promotore

contiene un sito di inizio della trascrizione, a partire dal quale il processo incomincia.

1. Si lega alla TATA box un complesso di proteine che

formano quello che viene chiamato fattore di

trascrizione II (secondo) D (TFIID). È formato da una

proteina di grandi dimensioni (TBP → TATA binding

protein) che si attacca alla TATA box, ed altre più

piccole che si attaccano alla proteina più grossa dette:

proteine accessorie.

2. Si attaccano altri due fattori di trascrizione (A e B)

che prendono contatto con il DNA e con il TFIID. L'RNA

polimerasi è portata, al livello del promotore, dal fattore

TFIIF. Tutti i fattori permettono alla RNA polimerasi di

rimanere attaccata. Dopo arrivano altri fattori che si

chiamano H e J che attivano l'RNA polimerasi

attaccandogli a livello del CTD (dominio) dei gruppi

fosfato. Avviene una fosforilazione a livello del CTD

della subunità L1 che segna l'inizio della trascrizione.

In tutto il complesso comprende circa 80 proteine ed

ha una massa di 3 MDa. Il complesso che si forma è

detto complesso di inizio della trascrizione.

Inserire in una proteina dei gruppi fosfato (cariche

negative) vuol dire alterargli l’equilibrio; attivare la

proteina significa cambiargli al struttura.

La fase di allungamento è del tutto simile a quella dei

procarioti ed avviene in direzione

5' → 3'. Non sono state individuate sequenze specifiche

che indichino la fine della trascrizione negli eucarioti.

Per la RNA-pol II si è osservato che la terminazione avviene circa 1000 nt a valle della

sequenza consenso 5'-AAUAAA-3'. 39

Funzionamento degli enhancer: gli enhancer legano proteine regolatrici che incrementano

l'efficienza della trascrizione fino a 100

volte: si va a formare un'ansa del DNA

che serve per avvicinare gli enhancers

in corrispondenza del complesso di

inizio cosicché possano prendere

contatto. Più l'Enhancer è distante più il

sistema è efficiente perché si forma

l’ansa con più facilità. Vi sono inoltre

delle proteine dette repressori che si

attaccano a sequenze dette silencer.

Agli enhancer si attaccano gli

attivatori.

- Maturazione RNA:

Serve a produrre, nelle cellule eucariotiche, un mRNA pronto ad essere tradotto.

L'RNA appena prodotto e ancora non maturato viene detto trascritto primario oppure

pre – mRNA.

Il trascritto primario di un gene eucariotico viene modificato: gli introni vengono rimossi, ed

entrambe le estremità del pre-mRNA subiscono modificazioni chimiche. Entrambe queste

modificazioni avvengono nel nucleo.

Processi che aumentano la stabilità dell'mRNA:

Prima dello splicing il pre-mRNA va incontro a passaggi di maturazione che coinvolgono

ciascuna estremità della sua molecola:

- Capping al 5'

- Aggiunta di una coda di PoliA al 3'

Processi di rimozione di sequenze non codificanti (introni, non portano informazione per la

sequenza proteina):

- Splicing

- Editing Differenze tra procarioti ed eucarioti nell’espressione genica

Caratteristiche Procarioti Eucarioti

Avvengono Prima ha luogo la trascrizione

Modalità dei processi di simultaneamente nel nel nucleo, poi avviene la

trascrizione e traduzione citoplasma traduzione nel citoplasma

Le regioni trascritte sono

Le regioni trascritte non

Struttura dei geni spesso interrotte da introni

sono interrotte da introni non codificanti

Modificazione dell’mRNA Eliminazione degli introni;

dopo al trascrizione iniziale Nessuna addizione del cappuccio in 5’

ma prima della traduzione e della coda di poliA in 3’.

40

- Cap (cappuccio) al 5': E' l'aggiunta all'estremità 5'

dell'mRNA che viene

trascritto di una guanosina

metilata trifosfato (GTP), tale

guanosina viene aggiunta

però mediante un legame

5' – 5'. Serve a rendere

l'mRNA più resistente

all'attacco delle nucleasi e a farlo riconoscere come un mRNA

da tradurre (renderlo più stabile e permettere la traduzione

dell'mRNA in proteina). Deve essere reso più resistete perché

dentro alla cellula ci sono degli enzimi RNAasi che degradano

l'RNA e questo cappuc- cio lo protegge dalla loro attività di

degradazione. Il cappuccio viene attaccato mentre l'RNA è in

fase di sintesi (all'estremità 5') ed è costituito dall'aggiunta di una

7 – metilgua- nina, che forma un legame 5' → 5' e di solito si ha

la metilazione delle prime due basi dell'mRNA (→). Il Cap è

attaccato all’RNA con tre gruppi fosfato.

Coda di PoliA:

Consiste nell'aggiunta all'estremità 3' di una coda di A (adenine) di lunghezza variabile (50

– 250 nucleotidi). L’aggiunta di tale sequenza è detta poliadenilazione e avviene al

termine della trascrizione. La coda viene aggiunta dalla Poli (A) polimerasi (enzima) che

riconosce uno specifico segnale dell'mRNA (sequenza nucleotidica dell’RNA in

corrispondenza dell’estremità 3’), taglia l'mRNA a valle di tale segnale e attacca la coda

di poliA. L’enzima aggiunge circa 200 residui di adenina all’estremità 3’ libera dell’mRNA

- Funzione: La sequenza di nucleotidi adeninici facilita l’esportazione dell’mRNA fuori dal

nucleo e contribuisce alla stabilità della molecola, inoltre la coda protegge l'mRNA

dall'attacco delle nucleasi (termine generale per altri enzimi che degradano l’RNA o DNA).

- Splicing:

Mentre la regione di un gene procariotico è di solito continua, quella di un gene

eucariotico può contenere sequenze non codificanti, dette introni che interrompono la

regione codificante. Le regioni trascritte, sono dette esoni. Nel trascritto primario

dell’mRNA, detto pre – mRNA, compaiono sia gli esoni che gli introni, ma al momento in

cui l’mRNA maturo lascio il nucleo, gli introni sono stati eliminati.

Queste sequenze vengono rimosse prima che l'RNA passi nel citoplasma (splicing).

Lo splicing rimuove quindi gli introni (non codificanti) perché se ciò non avvenisse

41

risulterebbe una proteina anomala e non funzionante. Lo splicing deve inoltre

congiungere gli esoni.

ed avviene mediante l'utilizzo di particolari proteine ed RNA (ribonucleoproteine) che

riconoscono i siti di taglio. Dettaglio del cappio e della reazione di

transesterificazione:

Il gruppo fosfato sull'esone 1 si attacca all'OH che

si trova in posizione 2' di un nucleotide che è

un'adenina e che si trova nell'introne. L'adenina

viene chiamata punto di ramificazione.

Il gruppo fosfato quindi si stacca dall’esone 1 e

l’estremità libera a questo punto può attaccarsi

all’esone 2.

Questa reazione è molto importante perché il

taglio per rimuovere l'introne deve essere preciso,

non devono rimanere parti di nuceotidi, quindi le

sequenze nucleotidiche dell'introne sono sempre

le stesse in corrispondenza del confine questa

sequenza viene chiamata sito donatore mentre il

sito accettore è alla fine dell'introne.

Anche l’adenina è molto conservata e senza di

essa il meccanismo non avviene.

Per far avvenire lo splicing intervengono delle

ribonucleoproteine ossia proteine formate da una

parte proteica e da RNA e sono coloro che

riconoscono il sito donatore, il sito accettore e il

punto di ramificazione per permettere lo splicing (il taglio preciso).

Per riconoscere le basi hanno bisogno di acidi nucleici cosicché, attraverso la

complementarità delle basi, possano sapere dove tagliare.

Il meccanismo dello splicing:

L’RNA contenuto in una delle ribonucleoproteine

ha una sequenza di basi complementare alla sito

accettore che si trova nella giunzione esone –

introne in 5’. Un’altra ribonucleoproteina si lega al

pre – mRNA vicino alla giunzione esone – introne

in 3’. Altre proteine si aggregano e si forma così lo

spliceosoma (sito costituito da molecole

ribonucleoproteine).

Tra l’esone al 5’ e l’introne si produce un taglio

Dopo il primo taglio all’estremo 5’, l’introne forma

un’ansa chiusa simile ad un cappio.

Il gruppo 3’ – OH libero all’estremità dell’esone tagliato reagisce col fosfato in 5’ dell’altro

esone. L’esone in 3’ viene tagliato e unito all’esone in 5’; l’mRNA maturo viene esportato

per essere tradotto dopo aver legato varie proteine, per cui si forma un complesso

RNA – proteine.

Splicing anternativo: meccanismo che permette di generare da un gene più trascritti

(vari tipi di mRNA).

C’è la possibilità che durante la maturazione alcuni esoni vengano eliminati. Da RNA con

esoni mancanti si possono formare proteine strutturalmente diverse da quelle che si

dovrebbero formare, ma non sempre. Solitamente le proteine generate mantengono la

stessa funzione delle proteine “normali”. 42 Es: tropomiosina → proteina che lega

l’actina (coinvolta nella contrazione

muscolare) e fa parte delle proteine del

citoscheletro delle cellule non muscolari.

Questo processo è molto importante

perché dato che il 3% del nostro genoma

è costituito dai geni noi dovremmo

produrre 30000 proteine, ma grazie a

questo meccanismo si possono produrre

molte più proteine.

- Maturazione degli RNA nei batteri:

- Negli Archeobatteri e Cianobatteri sono state trovate anche sequenze introniche con

capacità enzimatica di autoeliminarsi dal precursore (autosplicing);

- Alcune basi vengono metilate;

- In alcuni casi viene aggiunta una piccola coda poliA come negli eucarioti.

Trascrizione e traduzione avvengono contemporaneamente e nel solito luogo (nel

citoplasma).

Eucarioti: gli mRNA maturi, provvisti di cap al 5’, coda di Poli(A) e privi degli introni,

vengono esportati dal nucleo nel citoplasma. Nel citoplasma avviene la traduzione, ovvero

il processo di sintesi delle proteina a partire dai codoni specificati nella sequenza di mRNA.

In tutti gli RNA eucariotici sono presenti:

- 5’ UTR: regione non tradotta e non codificante;

- 3’UTR: regione non tradotta.

Traduzione:

Nei procarioti, mancando il nucleo, spesso i ribosomi si legano ad un mRNA mentre que-

sto è ancora in fase di trascrizione nel citoplasma cellulare e quindi i due processi di tra-

scrizione e traduzione sono accoppiati.

Negli eucarioti, l’involucro nucleare separa i comparti cellulari in cui avvengono la produ-

zione e la traduzione dell’mRNA: quest’ultima avviene sui ribosomi nel citoplasma.

Per fare una proteina occorrono:

- mRNA

- tRNA attivato, cioè che trasporta uno specifico amminoacido: amminoacil tRNA

- ribosomi 43

Codice genetico:

Essendo l’mRNA costituito dai nucleotidi e la proteina da amminoacidi è necessario in

linguaggio che traduca l’mRNA in un altro linguaggio per poter passare da nucleotidi a

proteine. Questo è permesso dal codice genetico (CG).

L’informazione genetica portata da una molecola di mRNA risiede in una serie di “parole”

di tre lettere disposte in sequenza e non sovrapposte, dette codoni. Ogni sequenza di tre

basi specifica un particolare

amminoacido. Ogni codone

dell’mRNA è complementare alla

corrispondente tripletta di basi nel

DNA da cui è stato trascritto.

Esistono 20 amminoacidi e 4

nucleotidi.

1 nucleotide → 1 amminoacido NO

(solo 4 amminoacidi, non sono

sufficienti)

2 nucleotidi → 1 amminoacido (4 )

2

NO (solo 16 amminoacidi non sono

sufficienti)

3 nucleotidi → 1 amminoacido (4 ) SI,

3

64 amminoacidi, più che sufficienti.

Proprietà del codice genetico:

1. È costituito da triplette nucleotidiche (codoni)

2. È continuo, cioè nessun nucleotide viene saltato

3. Non è sovrapposto o embricato, cioè l’mRNA viene letto in triplette successive

(eccezioni: organismi con DNA piccoli es. batteriofagi)

4. È degenerato: codoni sinonimi (tranne metionina e triptofano)

5. Ha dei segnali di inizio e di terminazione che sono chiamati codoni di inizio e di stop

6. È universale (eccezioni: mitocondri)

1 e 2) Il codice genetico è fatto di triplette nucleotidiche dette codoni ed è continuo (non

viene saltato nessun nucleotide)

Ogni tripletta di basi azotate del DNA corrisponde ad una tripletta complementare

dell’mRNA, cioè a un’unità di codice, o codone e, a sua volta, questo specifica un

determinato amminoacido. È continuo perché un codone segue l’altro.

3) Non è sovrapposto. A ciascuna tripletta corrisponderà un amminoacido.

AUU GAG GAU SI

1 2 3

AUU GAG GAU NO

4) Il codice genetico è degenerato ma non ambiguo, le 64 triplette ottenute dalle diverse

combinazioni fanno si che alcuni amminoacidi siano codificati da due o più triplette

diverse, per questo si dice che il codice genetico è degenerato. Triptofano (UGG) e

Metionina (AUG) sono gli unici che sono codificati da una sola tripletta.

Tuttavia il codice genetico non è ambiguo perché un dato codone può specificare un

solo amminoacido.

5) Ha dei segnali di inizio e di terminazione:

- AUG: codone di inizio.

- UAA; UAG; UGA: codoni di stop. Non codificano per nessun amminoacido.

44

4) Il codice genetico è (quasi) universale, tutte le specie viventi sul nostro pianeta

condividono lo stesso codice genetico. Vi sono alcune eccezioni nei mitocondri e nei

cloroplasti, tuttavia il significato di queste differenze non è ancora chiaro, quello che è

chiaro è che le eccezioni sono davvero poche.

- La traduzione del codice genetico è mediata dai tRNA e dai ribosomi:

La traduzione dell’mRNA in proteine richiede una molecola che faccia da intermediario

tra l’informazione contenuta in ogni codone dell’mRNA e uno specifico amminoacido.

Questa funzione è svolta da un insieme di RNA transfer. Devono avvenire due eventi:

- ogni diverso codone dell’mRNA deve essere letto correttamente da uno specifico tRNA.

- Il tRNA deve trasportare l’amminoacido che corrisponde allo specifico codone dell’mRNA.

Gli RNA transfer trasportano amminoacidi specifici e si legano a specifici codoni

Esiste una molecola di tRNA specifica per ognuno dei 20 amminoacidi. Ogni tRNA svolge

tre funzioni:

- I tRNA si legano ad amminoacidi specifici. Ogni tRNA si lega ad uno specifico enzima

che “carica” sul tRNA uno solo dei 20 amminoacidi possibili all’estremo 3’ del tRNA.

- I tRNA si legano all’mRNA. Circa a metà della catena polinucleotidica che costituisce il

tRNA si trova una tripletta detta anticodone, complementare al codone dell’mRNA che

specifica il particolare amminoacido portato da quel tRNA. Il codone e l’anticodone si

uniscono mediante legami idrogeno, non covalenti.

- I tRNA interagiscono con i ribosomi. Sulla sua superficie il ribosoma ha vari siti che si adat-

tano alla struttura tridimensionale del tRNA. L’interazione tra il ribosoma e il tRNA non è

covalente.

Il tRNA attivato (amminoacil-tRNA):

L’amminoacil-tRNA ha una struttura a trifoglio, l’amminoacido è attaccato al tRNA

mediante il suo gruppo carbossilico all’estremità 3’, e quindi all’ossidrile dello zucchero del

nucleotide. L’aminoacil-tRNA trasporta l’amminoacido corrispondente al proprio

anticodone. L’anticodone è complementare al codone dell’mRNA.

La parte verde nel disegno

rappresenta la tripletta ACC che

è sempre uguale in tutti i tRNA.

La parte gialla nel disegno è il

sito he viene riconosciuto da un

enzima specifico che vi carica il

giusto amminoacido.

La parte blu nel disegno è

l’anticodone.

Infine la parte rossa nel disegno

è quella che serve per prendere

contatto con il ribosoma.

Il caricamento di ciascun tRNA con l’amminoacido corretto è mediato da una famiglia di

enzimi noti col nome si amminoacil – tRNA sintetasi, ognuno di questi enzimi è specifico

per un amminoacido e per il tRNA corrispondente.

45

- Formazione dell’aminoacil – tRNA e attacco dell’amminoacido: fase ATP dipendente

L’enzima amminoacil – tRNA

sintetasi utilizza energia per

caricare l’amminoacido al tRNA.

Le cellule contengono una

aminoacil – tRNA sintetasi per

ciascun amminoacido da

caricare sullo specifico tRNA.

A seconda dell’anticodone

ciascun tRNA viene caricato con

uno specifico amminoacido.

La reazione sfrutta l’ATP per for-

mare un legame ad alta energia

tra l’amminoacido e il tRNA;

l’energia di questo legame viene

poi usata per la formazione dei

legami peptidici tra gli ammi-

noacidi della catena polipepti-

dica i crescita. Si viene a formare

il tRNA arrivato (amminoacil-

tRNA).

- I ribosomi: Il ribosoma è fatto di 2 subunità: una

piccola (subunità minore) ed una

grande (subunità maggiore), sia che

si parli di eucarioti che di procarioti.

Ha un peso molecolare elevato, in

quello procariotico 2.500.000D, in

quello eucariotico 4.500.000D.

Negli eucarioti, la subunità grande del

ribosoma consiste di 3 differenti RNA

ribosomiali (rRNA) e di circa 49

proteine. La subunità piccola consiste

di una molecola di rRNA e di circa 33

proteine. Le due subunità e altre

dozzine di molecole si uniscono

tramite interazioni non covalenti.

Quando non è attivamente impegnato nella traduzione dell’mRNA, il ribosoma si trova

nella forma delle due subunità separate. Nella subunità grande vi sono 3 siti su cui si può

legare un tRNA: i siti A, P ed E il tRNA caricato passa attraverso i 3 siti nell’ordine appena

descritto:

• Il sito A (da amminoacido) è quello in cui l’anticodone del tRNA caricato si lega ad un

particolare codone nell’mRNA, poizionando in questo modo l’amminoacido corretto da

inserire nella catena polipeptidica in crescita.

• Il sito P (da polipeptide) è il sito in cui il tRNA addiziona il suo amminoacido alla catena

polipeptidica.

• Il sito E (da exit, uscita) è il sito in cui risiede il tRNA, ormai scaricato del suo amminoacido

prima di essere rilasciato dal ribosoma e fare ritorno nel citoplasma. Una volta tornato nel

citoplasma può caricarsi di un altro amminoacido e il processo ricomincia.

La funzione del ribosoma è in pratica quella di fare in modo che un tRNA che porta

l’anticodone corrispondente ed è caricato del suo amminoacido si leghi sul codone

appropriato dell’mRNA. Fra le coppie di basi si formano legami a idrogeno.

46

Differenze tra ribosomi eucariotici e procariotici:

L’RNA contenuto nei ribosomi è detto RNA ribosomiale rRNA.

I geni per gli rRNA sono ripetuti in più copie (in tandem): nell’uomo i geni per gli RNA sono

nei cromosomi 13, 14, 15, 21 e 22 (ci sono circa 280 copie). Ciascuno contiene dei tratti

utili per l’RNA ribosomiale e altri non che verranno eliminati in quanto non servono.

I geni per rRNA 5S sono ripetuti in tandem sul cromosoma 1 (circa 2000 copie).

Si necessitano più copie identiche perché le proteine sono alla base di tutte le funzioni

cellulari e questo permette di produrne di più in minor tempo. Questi geni servono anche

per produrre gli istoni, proteine che servono per formare la cromatina.

Esistono vari tipi di RNA ribosomiale (vedi sopra), uno di questi in particolare catalizza la

formazione del legame peptidico tra gli amminoacidi e quindi è importante per la

formazione del polipeptide.

Formazione del legame peptidico ad opera della peptidil transferasi sul ribosoma:

Il centro peptidil – transferasico è la subunità maggiore del ribosoma. In questa

operazione intervengono gli rRNA 5S e 23S che catalizzano il legame peptidico. Quando il

legame peptidico si forma il gruppo carbossilico del primo amminoacido e il gruppo

amminico del secondo si devono legare con la perdita di una molecola di acqua.

L’amminoacido è legato al tRNA tramite gruppo carbossilico. Quando si forma il legame

peptidico, questo gruppo carbossilico si deve staccare dal tRNA perché forma il legame

peptidico con il secondo amminoacido, che ha il gruppo amminico libero e quindi può

formare il legame peptidico, però a sua volta ha il gruppo carbossilico che lo tiene

attaccato al tRNA

Il primo amminoacido di una proteina sintetizzata è sempre la metionina (nei batteri la

fenil metionina → fMET), perché la tripletta d’inizio è AUG che codifica per questa proteina.

- Le fasi della traduzione:

Fase GTP – dipendente: sono processi che comunque richiedono energia ma, questa

volta, il nucleotide usato non è più l’ATP ma il GTP.

Le fasi della traduzione sono sempre tre: inizio, allungamento e terminazione.

47

1 – Fase di inizio: La traduzione dell’mRNA

incomincia con la formazione di

un complesso di inizio costituito da

un tRNA caricato con

l’amminoacido destinato a essere il

primo della catena polipeptidica e

da una subunità ribosomiale

minore, entrambi legati all’mRNA.

Per prima cosa l’rRNA della

subunità ribosomiale minore si lega

a un sito di legame complementare

lungo l’mRNA, situato «a monte»

(verso l’estremità 5') del codone

che dà effettivamente inizio alla

traduzione.

Il codone di inizio nell’mRNA, nel

linguaggio del codice genetico, è

AUG Per complementarietà delle

basi, l’anticodone di un tRNA

caricato con metionina si lega a

questo codone di inizio e con ciò si

completa il complesso di inizio. Perciò il primo amminoacido di una catena polipeptidica

è sempre la metionina, anche se non tutte le proteine mature portano questo

amminoacido come N-terminale; in molti casi, dopo la traduzione la metionina iniziale

viene rimossa da un enzima.

Dopo che il tRNA caricato con metionina si è legato all’mRNA, la subunità maggiore del

ribosoma si unisce al complesso. A questo punto il tRNA caricato con metionina scorre nel

sito P del ribosoma, mentre il sito A si allinea al secondo codone dell’mRNA.

Queste componenti (mRNA, due subunità ribosomiali e tRNA caricato con la metionina)

sono tenute insieme correttamente da un gruppo di proteine dette fattori proteici d’inizio

(IF). I fattori 1F e 3F si legano alla subunità minore del ribosoma e permettono alla subunità

di prendere contatto con l’mRNA. Il fattore 2F si lega al tRNA che trasporta la fMET e ne

permette l’interazione con il codone d’inizio. L’allontanamento degli 1F (idrolisi del GTP)

favorisce l’assemblaggio della subunità maggiore a quella minore per formare tutti e tre i

siti (A, P, E). L’individuazione del codone di inizio (AUG) è permessa dall’interazione della

subunità minore dell’rRNA 16S con una sequenza che precede AUG, detta sequenza di

Shine – Dalgarno attraverso dei legami ad idrogeno.

Nei batteri infatti i veri codoni di inizio AUG sono preceduti da una particolare sequenza

detta Shine – Dalgrano.

2 – Fase di allungamento:

L’allungamento procede così: nel sito A della subunità ribosomiale maggiore rimasto libe-

ro entra adesso il tRNA carico, il cui codone è complementare al secondo codone

dell’mRNA. Quindi la subunità maggiore catalizza due reazioni:

- Rompe il legame fra il tRNA nel sito P e il suo amminoacido;

- Catalizza la formazione di un legame peptidico fra questo amminoacido e quello at-

taccato al tRNA situato nel sito A. Ora il secondo amminoacido è legato alla metionina,

ma è ancora attaccato al proprio tRNA posto nel sito A.

Si dice che la subunità grande sia fornita di attività peptidil – transferasica.

La componente dotata di questa attività è uno degli rRNA, che per questo motivo può

essere considerato un ribozima. 48 La metionina diventa quindi il terminale

amminico (N) della nuova proteina (il

polipeptide cresce dal terminale

amminico verso quello carbossilico). A

questo punto il secondo amminoacido

è legato alla metionina, ma rimane

attaccato anche al suo tRNA nel sito A.

Dopo aver consegnato la propria

metionina, il primo tRNA si sposta nel

sito E per poi dissociarsi dal ribosoma e

fare ritorno al citosol, dove si carica di

nuovo con un’altra metionina.

Il secondo tRNA, che ora porta un

dipeptide (una catena di due

amminoacidi) slitta nel sito P quando il

ribosoma si sposta di un codone lungo

l’mRNA in direzione 5'→3'.

Questi passaggi vengono ripetuti più e

più volte e la catena polipeptidica man

mano di allunga.

Tutte queste tappe si svolgono con la

partecipazione di proteine dette fattori

di allungamento: EF – Tu ; EF – Ts; EF – G.

1. I due fattori EF – Tu e EF – Ts sono

associati tra loro. EF – Tu è inattivo

perché attaccato a EF – Ts con legato

a se GDP.

2. EF – Ts sostituisce il GDP con il GTP e

quindi EF – Tu si attiva.

3. Formazione del complesso ternario

(EF – Tu porta l’amminacil – tRNA nel sito

A)

4. EF – G permette la traslocazione del

ribosoma per smascherare un nuovo

sito accettore ed accogliere quindi

nuovamente un amminoacil – tRNA.

3 – Fase di terminazione:

La sintesi va avanti e si arriva al punto in cui in corrispondenza dell’mRNA c’è una tripletta

di stop che non codifica per nessun amminoacido, quindi nessun tRNA ha una tripletta

complementare. Nel sito A vengono inseriti i fattore di rilascio e il ribosoma si dissocia

dall’mRNA. In corrispondenza delle triplette di stop, vengono ad inserirsi dei fattori di

rilascio che portano al rilascio della proteina dal tRNA e la conseguente dissociazione

della subunità maggiore con la minore (disassemblaggio ribosoma)

A volte i codoni di stop possono codificare amminoacidi: di solito i codoni UGA e UAG

sono interpretati come codoni di stop, mentre in rari casi possono essere riconosciute

come triplette codificanti (scoperti recentemente e presenti in alcune proteine).

UGA = selenocisteina; UAG = pirolisina. 49

Possono essere riconosciuti come

codificanti se a valle del codone c’è una

particolare sequenza a forcina, il ribosoma

può ospitare in tRNA che trasporta

selenocisteina.

La formazione del polisoma aumenta il tasso della sintesi proteica:

Vari ribosomi possono tradurre simultaneamente lo stesso mRNA, dando origine a più

polipeptidi nello stesso momento. Non appena il primo ribosoma è arrivato abbastanza

distante dal sito d’inizio della trazione, si forma un secondo complesso di inizio. Un

polisoma è una struttura formata da un filamenti di mRNA unito ai ribosomi, che appaiono

come tante perle su un filo. Le cellule attivamente impegnate nella sintesi proteica

contengono numerosi polisomi, mentre scarseggiano ribosomi liberi.

Sintesi proteica negli eucarioti:

Negli eucarioti come nei procarioti, la fase di inizio è quella più critica e c’è anche

l’intervento del cap 5’ che permette la formazione del complesso d’inizio.

C’è una sequenza detta sequenza di Kozak che permette il riconoscimento della tripletta

di inizio negli eucarioti. Nei procarioti la trascrizione e la traduzione avvengono

contemporaneamente mentre, negli eucarioti, sono separate.

Editing dell’mRNA (correzione dell’mRNA)

La sequenza del trascritto primario viene alterata = l’mRNA maturo ha una sequenza

esonica diversa da quella del DNA genomico.

- L’editing è diffuso nell’mRNA dei mitocondri (protozoi), cloroplasti. È meno frequente

negli eucarioti superiori.

Es. di editing negli eucarioti superiori (in genere di singole basi)

• ApoB – 100 (500 kDa, negli epatociti) solo ApoB-100 è capace di rilasciare il colesterolo

nei tessuti

• ApoB – 48 (240 kDa, nell’intestini) corrisponde all’NH2-terminale dell’ApoB-100

Editing del trascritto primario: codone 6666 da C a U

CAA diventa UAA (codone di stop) → causa la produzione di una versione più corta di

ApoB-100. 50

Organuli intracellulari:

La presenza di organuli permette la compartimentizzazione della cellula eucariote.

- Nucleo

È stato scoperto nel 1831 da Robert Brown, è tipico delle cellule eucariotiche.

Il termine deriva dal latino e significa nocciolo.

La struttura del nucleo è diversa a seconda della fase del ciclo cellulare in cui si trova la

cellula; ha una forma generalmente sferica, ma può essere anche ellittica o fusata.

Anche la localizzazione del nucleo è abbastanza variabile: di solito si trova nella regione

centrale del citoplasma, ma per esempio nelle cellule secernenti è in posizione basale e

nel neurone e nel fibroblasto è in posizione centrale.

Ha dimensioni variabili, solitamente proporzionali al citoplasma ma ci sono eccezioni, per

esempio nel linfocita il nucleo occupa quasi tutto il volume della cellula.

Struttura:

- Involucro nucleare (in particolare dei pori nucleari, lamina)

- Matrice nucleare

- Nucleolo

- Nucleoplasma

- Involucro nucleare o carioteca:

È costituito da due membrane plasmatiche concentri-

che: una esterna ed una interna. Queste due mem-

brane non sono aderenti ma separate dallo spazio

perinucleare. Ciascuna membrana è uguale alla strut-

tura della membrana plasmatica

La membrana esterna è continua con la membrana

del reticolo endoplasmatico e per questo su di essa ci

possono essere ribosomi.

Nella membrana vi sono delle interruzioni, spazi vuoti

detti pori nucleari; in questi punti l’involucro non è

continuo, le due membrane si fondono determinando

la formazione di canali.

In questi punti è presente una struttura proteica

denominata complesso del poro nucleare, altamente

organizzata, che permette le comunicazioni tra

nucleo e citoplasma. Il complesso del poro nucleare è formato da due anelli concentrici

granulari che protendono dal versante citoplasmatico e nucleoplasmatico (ciascun anel-

lo è formato da 8 proteine, proteine poste in maniera simmetrica attorno al poro).

Vi sono strutture che ancorano gli anelli granulari alla membrana nucleare in corrispon-

denza dello spazio perinucleare. 51

Vi sono inoltre delle fibre che si estendono dagli anelli e formano una specie di

“canestro”. In pratica vi sono otto raggi che dipartono dagli anelli e si dirigono verso il

centro del poro raggiungendo un granulo centrale detto trasportatore.

Attraverso i pori nucleari:

• passano liberamente piccole molecole di H O, nucleotidi e molecole entro 5kDa.

2

• proteine dal citosol se hanno una specifica sequenza di localizzazione nucleare (ricca in

amminoacidi con carica positiva), passano senza modificazione della struttura

secondaria e terziaria.

• le subunità dei ribosomi vengono esportate separate grazie alla presenza di recettori

posti nei pori.

I pori occupano circa il 20-30% di superficie totale dell’involucro.

Lamina nucleare:

• La lamina è una rete di filamenti adesa al versante nucleoplasmatico della membrana

interna dell’involucro nucleare.

• Ha funzione di sostegno e da siti di attacco per la cromatina.

• È spessa 30 – 80 nm, nei nuclei integri è difficilmente osservabile perché mascherate dal-

la cromatina periferica.

• È composta da tre tipi di proteine: lamine nucleari A, B, C (PM 60-70 KDa); queste for-

mano dimeri che si aggregano in lunghe fibre che costituiscono i filamenti della lamina.

Quindi ciascuna lamina è formata da una parte globulare ed una fibrillare. Quando il di-

mero ha attaccato il gruppo fosfato non riescono ad associarsi ulteriormente e rimango-

no dimeri, altrimenti formano i tetrameri che formano la rete.

- Matrice nucleare:

Forma uno scheletro che contribuisce al mantenimento della forma del nucleo; serve inol-

tre da ancoraggio per i sistemi coinvolti nella trascrizione e duplicazione e costituisce

un’impalcatura per le fibre di cromatina.

Cromatina: al microscopio elettrico appare come masse dense collegate da ramificazioni

che sembrano costituire un reticolo complesso. La cromatina interfasica non ha un mas-

simo grado di compattamento.

- Nucleolo:

- È sede di sintesi di ribosomi;

- È una massa densa sferica che si colora intensamente;

- Non è delimitato da una membrana, perché non è un organulo;

- È presente solo nelle cellule metaforicamente attive;

- In alcune cellule ci possono essere più nucleoli.

Il nucleolo è costituito da due regioni:

• Regione fibrillare: costituita da anse di DNA che contengono geni per rRNA. Le regioni

dei cromosomi che contengono i geni che si formano le anse e che formano gli rRNA, si

chiamano organizzatori nucleolari.

• Regione granulare: contiene subunità ribosomiali a vari gradi di maturazione.

- Nucleoplasma:

- Non è omogeneo, ma organizzato in subdomini strutturali, si pensa che si pensa rappre-

sentino una vera e propria compartimentalizzazione strutturale.

- Le fibre di cromatina che costituiscono un determinato cromosoma non sono sparse nel

nucleo ma sono concentrate in un dominio specifico che non si sovrappone ai domini di

altri cromosomi.

- I fattori coinvolti nei processi di maturazione sono raggruppati in regioni dette speckle

(macchioline) che contengono snRNP ed altre proteine coinvolte nella maturazione (allo

stato inattivo).

- Adiacenti agli speckle ci sono da 1 a 10 corpi di Cajal (chiamati anche coiled bodies)

sono piccole sfere di strutture filamentose aggrovigliate (non sappiamo ancora il significa-

52

to funzionale). Tuttavia contengono fattori di maturazione per l’mRNA e a differenza degli

speckle si disperdono quando viene bloccata la trascrizione e la maturazione.

- Reticolo endoplasmatico: Il reticolo endoplasmatico consiste in reti

di membrane interconnesse, ramificate

entro il citoplasma. E’ costituito da tubuli

o sacchi più o meno appiattiti e cisterne

delimitati da una membrana e anasto-

mizzati (collegati) tra di loro.

All’interno vi è il lume, ovvero lo spazio

vuoto del reticolo endoplasmatico.

Il reticolo endoplasmatico si suddivide in:

- Reticolo endoplasmatico ruvido o rugo-

so (RER) → ribosomi adesi sulla membrana

- Reticolo endoplasmatico liscio (SER)

La membrana è in continuità con quella esterna dell’involucro nucleare.

Il RE non è un compartimento isolato ma è in continuo collegamento con altre regioni

(apparato di Golgi, Lisosomi, Vacuolo) attraverso la formazione di vescicole.

Traffico vescicolare: le vescicole gemmano da un compartimento e si fondono con un

altro, il trasporto vescicolare non è aspecifico: ciascuna vescicola di trasporto contiene

proteine selezionate e si fonde con un compartimento specifico, questo permette di

mantenere l’identità di ogni tipo di organello.

Reticolo endoplasmatico liscio (SER):

Il SER è connesso a porzioni del RER ma è privo di ribosomi. Assume più spesso la forma di

tubuli che non di vescicole appiattite. Alcune delle proteine sintetizzate nel RER vengono

trasportate nel lume del SER, dove subiscono modificazioni chimiche.

• Funzioni del SER:

- Provvede alla sintesi di fosfolipidi, glicolipidi (che entrambi fanno parte della membrana

plasmatica) e ormoni steroidei (testosterone, estrogeni progesterone..)

- Detossifica i farmaci rendendoli idrosolubili (xenobiotici), per permettere la loro elimina-

zione con l’urina, vengono attaccati gruppi polari –OH.

- Sequestra gli ioni di Ca : questo ione è mantenuto basso come concentrazione nel

++

citoplasma perché è sequestrato dentro al reticolo endoplasmatico e fuoriesce dal

reticolo solo in certi momenti.

- Nelle cellule animali è la sede della degradazione del glicogeno.

Il SER è abbondante: nelle cellule endocrine che producono ormoni steroidei (corteccia

surrenale, testicoli); nel fegato; nelle cellule muscolari (reticolo sarcoplasmatico).

Reticolo endoplasmatico rugoso (RER):

Viene così chiamato per via dei numerosi ribosomi associati alla superficie. Questi

ribosomi non sono associati in modo permanente al RE, ma lo diventano quando iniziano

a sintetizzare proteine che saranno modificate all’interno del RER.

1. Un proteina entra nel RER solo se contiene una breve e specifica sequenza di ammi-

noacidi, che segnala al ribosoma di agganciarsi al RER.

2. Una volta all’interno del RER, le proteine subiscono modificazioni chimiche per indirizzar-

le verso specifiche destinazioni.

3. Il RER partecipa al trasporto di queste proteine verso altri distretti cellulari. Le proteine

sono trasportate all’interno di vescicole che si formano dal RE per gemmazione; tutte le

proteine che vengono secrete passano attraverso il RER.

53

• Le funzioni del RER:

- Provvede alla sintesi delle proteine; una proteina sintetizzata sui ribosomi del RER viene

trasportata attraverso la membrana e poi nel lume, qui subisce vari cambiamenti.

- Accelera la formazione della struttura secondaria e terziaria delle proteine (anche la

quaternaria nel caso le proteine siano fatte da più subunità);

- Forma ponti disolfuro per stabilizzare la struttura delle proteine;

- Rielabora le proteine (modificazioni): ad esempio aggiunta alle proteine di catene glu-

cidiche, per formare le glicoproteine;

- Ancora le proteine ai glicolipidi;

- Provvede all’idrossilazione di 2 amminoacidi (prolina e lisina).

Il RER è molto abbondante nelle cellule che producono ormoni proteici come le cellule

esocrine del Pancreas.

Le proteine del RER saranno destinate a: reticolo endoplasmatico stesso; apparato del

Golgi; lisosomi; membrana plasmatica; extracellulare (esocitosi).

Le proteine dei ribosomi liberi nel citosol saranno destinate a: reticolo endoplasmatico;

nucleo; perossisomi; mitocondri.

• La sintesi delle proteine nel RER:

La sintesi delle proteine nel RER inizia nel citoplasma dove c’è una ribonucleoproteina

detta SRP che prende contatto con una sequenza segnale presente in una proteina in

sintesi. La SRP ha un recettore presente sulla superficie del RER. Questa interazione tra SRP

e recettore porta alla formazione di un canale detto traslocone.

Il RER sintetizza proteine solubili e transmembranasi (monopasso o multipasso): la proteina

solubile prima di essere eliminata dal reticolo endoplasmatico resta attaccata ad esso

per la sequenza segnale, poi interviene l’enzima peptidasi che la rilascia nel lume del reti-

colo endoplasmatico.

Nel caso di proteine transmembranali non vi è la peptidasi e resta attaccata al reticolo.

• Glicosilazione delle proteine nel RER:

N – glicosilazione: la glicosilazione avviene con un oligosaccaride preformato (formato

da N – acetilglucosammina, mannosio e glucosio) che è trasportato in blocco sull’NH 2

dell’asparagina grazie ad un oligosaccaride transferasi.

L’oligosaccaride è trattenuto sulla membrana da un lipide speciale chiamato dolicolo. Il

dolicolo lega lo zucchero con un legame pirofosfato ad alta energia, che serve come

energia di attivazione per la reazione di glicosilazione (N – linked).

O – glicosilazione: glicosilazione su gruppi OH di serina, treonina e idrossilisina (nel colla-

gene) avviene nell’apparato di Golgi (O – linked). Lo zucchero non si attacca all’azoto

ma all’ossigeno. Questo processo prevede non l’aggiunta di un oligosaccaride, ma di

uno zucchero alla volta.

• Formazione dei ponti disolfuro:

L’insulina (ormone proteico) ad esempio, viene sintetizzata

all’inizio dal reticolo endoplasmatico come pre-proinsulina poi,

ad un certo punto passa a proinsulina (priva della sequenza

segnale rimossa dalla peptidasi). Compaiono i ponti disolfuro

tra cisteine (R=CH SH), ovvero ad un certo punto si vengono a

2

trovare due cisteine una di fronte all’altra e si formano legami

covalenti tra S-S. L’insulina, quando passa nell’apparato di

Golgi, viene privata di tutta la parte priva di ponti disolfuro; re-

stano due segmenti paralleli legati tra loro da ponti disolfuro → insulina matura.

• Ancoraggio delle proteine a glicolipidi:

Ad alcune proteine di membrana viene tagliato un peptide carbossiterminale e scambia-

to con un’ancora di glicosilfosfatidilinositolo (GPI): proteine ancorate al GPI.

54

- Apparato del Golgi: L’apparato del Golgi è formato da piccole

vescicole delimitate da membrana e da

compartimenti membranosi appiattiti (cisterne)

ordinati a formare una pila leggermente ricur-

va. Le cisterne non comunicano direttamente

ma tramite vescicole (perché ogni cisterna è

separata dall’altra). Non vi è un canale di con-

tinuità (vescicole secretorie).

Da ogni cisterna si formano vescicole per il tra-

sporto di sostanze.

Quando le vescicole provenienti dal RER si fondono con la membrana dell’apparato di

Golgi, il loro contenuto proteico viene rilasciato nel lume di una cisterna, dove può subire

ulteriori modificazioni.

• Funzioni dell’apparato del Golgi:

L’apparato di Goli svolge varie funzioni:

- Concentra, impacchetta e smista l proteine prima che queste siano inviate alle rispettive

destinazioni.

- Addiziona carboidrati alle proteine.

- E’ la sede in cui vengono sintetizzati alcuni polisaccaridi destinati alla parete delle cellule

vegetali.

Le cisterne del Golgi hanno tre regioni:

- La regione Cis, è quella più vicina al nucleo o al RER

- La regione Trans, è la più vicina alla membrana plasmatica

- La regione mediale, è localizzata tra le due precedenti.

Queste tre regioni dell’apparato di Golgi contengono enzimi differenti e svolgono funzioni

specifiche. Le vescicole contenenti proteine e provenienti dal reticolo endoplasmatico si

fondono con la faccia cis dell’apparato di Golgi. Le vescicole che si liberano per

“gemmazione” dalla faccia trans del Golgi trasportano il loro contenuto lontano

dall’apparato; queste vescicole si dirigono alla membrana plasmatica o a un lisosoma.

• Il Golgi rielabora le catene oligosaccaridiche: - Smistamento

- Fosforilazione di oligosaccaridi su

proteine lisosomiali

- Rimozione del Mannosio

- Aggiunta di GlcNac

- Rimozione del mannosio

- Aggiunta del gal

- Aggiunta di NANA

- Aggiunta di solfati o tirosima e

carboidrati

- Smistamento

Da qui si può originare il lisosoma

primario.

La vescicola, quando raggiunge la

membrana, fonde la sua membrana

con quella cellulare.

55

• Dal Golgi si formano vescicole destinate a:

1. Riversare proteine nell’extracellulare (secrezione regolata o costitutiva)

2. A trasportare proteine che diventeranno proteine della membrana plasmatica.

La secrezione può essere:

Costitutiva → molte proteine solubili sono

costantemente secrete dalla cellula mediante

questa via (chiamata anche via default). Questa

via fornisce inoltre alla membrana plasmatica

lipidi e proteine di nuova sintesi.

Regolata → è controllata, il rilascio del contenuto

della vescicola è regolata da un recettore per

deteriminate molecole. Le cellule secretorie

specializzate hanno questa via di secrezione,

mediante la quale le proteine selezionate nel

Golgi trans sono deviate verso vescicole di

secrezione, dove le proteine sono concentrate e

immagazzinate finchè un segnale extracellulate

esterno stimola la loro secrezione.

• I lisosomi:

I lisosomi primari hanno origine dall’apparato di Golgi, contengono idrolasi (enzimi

digestivi) e sono i siti in cui le macromolecole vengono idrolizzate nei loro monomeri

costitutivi. Il lisosoma primario può essere solo di un tipo, quindi può contenere solo un

enzima lisosomiale. Il lisosoma è circondato da una membrana singola.

Alcun molecole idrolizzate nei lisosomi fanno il loro ingresso dall’esterno mediante la

fagocitosi o più generalmente endocitosi, una volta che si è formatala tasca questa si

trasforma in una piccola vescicola contenente macromolecole e detta fagosoma o

endosoma (contenente quindi materiale extracellulare) che poi si stacca dalla

mambrana plasmatica e si muove verso l’interno del citoplasma.

Il fagosoma (oppure endosoma) si fonde quindi con un lisosoma primario, dando così

origine ad un lisosoma secondario, nel quale avviene l’idrolisi delle macromolecole

inglobate. I prodotti della digestione enzimatica attraversano la membrana del lisosoma,

andando a rifornire di monomeri altri processi cellulari.

Il lisosoma secondario “usato” che, a questo punto, contiene particelle non digerite, si

sposta verso la membrana plasmatica, si fonde nuovamente con essa e rilascia

nell’extracellulare il suo contenuto indigerito.

• Il Golgi aggiunge fosfato al mannosio (M6P) nelle proteine destinate a diventare enzimi

lisosomiali:

M6P è un marcatore di destinazione, viene riconosciuto da un recettore nel Golgi trans.

L’unione del recettore con l’enzima inizia la formazione di vescicole.

Le idrolisi si dissoceranno dai recettori negli endosomi tardivi (a pH 6) e i recettori verranno

riciclati verso il Golgi trans.

L’apaprato di Golgi fa la fosforilazione a livello del mannosio degli enzimi, questo

permette le interazioni con recettori per formare vescicole → lisosoma primario: contiene

specifici enzimi lisosomiali, depurati alla rottura di legami covalenti. A seconda del

legame che idrolizzano:

- Proteasi → enzimi che rompono (idrolizzano) il legame peptidico nelle proteine

- Nucleasi → enzimi che rompono (idrolizzano) il legame fosfodiesterico degli acidi nucleici

(nei nucleotidi).

E così via: glicosidasi, fosfatasi, lipasi, solfatasi.

Gli enzimi lisosomiali sonoa nche detti idrolasi acide perché hanno la massima attività

enzimatica a pH 5. 56


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DESCRIZIONE APPUNTO

Argomenti trattati:
- La cellula
- Macromolecole biologiche
- La membrana plasmatica
- Trasporto attivo
- trasporto passivo
- Trasporto vescicolare
- Tessuti
- DNA
- Trascrizione
- Traduzione
- Sintesi proteica
- Organuli intracellulari
- Comunicazione intercellulare
- Recettori (di membrana ed intracellulari)
- Moltiplicazione cellulare (mitosi, meiosi)
- Genetica


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in chimica e tecnologie farmaceutiche
SSD:
Università: Pisa - Unipi
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher saragia di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Biologia animale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pisa - Unipi o del prof Costa Barbara.

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