Biofisica molecolare e cellulare - corso completo

Biofisica molecolare e cellulare

Flussi e permeabilità della membrana

I trasporti di soluti e acqua attraverso le membrane sono regolati attraverso flussi:

• Flussi passivi: secondo gradiente chimico e elettrochimico.
• Flussi attivi: contro gradiente, oltre alla legge di diffusione bisogna aggiungere termini legati alla reazione chimica accoppiata.

Legge di Fick (flussi passivi)

Il flusso è definito come numero di particelle che passano attraverso l’area nell’unità di tempo. Il flusso lo passiamo definire come concentrazione per velocità. Su una particella, la forza che agisce è quella di Stokes (F=rv). La resistenza (r) nel caso delle particelle è determinata dal coefficiente frizionale (f). Il coefficiente frizionale è definito come 6pigreco (raggio) eta(viscosità) r.

Sostituendo tutto, ottengo che il flusso è J=UcX(U=mobilità 1/Nf). Questa formula è quella di Teorell. La forza che agisce è il potenziale chimico (mu), che è la variazione di energia libera per unità di mole, il lavoro che il sistema compie su un’unità di mole. Il potenziale chimico è potenziale standard + rTlnc +VP. Quello che ci interessa è la variazione del potenziale chimico (delta). Possiamo eliminare il valore di VP in quanto non dà variazione; il potenziale standard si elimina quando facciamo la sottrazione e poi facciamo la derivata del potenziale (dmu). Questa dipende dalle concentrazioni dei due stati.

Potenziale elettrochimico

Se le molecole sono cariche, devo aggiungere la componente elettrochimica. Fa potenziale chimico più potenziale elettrico: zFV. Anche qui vado a fare la differenza di potenziale, e questa diventa zFdV. Riprendendo Teorell, devo esplicitare la forza (dmu / dX), in modo da ricavare il lavoro. RT/Nf la definiamo come diffusione (D). La derivata del logaritmo di c possiamo esplicitarla come il dc/c. Quindi si arriva ad avere la legge di Fick J=-D(dc/dx). Questa è la legge di Fick per il flusso di particelle non cariche. D dipende dal raggio e dalla viscosità, quindi il flusso dipende anche dalle caratteristiche della particella (è costante per ogni particella).

Quindi la legge di Fick ci dice che per flussi passivi ha come driving force la concentrazione, ma è inversamente proporzionale alla distanza. Questo in biologia si vede nei gas (ed ossigeno molecolare), ed è molto efficace con piccole distanze. Il flusso netto è direttamente proporzionale alla differenza di concentrazione ed è inversamente proporzionale alla distanza. Il flusso tra due compartimenti andrà dalla concentrazione maggiore a quella minore fino a che non si arriva a uno stato di equilibrio nel quale i flussi netti sono uguali e le concentrazioni sono uguali.

Diffusione attraverso le membrane

Ci sono delle particelle che hanno delle caratteristiche tali da impedire il passaggio attraverso la membrana. La membrana è considerata come un'altra fase e devo tener conto del concetto di permeabilità. Il flusso attraverso la membrana è definito come J per A (area). La distanza nella J è considerata come lo spessore della membrana; la concentrazione nella membrana dipende dalla ripartizione di quella molecola nella membrana. I gas diffondono liberamente, le particelle cariche hanno una probabilità molto bassa, i soluti polari non possono passare mentre quelli idrofobici diffondono molto bene.

Dr/deltaX = P (permeabilità, dipende anche dalle caratteristiche della membrana) J=PdeltaC. Se parlo di flussi bidimensionali, ho la stessa permeabilità e quindi dipende solo dalla concentrazione. La velocità di flusso dipende dalle caratteristiche della particella: le idrofobiche hanno una velocità maggiore rispetto a quelle idrofiliche. Se una membrana è permeabile a soluti e solventi, il soluto segue le leggi di diffusione semplice.

Equilibrio: momento in cui il flusso netto totale è 0.

Flusso di particelle cariche

Fick non basta più in quanto la forza che agisce è quella del gradiente elettrochimico. La legge è quella di Nernst-Planck. Il flusso J è uguale al potenziale chimico (-Uc(RTdlnc/dx)) ± il potenziale elettrico (UczF(dv/dX)). Raccolgo Uc e poi RT. Esplicito dlnC = dc/c. Alla fine, ricavo la legge di Nernst-Planck. Il caso più semplice è quando il flusso netto è uguale a zero, la condizione di equilibrio. Se pongo j=0 e risolvo l’equazione, trovo il potenziale di equilibrio (V). V=RT/Nflog(Cout/Cin). Questa è la legge di Nernst; in questo caso, la corrente è 0 (non c’è passaggio netto).

Possiamo definire il potenziale a riposo di una membrana, definito dall’equazione di Goldman-Hodgkin-Katz. Se la membrana è permeabile a ioni come potassio, sodio e calcio, devo imporre delle condizioni:

• La somma di tutti i flussi deve essere costante, stazionarietà.
• Elettroneutralità puntuale, la differenza di potenziale sia costante e quindi il potenziale vari linearmente.
• Membrana omogenea.
• Indipendenza dei flussi: il flusso di uno ione non interferisce con il flusso degli altri ioni.

Per il cloro che ha valenza negativa, vado a invertire concentrazione interna e esterna rispetto agli altri ioni con valenza positiva. Il potenziale a riposo è di circa -70 mV; questo è dato dalla diversa distribuzione degli ioni tra interno e esterno. Lo misuro utilizzando due elettrodi, uno interno e uno esterno, contando uno dei due a 0 (come terra).

I solventi seguono il gradiente di pressione osmotica. L’acqua si sposta dal compartimento con meno soluto a quello con più soluto. La pressione osmotica è definita come la pressione idrostatica che è necessaria per bilanciare i volumi e quindi contrastare il flusso. È definita come RTC; a noi interessa la differenza tra i due compartimenti: delta pressione osmotica=RTdeltaC. La concentrazione è quella dei soluti osmoticamente attivi. Questa è la legge di Van’t Hoff.

Concentrazione degli ioni nelle cellule di mammifero

Range di concentrazione degli ioni negli ambienti intracellulari e extracellulari: (Da sapere la direzione dei flussi principali.)

• Il sodio va dall’esterno (145mM) all’interno (15mM), porta una corrente positiva e depolarizza la membrana (arriva a -30 mA).
• Il potassio esce dalla cellula e quindi iperpolarizza la membrana (ripolarizzazione nel potenziale d’azione).
• Il calcio si muove da fuori (2mM) a dentro (10^-8M). Il calcio, oltre a muovere la corrente, attiva dei pathway come secondo messaggero.
• Il cloro (in questo caso) va dall’esterno all’interno e porta con sé una carica negativa iperpolarizzando la cellula.

Il potenziale di equilibrio è dato dal potenziale chimico e quello elettrico. È il potenziale al quale il flusso netto è uguale a zero; se è carico, la corrente è uguale a zero.

Trasportatori

I flussi attraverso la membrana delle molecole che non passano con diffusione semplice hanno bisogno di trasportatori, pompe e canali. Nella diffusione semplice, la velocità di trasporto è direttamente legata alla concentrazione. Nella diffusione che utilizza dei trasportatori si raggiunge un punto di saturazione. I canali ionici sono trasporti passivi perché fanno un trasporto secondo gradiente. I trasportatori che vanno contro gradiente sono attivi e possono essere primari (usano ATP) o secondari (sfruttano il gradiente di un'altra molecola formata dalle pompe).

I trasporti mediati sono abbastanza selettivi. Se possono legare più molecole, queste vanno in competizione, cambiando la Kt. Ci sono anche quelli che legano in più siti e questo fa variare la Jmax, in quanto non si ha competizione. Per regolare i trasporti mediati, si può aumentare la velocità di trasporto oppure si aumenta il numero di trasportatori di membrana.

GLUT: trasportatore di glucosio passivo. Ci sono 4 proteine diverse. GLUT1 primo clonato con espressione ubiquitaria. GLUT2 espresso in epatociti, neuroni e membrana basolaterale negli epiteli assorbenti. GLUT3 nei neuroni. GLUT4 nel tessuto adiposo e muscolo. L’insulina va a controllare il rate di trasporto del glucosio tramite l’aumento del numero di trasportatori sulla membrana. Questo è dovuto alla fusione di vescicole sottomembranali oppure per un aumento della trascrizione genica. I trasportatori attivi creano e mantengono i gradienti di membrana. È saturabile e può essere modulato e inibito.

Trasporto attivo primario e secondario

Il trasporto attivo sono le pompe o le ATPasi. Trasportano lo ione attraverso la membrana tramite l’energia data dall’idrolisi dell’ATP direttamente da parte del trasportatore.

Trasporto attivo primario:

• Na⁺/K⁺ ATPasi: l’ATP viene scisso in ADP e il fosfato si lega a un aspartato sul trasportatore. È una pompa elettrogenica in quanto si ha il trasporto di una carica netta positiva trasportata verso l’esterno. Escono 3 Na⁺ e entrano 2 K⁺. Esistono in due conformazioni E1 e E2 (sito di legame extracellulare) in base alla fosforilazione. Si è formato E1 che apre i siti verso l’interno della cellula, portando al legame di 3 Na⁺. Questo porta all’idrolisi dell’ATP. L’enzima fosforilato passa in E2 e espone il sito di legame nella zona extracellulare, con il rilascio di sodio. Si ha il legame dei 2 K⁺. In questo stadio si ha la defosforilazione dell’enzima che chiude la pompa. A questo punto si lega un ATP che viene idrolizzato e torna in conformazione E1 e libera il potassio. È regolata dall’azione degli ormoni steroidei ed è molto importante per mantenere attivo il metabolismo cellulare in quanto mantiene il gradiente membranale.

Si hanno altre ATPasi:

• Calcio ATPasi: servono a mantenere i bassi livelli di calcio citosolico e si trovano sulla membrana plasmatica (PMCA, verso l’esterno della cellula) o su quella sarcoplasmatica e del reticolo endoplasmatico (SERCA, verso l’interno del reticolo).
• Pompa potassio-protone: serve per l’acidificazione gastrica.
• V-ATP: si trovano negli organelli intracellulari come i lisosomi e acidificano l’ambiente interno.
• ABC trasportatori: ci sono delle pompe che servono a eliminare i farmaci dal citosol.

Trasporti attivi secondari trasportano contro gradiente usando il gradiente di un altro ione. Solitamente il gradiente usato è quello del sodio oppure quello di protoni, mantenuti costanti dalle pompe. Ha le caratteristiche di un trasporto facilitato. Si possono dividere in simporti e antiporti (sodio-protoni o sodio-calcio). Sono utilizzati anche per il trasporto di glucosio (SGLT), amminoacidi e neurotrasmettitori.

SGLT: il glucosio viene recuperato dalla membrana apicale verso l’interno della cellula usando il gradiente di sodio (simporto). Una volta nella cellula viene trasferito dalla membrana basolaterale al circolo sanguigno attraverso i GLUT (trasporto passivo). Sulla membrana basolaterale si ha la pompa sodio-potassio che mantiene bassa la concentrazione intracellulare di sodio. Quindi nel sangue ho un aumento della concentrazione di sodio. Il sodio è una molecola osmoticamente attiva che quindi porta a un richiamo di acqua. Ci sono delle modificazioni puntiformi che portano a un malassorbimento intestinale dato che è più difficile riconoscere il glucosio.

Cotrasportatori dei neurotrasmettitori: servono a eliminare i neurotrasmettitori dallo spazio sinaptico. Possono essere divisi in:

• Trasportatori Na/Cl dipendenti: ad esempio il trasportatore del GABA che sfrutta sodio e cloro secondo gradiente, due sodi per un cloro, portando all’ingresso di una carica positiva. Sono quelli che vengono inibiti dalle droghe psicoattive che inibiscono l’uptake, ad esempio della dopamina.
• Trasportatore di amminoacidi eccitatori: trasportatore del glutammato, accoppiano il contro gradiente del glutammato con il trasporto di sodio, protoni e potassio; in alcuni casi il trasportatore può diventare un canale per il cloro. Nel canale passano più ioni, quindi la conduttanza è maggiore e la stessa cosa per la corrente, mentre nei trasportatori si ha un basso rate.

Struttura degli epiteli assorbenti

Presentano delle giunzioni strette che limitano il passaggio tra le due cellule. C’è una membrana apicale che solitamente ha dei microvilli, si affaccia al lume ed è in contatto con l’esterno. La membrana basolaterale invece è in contatto con l’interno, ad esempio con la circolazione sanguigna; in questa si ha la pompa sodio-potassio che manca nella apicale. Si ha il trasporto paracellulare (diffusone passiva, dipende dalle giunzioni strette, passano ioni e acqua) e trasporto transcellulare (è data dai trasportatori passivi nella apicale e di trasportatori attivi, soprattutto primari, nella baso laterale).

Esempio: assorbimento intestinale di sodio. Il sodio entra tramite flusso passivo attraverso canali nella membrana apicale, dalla membrana basolaterale viene pompato nel flusso sanguigno a spese di ATP e gradiente di potassio. L’assorbimento di sodio è accoppiato anche all’assorbimento di glucosio contro gradiente. I flussi accoppiati dipendono da forze accoppiate. L’assorbimento di ioni porta all’assorbimento di acqua che segue i gradienti osmotici. I flussi netti sono dipendenti da fonti energetiche come il gradiente di sodio dato dalla sodio/potassio ATPasi.

Patologie del trasporto epiteliale: fibrosi cistica. Si ha una modificazione dell’epitelio che riveste le vie respiratorie con mutazioni puntiformi. Non passa abbastanza Na e Cl e quindi non si ha richiamo di acqua. Mancando l’acqua, il muco è molto più denso e dà problemi. Gli epiteli assorbono l’acqua attraverso i trasporti attivi degli ioni.

Proprietà elettriche delle cellule

Se misuriamo la differenza di potenziale ai capi di una membrana vediamo un valore negativo, -70mV. Per misurarla uso due capillari, uno intra e uno extra cellulare, legati a un voltmetro. La differenza di potenziale è dovuta a una distribuzione di cariche asimmetriche. All’interno si ha una prevalenza di cariche negative, dovute alla presenza di ioni. La più importante è la distribuzione di sodio e potassio, mantenuta dalla pompa sodio-potassio che è elettrogenica e che mantiene una carica netta interna negativa.

Quando si parla di potenziale di membrana a -70mV si parla di potenziale a riposo, calcolato tramite la formula di Goldman-Hodgkin-Katz. Qui entrano in gioco i potenziali di equilibrio degli ioni, calcolati con Nernst.

Driving force: è la forza che fa muovere lo ione. La driving force è data dalla differenza del potenziale di membrana a riposo e il potenziale di equilibrio dello ione. Se il potenziale dello ione è minore, si avrà una forza che porta all’ingresso nella cellula (driving force negativa), mentre se è maggiore, la forza spingerà fuori lo ione (driving force positiva). In base alla dimensione della driving force si ha anche la quantità di ione che entra/esce. Le correnti in entrata sono negative, mentre quelle in uscita sono positive.

Correnti di sodio e potassio nel potenziale di membrana

• Se ho potenziale di -10, ho corrente in ingresso di potassio e in uscita di sodio. Più mi allontano dal potenziale di equilibrio, più aumenta la componente di driving force elettrica, e quindi anche quella totale aumenta.
• Se andiamo a +55, il sodio non ha flussi netti.
• A +75, il sodio cambia direzione e entra come il potassio.

Noi possiamo rappresentare la cellula come un circuito elettrico. A livello basale, la cellula è 40 volte più permeabile al potassio che al sodio. Il potassio tende a raggiungere il suo potenziale di equilibrio di -90mV. Non riesce perché ci sono i canali del sodio aperti e c’è la pompa sodio-potassio che mantiene l’equilibrio. La direzione in cui si muovono gli ioni è data dalla driving force che è la differenza tra il potenziale di membrana e quello di Nernst. Un valore negativo è in entrata, un valore positivo è in uscita.

Circuito elettrico

A livello macroscopico, possiamo modellizzare la membrana come un circuito ohmico: in cui mettiamo in parallelo una resistenza e un condensatore. La parte resistiva è data dai canali ionici, quindi seguono la legge di Ohm. In biologia si utilizza il termine conduttanza, l’inverso della resistenza, quindi la corrente è uguale alla conduttanza (G) per la differenza di potenziale. I canali si trovano in parallelo, quindi posso andare a sommare le conduzioni.

La membrana per natura è un condensatore di carica. Il condensatore di membrana ha una capacità dipendente dall’area (dir) e dalla distanza (ind) in base alla costante dielettrica. Le misure di capacità sono utilizzate anche per studiare variazioni di dimensione della membrana (aumenta l’area). Possiamo misurare la carica ai capi della membrana, la carica condensata (Q) è uguale alla capacità per la differenza di potenziale. La membrana la possiamo considerare come differenti condensatori in parallelo, quindi la capacità totale è data dalla somma delle capacità.

Se modellizziamo la membrana come un circuito elettrico, possiamo trovare due correnti: quella resistiva e quella del condensatore. Corrente resistiva: è la corrente data dal passaggio degli ioni del canale. A noi interessa la conduttanza, che è l’inverso della resistenza. Quella del condensatore è la differenza di carica nel tempo, data dalla differenza di carica ai capi della membrana.