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Applicazioni delle iPS
Vediamo alcuni esempi di ognuna di queste potenziali applicazioni; cominciamo nell'utilizzo di cellule differenziate da iPS da pazienti malati e cellule di iPS derivate da controlli sani, e utilizzare questo sistema per fare un confronto dal punto di vista morfologico e funzionale.
Il ricercatore preleva i fibroblasti da entrambe le tipologie di pazienti, verranno riprogrammati a generare delle popolazioni di iPS di controllo e delle popolazioni di iPS con malattie specifiche.
Questi iPS possono essere differenziati in tipi cellulari che possono essere rilevanti per la malattia da cui è affetto il paziente, e si vanno a verificare le differenze morfologiche e funzionali.
Nel momento in cui ho riprogrammato iPS da individuo sano e da paziente posso anche, attraverso meccanismi di gene editing, mimare la patologia nell'iPS da individuo sano in modo da avere delle cellule differenziate caratteristiche del paziente e viceversa nelle iPS da paziente.
correggere il difetto genetico in modo da generare delle popolazioni di cellule differenziate che invece abbiano le caratteristiche delle cellule prelevate dal paziente sano. Questa è l'applicazione di iPS in contesto sperimentale dove voglia verificare dal punto di vista morfologico e funzionale il comportamento di cellule da individuo sano e da paziente. Sono state ad oggi studiate diverse patologie attraverso questo sistema di modellazione di patologie in vivo con cellule iPS; sono stati modellati molti tipi di malattie che colpiscono diversi distretti corporei. - Moltissime malattie neurologiche e neurodegenerative come SLA, SMA, Parkinson, Huntington, malattie del neurosviluppo come sindrome di Rett; - Difetti cromosomici come il morbo di Down - Malattie epatologiche come ADA SCID - Diverse forme di anemia, talassemia - Malattie metaboliche - Malattie cardiovascolari come QT lungo - Malattie di immunodeficienza primaria - Malattie muscolari come Duchenne e Beker Alcune di questetrattamento con un inibitore specifico dell'attività di SMN2, una proteina coinvolta nella SMA. Successivamente, gli sferoidi vengono analizzati per valutare l'effetto del trattamento sulla sopravvivenza e sulla funzione delle cellule. Questo protocollo rappresenta un esempio di come le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) possono essere utilizzate per modellare malattie genetiche come la SMA in vitro. Questi modelli consentono di studiare i meccanismi patogenetici delle malattie, testare nuovi farmaci e sviluppare terapie personalizzate. È importante sottolineare che, nonostante i progressi nella ricerca sulle malattie genetiche, molte di esse non hanno ancora una cura definitiva. Tuttavia, gli studi come quello descritto sopra sono fondamentali per comprendere meglio queste malattie e sviluppare nuove strategie terapeutiche.trattamento con Acido Retinoico (RA), un potente induttore del differenziamento neurale. Dopo una settimana viene inserito un Sonic Hedgehog (SHH). Dall'inizio alla 4° settimana è la fase di neural patterning, in cui le iPS sono state avviate verso un fenotipo di differenziamento neuronale. Dopodiché le cellule sono state messe in coltura su un substrato di Laminina assieme ad acido retinoico, Sonic Hedgehog, un cocktail di amminoacidi e fattori di crescita Brain Derived Neurotrofic Factor (BDNF) e Glial Derived Neurotrofic Factor (GDNF), due fattori di crescita per il differenziamento neurale e gliale. La messa in coltura in queste condizioni è il protocollo per indurre in queste cellule il differenziamento verso un fenotipo motoneuronale. Si generano motoneuroni sia dai controlli sani sia da pazienti SMA, e questi due modelli in vitro vengono confrontati dal punto di vista anatomico e funzionale. Naturalmente poi questi motoneuroni derivati da iPS di individuo.sano e di paziente sono stati estensivamente caratterizzati con tutti i protocolli di cui abbiamo già parlato, e poi è stato caratterizzato il differenziamento motoneuronale di queste iPS. Queste cellule sono state poi utilizzate ad esempio per verificare l'effetto di somministrazione di farmaci (ad esempio acido valproico e tobramicina) valutando la presenza all'interno del nucleo di corpi intensamente positivi alla marcatura con anticorpo (detti gems) che sono accumuli di una proteina caratteristica.
Nell'immagine, la colonna a sinistra presenta cellule provenienti da persona sana e la colonna di destra le cellule di persona malata di SMA; nelle immagini a) e b) vediamo fibroblasti, quindi cellule da cui sono derivate le iPS riprogrammate, in c) e in d) le iPS ricavate.
Sia nei fibroblasti che nelle iPS da paziente sano, e anche a seguito del trattamento farmacologico, sono presenti gemme all'interno del nucleo delle cellule. Sono assenti all'interno dei
Nuclei dei fibroblasti e dei nuclei delle iPS nei pazienti SMA. Cosa succede quando tratto le iPS con acido valproico e tobramicina? Collettivamente questi farmaci spingono la sintesi di proteine SMN, anche nei pazienti SMA; infatti nelle iPS derivate da pazienti SMA all'interno del nucleo cominciano a comparire dei cluster intensamente positivi di questa proteina.
In alto a destra della slide un grafico mostra il conteggio di Gems in cellule iPS Wealth Type trattate e non; a seguito del trattamento farmacologico il numero di queste strutture aumenta significativamente sia dopo trattamento con acido valproico che dopo trattamento con tobramicina.
Questo vale anche quando si faccia rapporto dell'intensità di fluorescenza fra la fluorescenza dovuta all'immunomarcatura SMN rispetto alla marcatura per l'actina, e in questo contesto il trattamento con acido valproico e tobramicina nelle iPS di pazienti SMA è significativamente maggiore rispetto al contenuto di questa.
Altro esempio: Malattia cardiovascolare, la sindrome del QT lungo. In questo caso il paziente affetto è caratterizzato dalla mutazione dei canali per il potassio nei cardiomiociti; a questi pazienti vengono prelevati ancora una volta i fibroblasti epiteliali, e questi vengono riprogrammati a cellule iPS e in questo caso c'è scritto nella slide che la riprogrammazione è avvenuta mediante l'utilizzo di un sistema a retrovirus. Se queste cellule iPS che portano la mutazione vengono differenziate a cardiomiociti, ritroviamo lo stesso comportamento dal punto di vista elettrofisiologico ai cardiomiociti del paziente. Alla coltura viene
Somministrato Isoproterenolo, una molecola che ha la funzione di indurre una risposta nei cardiomiociti che simula una stimolazione beta-adrenergica, e la somministrazione di questa molecola è in grado di indurre un fenotipo aritmico all'interno dei cardiomiociti in coltura.
A questo punto si testa l'effetto di un'altra molecola, il Propanololo, con funzione antagonista rispetto all'Isoproterenolo, e si osserva come la somministrazione di questa molecola sia in grado di riportare le caratteristiche elettrofisiologiche delle cellule di coltura in un range di normalità.
In questo caso i ricercatori, oltre a verificare da un punto di vista anatomico le caratteristiche di cardiomiociti differenziati da iPS di paziente rispetto alle caratteristiche di cardiomiociti differenziati da individui sani, sono andati a fare degli studi funzionali attraverso la registrazione dei potenziali elettrici in queste colonie di iPS derivate da pazienti con la sindrome del QT.
lungo.In basso a destra nella slide, il comportamento da un punto di vista elettrico di cardiomiociti di un individuosano (in alto) e di cardiomiociti di un individuo malato (in basso).Si nota che il periodo FDP (neanche la prof sa cosa sia) dura di più per la sindrome del QT lungo.Avevamo detto che attraverso il gene editing è possibile correggere una cellula iPS proveniente da pazientead una sana o viceversa, far ammalare una cellula iPS sana per simulare la malattia.G EENE DITING Il gene editing è una delle più attuali, precise e sofisticatetecnologie che permette di introdurre mutazioniall’interno di specifici geni in maniera assolutamentepuntuale e precisa, e dall’altro lato ci permette dicorreggere mutazioni presenti all’interno di un genomain modo altrettanto preciso.A coloro che misero a punto le tecnologie di gene editing(vedremo con Landsberger o Foiani) è stato assegnato ilpremio Nobel quest’anno.Nel corso degli
Nel corso degli anni sono stati modificati i genomi delle iPS utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9, al fine di apportare modifiche genetiche alle iPS derivate da pazienti portatori di malattie genetiche associate a mutazioni a singolo gene. Ad esempio, queste tecnologie sono state utilizzate per correggere le mutazioni nei geni responsabili dell'insorgenza dell'epidermolisi bollosa, della Duchenne, dell'Huntington, della beta-talassemia e della sclerosi amiotrofica laterale. L'obiettivo è quello di ottenere iPS geneticamente corrette, dalle quali è possibile indurre il differenziamento del tipo desiderato.
cellulare desiderato e reimpiantarle nel paziente in modo da curare la patologia.
Il gene editing associato allo sviluppo della tecnologia delle iPS è qualcosa di veramente promettente in un contesto di medicina personalizzata, quindi l'idea è che a fronte di un donatore affetto da patologia le sue cellule possano essere differenziate in iPS, il difetto genetico può essere corretto attraverso queste metodologie in modo da generare una popolazione di cellule sane, e infine essere utilizzate come:
- Modello di patologia in vitro per screening di farmaci
- Studio degli aspetti morfologici e funzionali della patologia
- Essere reinserite nei pazienti in un contesto di terapia di precisione.
CELLULE STAMINALI E COMUNICAZIONE CELLULARE
CELLULE STAMINALI
Riprendiamo ciò che è stato visto nella scorsa lezione: un possibile utilizzo delle cellule staminali inducibili iPS associato alla possibilità di modificare i geni di queste cellule è la
modellazione in vitro di alcune patologie. Sono state infatti coltivate delle popolazioni di iPS editate,
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