Appunti Colture cellulari

Lezione 1 - 28/02/22

Il modello microbiologico

Il modello microbiologico è un riferimento sul quale basare delle conoscenze da estendere a classi simili. Si va a studiare ciò che riesce a crescere in coltura, facente parte di un singolo ceppo. Con questo sistema si studia solo 1/2% al massimo dei microrganismi, del resto riesco a studiare solamente il genoma (attraverso il DNA). La cultura pura è un punto di forza per certi versi e di debolezza per altri. La microbiologia classica inizia a metà Ottocento, quella molecolare negli anni '40 del secolo scorso.

Tipi di microrganismi

I microrganismi sono:

• Procarioti (batteri e arche) sotto al µm: Archea, simili ma non uguali; le differenze sostanziali sono a livello di membrana, di parete e di proteine. Non hanno un nucleo (cario=cellula; procarioti=cellule prime, le più semplici. Furono trovate in ambienti anaerobi e ostili). Batteri; molto piccoli, sotto al µm.
• Eucarioti, presentano invece nucleo e i vari organelli (Golgi, mitocondri ecc).

Elementi in comune tra procarioti e eucarioti: i ribosomi, perché non sono organelli, non lo sono perché non hanno una membrana; dunque è un'entità più antica. Non a caso studiando l'RNA dei ribosomi è stato possibile ricostruire l'albero: I procarioti sono:

• Funghi, non evoluti.
• Alghe, evolute in piante.
• Procarioti, evoluti in animali.

Come sono stati scoperti?

La scoperta avvenne grazie al microscopio, ma per circa 200 anni la ricerca non si è evoluta. Un medico di Vienna si accorse che, più frequentemente che nelle donne che partorivano a casa, all'ospedale le madri avevano la febbre puerperale. Pasteur, dopo circa 30 anni, dimostrò la presenza di microrganismi e le loro attività patologiche e benefiche. Fu lui a dimostrare che la vita genera soltanto da altra vita. Nel 1800 la microbiologia segna delle tappe importanti come la sepsi, la sterilizzazione (fondamentale per la conservazione), la produzione della birra per finire con la scoperta della PENICILLINA. Prima un italiano di Castellammare di Stabia (pozzo pulito tifo/ pozzo sporco antibiotico... c’era qualcosa di benefico nello strato che si rimuoveva) per poi essere estratta nel 1915 da Flemming.

Perché studiare i microrganismi?

I microrganismi sono quindi degli agenti eziologici in medicina, nelle trasformazioni e che possono alterare alimenti e manufatti. Sono stati differenziati per puoi essere sfruttati per il concetto di ONE HEALTH.

Esistono delle comunità che vivono in un singolo ambiente. Nell'ambiente ci sono 5 condizioni da osservare: diverso numero di specie, consociazione (aiuto o influenza negativa reciproca), carenza nutrizionale, densità cellulare (molto variabile nei diversi ambienti, si deve studiare la densità tipica di un substrato), biofilm.

Fitness relativa

La fitness relativa è il rapporto tra genitore e progenie: se è pari ad uno è stabile, maggiore è in crescita e quindi in aumento demografico, se è minore è negativo e la popolazione diminuisce. (Si può paragonare all’RT)

Coltura pura

La coltura pura è l'insieme di cellule che derivano dalla stessa madre per riproduzione vegetativa, asessuata, senza l'intervento della ricombinazione generica. Le cellule sono identiche, per cui il tasso di mutazione è basso. Questo è un limite perché c'è un eccesso nutrizionale, dunque non c'è competizione. Elemento chiave è la colonia, una coltura pura che si trova in un punto preciso quindi un terreno di coltura solidificabile e deve esser distinto e discreto nello spazio.

Morfologia della colonia

• La forma; puntiforme (particolarmente piccola), circolare (all'incirca l'80% delle colonie), filamentose, irregolari (degli organismo con poco movimento sulla piastra), rizoide, fusiforme.
• Lo spessore (elevation); piatto, sopraelevato, convesso, cupoliforme, umbonato, crateriforme.
• Margine; regolare, ondulato, lobato…

La cultura pura parte da una colonia, replicabile in un terreno solido o liquido. Resta sempre una coltura pura finché non ci sono inquinamenti. Una cultura pura appartenente a una specie e identificata con un nome o numero è definita ceppo. Colonia mista: a causa di due tipi diversi di cellule. Patina: insieme di colonie che formano un singolo strato. Può essere pura o mista, derivante da un isolamento fatto male. Con coltura, colonia o patina parlo dell’aspetto visivo, mentre con pura e mista parlo della qualità di quest'ultime.

Lezione 2 - 02/03/22

Prelievo dei microrganismi nell'ambiente

Prelievo: primo atto dello studio dell'ambiente, estremamente delicato. Il prelievo è la raccolta dai vari tipi di ambiente. Dal momento che ce ne sono diversi tipi, il prelievo deve adattarsi. Questo perché con un prelievo errato i risultati successivi vengono falsati. (filiera)

Bisogna garantire:

• Significatività del campionamento, più è eterogeneo e grande un campione tanti più prelievi bisogna fare. Uniformità del prelievo, numero di campioni prelevati. Per avere dei valori significativi si deve prelevare una quantità di campioni sufficienti, e prelevati in maniera uniforme nell'ambiente, a stabilire una percentuale realistica del fenomeno.
• Rimozione inquinanti, rimuovere i detriti superficiali senza alterare la composizione microbiologica del substrato oggetto di studio. In alcuni casi è difficile farlo. Es: andare a perforare una calotta polare, chi sa che la trivella non abbia portato all'interno i microrganismi presenti nella superficie?
• Sterilità, il biologo porta dietro microrganismi esterni, quest'ultimo deve star attento a non respirare o ingerire i patogeni del campione e non inquinare il campione stesso. Tanto più le tecniche sono sensibili tanto più le accortezze sono maggiori.
• Frazionamento del prelievo, frazionabile o non frazionabile. Un substrato è frazionabile quando lo si può privare di una parte del substrato.
• Tipologia: a seconda della tessitura del substrato vengono prese in considerazione diverse tecniche di frazionamento.

Tipi di frazionamento

Frazionabile:

• Matrice solida:
  • Alta carica, un suolo si va con dei cucchiai/spatole sterilizzate. (se stratificato si fa una sorta di carota che va a prelevare tutti gli eventuali strati)
  • Bassa carica, pasta/biscotti (prodotti a alta temperatura e scatolati), tengo in considerazione molte unità.
• Matrice liquida, la più comune perché i microrganismi assorbono nutrienti.
  • Con la carica alta basta poco (si usa la pipetta, di plastica o di vetro).
  • L'acqua ad esempio dove c'è poca roba, si inverte il sistema, vado a prendere grandi quantità.

Non frazionabile:

• Liquido, pura teoria.
• Solidi:
  • Carica elevata, pavimento. Utilizzo un tampone Cottonfioc, imbevuto da acqua e si passano sulla superficie, metto il Cotton fioc nel tubo.
  • Carico basso, tavolo. Uso le piastra Rodac (Piastra a fondo mobile). Fungono da timbro.

Conservazione preliminare del campione

Informazioni sulla conservazione preliminare del campione non sono state fornite.

I terreni di cultura

Principio: tutte le cellule viventi hanno la stessa componente atomica. Il terreno di cultura deve esser adeguato ai microrganismi che bisogna far crescere.

Classificazione dei terreni di cultura

Composizione:

• Naturali, mosto, brodo di carne, di fieno, frutta, pane.
• Sintetici, cioè sono stati messi insieme diversi componenti:
  • Definiti, quelli in cui cin sono soltanto sostante definite dal punto di vista chimico (glucosio, vitamina D, cloruro di sodio e i pesi specifici da aggiungere). Sono assolutamente controllabili e riproducibili ma i microrganismi ci crescono male e sono costosi. Per fare le analisi.
  • Complessi, non definiti, fatti da composti standardizzati e molto complessi (ci sono molte cose e quindi non so nello specifico cosa ci sia). I microrganismi crescono facilmente, li uso per fare biomassa, si trovano facilmente nelle industrie.

Stato fisico

• Liquidi, naturali e di sintesi.
• Solidi, naturali. Buoni per l'isolamento ma difficilmente riproducibili.
• Solidificabili, di sintesi. Contengono l'agente gelificante. Hanno i vantaggi dei liquidi e dei solidi.

La composizione

I terreni in coltura si distinguono in base agli elementi nutritivi presenti:

• Definiti, in cui si conosce la esatta composizione chimica.
• Minimi, terreni chimicamente definiti che contengono il minimo numero di sostanze indispensabile per la crescita microbica.
• Non definiti, in cui sono presenti miscele complesse di composti di cui non è nota l'esatta composizione chimica.

La composizione di un terreno varia al variare della specie perché dipende dalle capacità metaboliche del microrganismo stesso. I terreni complessi sono preparati utilizzando estratti di cellule animali, vegetali o microbiche, e quindi contengono diverse molecole organiche e inorganiche le cui composizioni e concentrazioni non sono note. Il loro utilizzo rende possibile la crescita di microrganismi di cui non siano definite specifiche richieste nutrizionali e lo stesso terreno può esser utilizzato per coltivare più specie microbiche con esigenze nutrizionali differenti.

Tipi di terreni

Terreni di arricchimento, terreno nel quale è stato inserito una sostanza che permette di far crescere meglio alcuni organismi e di far crescere peggio altri. SOLO LIQUIDO. Non permetta di fare la conta dopo la selezione.

Terreni selettivi, non è solo il terreno ad essere selettivo ma anche la condizione, dovuta a parametri fisici, come la temperatura chimici, come il pH. LIQUIDO O SOLIDO, permette la conta dopo o contestualmente alla conta, isolando dopo.

Terreni differenziali, cromagar, terreni dove ci sono coloranti, una tale specie diventa azzurra e un'altra diventa verde, permette di differenziare le due specie. TIPICAMENTE SOLIDO.

Es: Terreno di McConkey (GRAM NEGATIVI) rosse, fermentano il lattosio, trasparente no. I Sali biliari ci dicono che sono microrganismi dell'intestino che sopportano i Sali biliari ci possono crescere.

Lo stato fisico

Solidificazione: solidificante AGAR-AGAR, acido galattulonico che non viene digerito dai microrganismi. Viene messo il 15-17 g/L per poi essere passato in autoclave dove viene sciolto ad alta temperatura per poi rapprendersi intorno ai 45° per diventare solido a 39-40°. L'AGAR ha la sovraffusione, per cui se si parte dallo stato liquido si solidifica intorno ai 40°.

Se si riprende l'agar solido (40°) e lo sciolgo intorno agli 80° si scioglie. La temperatura di solidificazione non è quella di liquefazione. Solidifica a 40, scioglie a 80.

L'agar dal punto di vista reologico e fisico è un polimero donato di sovrafusione, preziosa caratteristica perché resta solido dalle temperature più basse fino a 80°, non viene digerito dai batteri proteolitici e a 40° si possono includere anche le cellule del terreno (disseminazione o inclusione).

Lezione 3 - 07/03/22

Sterilità

È un concetto che varia dal posto dove si applica. In una sala operatoria viene definita "assoluta" (anche se, in realtà, assoluta non lo è mai). In ambito biotecnologico, soprattutto in alcune industrie meno fini, è definita "tecnica". È l'assenza di organismi viventi e di virus, quindi, quando si sterilizza, si va a disattivare microrganismi e virus. Uccidere un virus non si dice! Non si può uccidere ciò che non è vivente e il virus non lo è perché non hanno l'omeostasi; hanno solo la capacità di riprodursi.

Modalità per lavorare in sterilità

• Antisepsi (sepsi= putrefazione; anti)

  Prevede di continuare a sterilizzare per tutta la durata dell'intervento. (asepsi portata avanti nel tempo). Si iniziò utilizzando l'acido fenico (agente sterilizzante). I chirurghi tenevano immerse le braccia, fino al gomito, in acido fenico per sterilizzare al meglio le parti a contatto con il paziente; il resto era tutto sterile (teli, pelle, ferri). Inoltre tale acido veniva spruzzato nell'ambiente e nella zona di taglio, così da riempire tutta l'atmosfera nella zona operatoria. Esempi: becco Bunsen, mantiene la sterilità con il calore e permette di sterilizzare anche l'area nel raggio di 10-15 cm. Autoclave, il passaggio da agenti chimici a agenti fisici (raggi UV).

• Asepsi (senza putrefazione) concetto di sterilizzare l'ambiente e lavorare con oggetti sterili.

  Esempio: sala operatoria: viene sterilizzata e poi mantenuta sterile durante l'uso.