Appunti Colture cellulari

Riduzione decimale (DOSE)

Tempo di riduzione decimale: Si vuol capire in un'autoclave qual è il tempo di riduzione decimale. N0 è il numero iniziale, N è il numero delle cellule nel momento finale. N0/N è la riduzione della vitalità della popolazione nel tempo di sterilizzazione t. Log (N0/N) è il numero di cali decimali, pari ad nD ovvero il numero di dosi necessarie. Allora t=D (tempo di riduzione decimale) x nD e D=t/nD. In min passi dal 100% allo 0.1% di probabilità di avere una cellula viva.

Seconda legge di Bigelow considera non le quantità di dosi ma l'intensità della dose sterilizzante (Z). La quantità di sterilizzazione è l'intensità per il numero di dosi o per il tempo. Noi consideriamo la temperatura, la quantità di valore.

Il valore Z corrisponde all'aumento di temperatura che deve essere realizzato per ridurre D di un fattore 10.

Nel caso delle lampade si considerano sia la

La definizione di intensità sterilizzante è la quantità di dosi sterilizzanti deposte sulla o nella coltura microbica o su una superficie. L'intensità aumenta con il quadrato della distanza.

Le categorie principali da considerare sono l'intensità specifica, ovvero la temperatura nel caso del calore, e la potenza e la distanza di irraggiamento se si tratta di una radiazione.

Parametri: intensità della sterilizzazione

Metodi di sterilizzazione:

• Mezzi chimici:
• Effetto -cida (battericida, funghicida)
• Effetto -statico (batteriostatico, fungostatico)
• Gli antisettici possono avere entrambi gli effetti:
• Alcoli, fra cui ritroviamo l'alcol etilico e l'alcol isopropilico. Vengono utilizzati, normalmente, ad una concentrazione del 60-70% per la disinfezione della cute integra. Sono capaci di diminuire notevolmente la carica microbica sulla cute e per questo possono essere utilizzati anche per l'igiene chirurgica.

sotto forma di gel o soluzione per la disinfezione delle mani. La tintura di iodio, invece, è un antisettico ad ampio spettro che viene utilizzato per la disinfezione della pelle prima di interventi chirurgici o di prelievi di sangue. È importante seguire le indicazioni del medico o del farmacista per l'utilizzo corretto di questi antisettici e evitare possibili effetti collaterali.in ambito chirurgico e, generalmente, possiede una tossicità piuttosto limitata. Questi agiscono dissolvendo i lipidi delle membrane e denaturando le proteine. - Mezzi fisici: Energia termica, la più complessa. È data dal calore che può esser somministrata in 3 forme: - Diretto (o a secco), il calore viene trasmesso agli oggetti da sterilizzare attraverso l'aria: - Incenerimento, consiste nella diretta esposizione alla fiamma di anse o spatole prima del loro utilizzo (con ago o ansa alla fine di un manico sul becco Bunsen, tutto ciò che ci passa viene incenerito); - Flambaggio, esempio: spatola. Si immergono i metalli in un vasetto colmo di alcol e si portano sulla fiamma. Il calore a secco si ottiene anche con apposite stufe nelle quali gli oggetti da sterilizzare vengono tenuti per 2/3 ore a temperature di 160°-180°. - Umido: - Appertizzazione, L'appertizzazione è stata il primo processo di sterilizzazione degli alimenti suLa scala industriale è stata inventata nel '700 dal cuoco francese Nicolas Appert. L'appertizzazione consiste nel portare l'alimento, inscatolato o imbottigliato a chiusura ermetica, a circa 120°C per 15-30 minuti in una autoclave. Può avvenire anche a ciclo continuo: il riscaldamento iniziale viene fatto in torri altissime dove le bottiglie e le scatolette entrano in un bagno di acqua calda (preriscaldamento), poi in una camera di vapore riscaldato, poi in una camera di acqua fredda ed infine refrigerate. La pastorizzazione, invece, viene effettuata a temperature di 60-65°C per 30 minuti con successivo rapido raffreddamento. Tale processo solitamente si applica ad alimenti che non richiedono una vera e propria sterilizzazione e le cui caratteristiche verrebbero alterate da trattamenti troppo drastici. Esempio: il latte. Tale trattamento è utilizzato sia per allungarne la conservazione che per rimuovere batteri patogeni poco termotolleranti, come Mycobacterium.

tuberculosis.come ad esempioPastorizzazione rapida 72°C per 15 secUHT, Consiste nel portare l'alimento liquido micronizzato a 140-150 °C per 3 secondi, tramite iniezione di vapore surriscaldato. La micronizzazione garantisce il contatto tra microrganismi-spore e vapore surriscaldato, abbattendo così la carica microbica.

Tyndallizzazione (da Tyndal) La tindalizzazione, o metodo del riscaldamento frazionato, è un tipo di sterilizzazione termica mediante calore ideato dal fisico britannico John Tyndall. Si operano fra i tre ed i cinque riscaldamenti a 60-80°C della durata di circa un'ora ciascuno, separati da un riposo di 24 ore a temperatura ambiente o, più correttamente, in condizioni di incubazione (30-35°C). La tindalizzazione è consigliabile nel caso in cui il materiale da sterilizzare sia molto sensibile al calore e presenti una bassa carica microbica iniziale Teoria dell'espansione dei corpi, Tyndal inoltre scoprì la

Utilizzando un anello di metallo e una sfera di metallo. Se metteva a scaldare la sfera non passava più nell'anello.

Autoclave: gli oggetti da sterilizzare sono posti in una camera che viene chiusa ermeticamente. Quindi viene prodotto vapore e l'aria, già presente della camera, viene spinta fuori attraverso una valvola di scarico. Di solito le condizioni vengono mantenute per 15-20 min a 120°, il tempo è sufficiente per eliminare tutte le spore.

Secco: Stufa, che usa come mezzo di propagazione l'aria, cattivo conduttore, per cui servono temperature più alte.

Energia meccanica, non possiamo applicare le leggi di Bigelow è semplicemente la filtrazione. Si ha una membrana filtrante, ciò che viene rilasciato dalla membrana, se i pori lo permettono, è materiale sterile.

Energia radiante: Ionizzanti: raggi x e gamma: solo quando non ci sono esseri viventi. Non ionizzanti: raggi UV, basta una barriera di protezione.

per l'uomo.

LEZIONE 4- 09/03/22

L'ISOLAMENTO

L'isolamento è un'operazione che permette di separare i vari microrganismi di un substrato in colonie ma presenta un problema: trasforma le colture da miste a pure, dunque manca la competizione.

L'isolamento è una procedura qualitativa.

Per avere la certezza di lavorare con una coltura pura è sempre obbligatorio procedere al reisolamento delle colonie ottenute.

Preparare il campione, in due modi. Si parte dalla preparazione del campione a partire da:

• Cellule in un substrato liquido
• Cellule in un substrato solido, frazionabile, e si sospende oppure da uno non frazionabile ottenuto da un cotton fioc immerso nel liquido nel liquido

Tipologia di campione:

• Substrato liquido: solitamente si usa l'acqua distillata, soluzione fisiologica (laddove si debbano evitare shock osmotici) brodo peptonato

Tecniche:

1. ISOLAMENTO PER SPANDIMENTO
2. ISOLAMENTO PER DISSEMINAZIONE
3. ISOLAMENTO SU FILTRO
4. ISOLAMENTO

MONOCITOGENETICO

Lo spandimento

In questo caso il terreno è solidificato e si spande su una superficie solida.

Principio di isolamento su una superficie: Cosa si ottiene? Esempio, ditata di gesso e spandimento sul tavolo. Il bianco inizia in un punto e va ad attenuarsi; questo è un principio per cui quando strisciamo un solido su una superficie inizialmente si rilascia una grande quantità di solido, però quando si continua questo passaggio ne rilascio sempre meno.

Le tecniche di spandimento sono tutte tecniche che puntano ad allungare gli effetti di questa operazione.

Modalità:

- SPREAD-PLATE METHOD (SPANDIMENTO) introdotta negli anni 20' del 900 a Perugia.

Questo sistema porta a un risultato ma è lungo.

Come funziona? Su una piastra si aggiunge un po' di sospensione, che deve esser abbastanza diluita (ma funziona anche con sospensioni dense), arrivo con una spatola, una bacchetta a forma di L (in certi casi è

più complessa), chepuò esser di vetro o di acciaio, e vienesterilizzata per flambaggio. Con il lato cortodella L si distribuisce su tutta la piastra la sospensione. Ripeto l’operazione dalla 1^ alla2^ piastra. Funziona bene sulle piastre fresche che hanno un po’ di umidità all’interno(non funziona su piastre secche) e continuo a girare, perché dalla 1^ piastra sono rimastidei microrganismi che andrò a lasciare nella 2^. Ripeto l’operazione anche sulla 3^piastra.In questo modo in una delle 3 piastre ho un isolamento.Problema? Isolamento solo su una piastra, le altre vanno buttate… è dispendioso.

- STREAK-PLATE METHOD (STRISCIO), si effettua con l’ago o con l’ansa. (Si usa l’agosolo se si parte da una patina o da una colonia; l’ansa se si parte da una sospensione)Come funziona? Si inserisce l’ansa nella sospensione (l’ansa è stata sterilizzato con ilbecco Bunsen, dunque

quando viene immersa un po' sfrigola), chiudo il tappo, porto l'ansa sulla piastra e decido quale tecnica seguire: per quadranti, prevede di fare dei passaggi paralleli piuttosto ravvicinati; fatti 3/4 di passaggi si immagina di avere più densità di cellule in quella zona, poi prendo l'ansa, la re-sterilizzo e la faccio re-sfrigolare con la piastra, e ripeto tutte le operazioni. Dove non ci sono più passaggi in parallelo ci si aspetta di avere colonie. Per radianti, faccio le stesse operazioni ma faccio delle linee perpendicolari che si irradiano. Nella zona più diluita troviamo le colonie. Il sistema quadranti rispetto al 1° metodo utilizza una sola piastra (pro), svantaggio è che la col