Colorazione di Gram e di Zielh Neelsen

Colorazione di Gram e di Ziehl-Neelsen

Colorazione di Gram

È la più importante colorazione usata in batteriologia. Messa a punto dal patologo danese Christian Gram nel 1884, consente di differenziare i batteri in due categorie, Gram-positivi e Gram-negativi.

La colorazione di Gram si esegue nel seguente modo:

• Dopo aver fissato al calore il preparato su vetrino, si ricopre lo striscio con il primo colorante basico, cristal-violetto, lasciandolo agire per 1 minuto.
• Si allontana il colorante in eccesso e si mordenza la colorazione in acqua con una soluzione di iodio e ioduro di potassio di Lugol, lasciando agire il trattamento per 1 minuto.
• Si tratta poi il preparato con un decolorante (alcol etilico o acetone) per circa 20 secondi.
• Il preparato viene quindi trattato per 1-2 minuti con il secondo colorante di contrasto, fucsina o safranina, facilmente differenziabile (rosso) rispetto al primo colorante usato (viola).
• Si allontana il colorante in eccesso e si asciuga il vetrino.

Al termine della colorazione di Gram, i batteri possono apparire al microscopio ottico di colore viola e sono detti Gram-positivi (Gram+), oppure di colore rosa-rosso e allora sono detti Gram-negativi (Gram−).

Nei batteri Gram+ colorati in violetto, il decolorante non riesce ad asportare il complesso cristal-violetto-iodio, mentre nei batteri Gram− colorati di rosso, vengono decolorati dall'alcol (o dall'acetone) e assumono il secondo colorante rosso di contrasto. La diversa reazione dei batteri alla colorazione di Gram è ascrivibile alla diversa permeabilità degli involucri cellulari, che risulta maggiore nei Gram− (tale da permettere l'azione di asportazione esercitata dal decolorante) e minore nei Gram+.

Si è poi visto che alla Gram-positività e Gram-negatività dei batteri si accompagnano ampie e significative differenze strutturali e funzionali. Ad esempio, vi è una maggiore o minore presenza nella parete batterica del peptidoglicano che nei Gram+ risulta preponderante, così che la colorazione di Gram costituisce un importante carattere differenziale nel mondo batterico.

Colorazione di Ziehl-Neelsen

La colorazione di Ziehl-Neelsen è adatta per l'osservazione al microscopio di batteri acido-resistenti, come il bacillo tubercolare e gli altri micobatteri. La si esegue, sul preparato già fissato, con colorazione a caldo di fucsina fenicata di Ziehl, a cui farà seguito un lavaggio con acqua.

Successivamente si decolora con una miscela acido-alcol e si effettua la colorazione di contrasto con blu di metilene.