Esame a fresco con fissazione e colorazione

Esame a fresco, con fissazione e colorazione

Allestimento di preparati e colorazioni

Per poter osservare al microscopio ottico le dimensioni, la forma e altre caratteristiche come la mobilità e la conformazione delle colonie dei microrganismi batterici e fungini, occorre seguire alcune procedure che consentono il corretto allestimento di un vetrino: distensione del materiale sul vetrino portaoggetti; essiccamento del materiale; fissazione; colorazione. Di queste e altre tecniche importanti e di comune uso in batteriologia, tratteremo qui solo l’esame a fresco, la fissazione e le colorazioni.

Esame a fresco

È un esame idoneo a evidenziare, in particolare, la motilità dei batteri presenti in materiali infetti (escreato, pus, feci, urine ecc.) o in brodocolture. Si esegue depositando una goccia di brodocoltura su un vetrino coprioggetti, che viene poi capovolto su un vetrino portaoggetti speciale provvisto di incavo. Il preparato verrà quindi esaminato al microscopio ottico in campo chiaro con un obiettivo a forte ingrandimento, diaframmando molto al fine di poter vedere i movimenti delle cellule batteriche. Per alcune forme batteriche trasparenti (spirochete) è opportuno l’uso di un microscopio in campo scuro, il solo in grado di evidenziarle. Ma in genere, e specialmente nella batteriologia, la microscopia ottica si basa sull’osservazione con obiettivi a immersione di immagini colorate.

Esame con fissazione e colorazione

Il materiale, prima di essere trattato con coloranti per aumentare il contrasto nei confronti del mezzo circostante e ottenere una migliore osservazione microscopica dei germi, deve essere posto su di un vetrino e poi trattato (allestimento del preparato). Se il materiale in esame è a scarsa densità (sangue, brodocolture), se ne pone direttamente, con un’ansa sterile, una minima quantità sul vetrino, mentre in presenza di materiali più densi (per esempio escreato) si aggiunge una goccia di soluzione fisiologica.

L’allestimento del preparato prosegue con l’essiccamento del materiale depositato, il che si ottiene con l’aria calda della fiamma di un becco Bunsen. A questa fase segue di norma, per i batteri, la fissazione del preparato per far ben aderire il materiale al vetrino, oltre che per uccidere le cellule batteriche (le cellule vive non sono in genere penetrabili dai coloranti); il fissaggio si ottiene o con calore, passando per qualche secondo il vetrino alla fiamma, o usando fissatori chimici come acidi, alcoli, ossidanti e sali di metalli pesanti.

È a questo punto che il preparato è pronto per la colorazione, che si esegue versando sul vetrino alcune gocce del colorante e lasciando che agisca per alcuni minuti. I coloranti utilizzati in batteriologia sono solo basici, perché uniformemente basica è la cellula procariotica. Dopo la colorazione si lava con acqua per allontanare il colorante in eccesso, infine si asciuga all’aria e si osserva al microscopio. In alcune colorazioni (per esempio Gram), dopo il passaggio del colorante si aggiunge una sostanza chimica detta mordente, in grado di legare saldamente il colorante al materiale in esame rendendo il composto insolubile.