Istologia e embriologia umana - fissazione e colorazione istologiche

Introduzione all'istologia

L'istologia è lo studio dei tessuti.

• Tessuti: aggregati di cellule caratterizzati da forma simile, funzioni comuni o integrate tra loro;
• Organo: entità macroscopicamente visibile a occhio nudo. È formato da più tessuti compenetrati tra loro, volti a svolgere una o più funzioni specifiche;
• Apparato: formato da più organi, possono essere diversi e lontani tra loro, ma accomunati da una o più funzioni comuni.

Importanti per l'istologia sono i vetrini per lo studio dei tessuti che sono fissati, sezionati e in seguito resi “leggibili” mediante la colorazione. La fissazione è necessaria perché una volta prelevate dall’organismo le cellule non sopravvivono e variano la loro composizione e struttura. Il sezionamento è effettuato con il microtomo formando sezioni di 5-10 µm.

La colorazione serve per rendere visibili le cellule che altrimenti risulterebbero trasparenti. Il vetrino diviene così leggibile permettendone la comprensione. Negli organismi pluricellulari le cellule isolate sono rare. Di solito esse si associano a formare i tessuti divisi in epiteliali, connettivali, muscolari e nervosi.

Metodi d'indagine istologici

Le cellule dei tessuti possono essere studiate dal punto di vista morfologico, con colorazioni topografiche; biochimico, con colorazioni istochimiche e immunoistochimiche; e funzionale.

Per studiare cellule e tessuti al microscopio occorre sottoporre il materiale biologico a una serie di trattamenti: la fissazione, l'inclusione in un materiale più rigido, il sezionamento al microtomo e la colorazione. Tecniche d'immunoistochimica sono usate in seguito al montaggio sul vetrino. Ci sono tecniche di disidratazione e coverslipping necessarie alla conservazione del preparato ottenuto.

Metodi di fissazione e inclusione di cellule o tessuti

La fissazione è una procedura che permette di preservare la struttura del tessuto da esaminare per i successivi trattamenti, bloccando il metabolismo cellulare e ogni processo vitale portando alla morte istantanea. Prevenendo la degradazione delle cellule dovuta agli enzimi autolitici e evitando l'invasione di microrganismi presenti nell'ambiente.

La fissazione è quindi composta di una serie di procedure con lo scopo di conservare inalterata l'organizzazione di tessuti e cellule, alterandone la struttura il meno possibile mediante un trattamento che rende insolubili alcune strutture e macromolecole cellulari, facendo per esempio precipitare (denaturare) le proteine e altri costituenti chimici della cellula o conferendo stabilità strutturale ai componenti chimici delle cellule attraverso cross-linking.

La fissazione può essere ottenuta:

• Con metodi diversi:
  • Mezzi chimici;
  • Mezzi fisici: caldo, freddo.
• Con modalità diverse:
  • Fissazione per immersione;
  • Fissazione per perfusione (attraverso inoculazione del fissativo nel circolo sanguigno).

La precipitazione determina la comparsa di artefatti di struttura, immagini inesistenti prima della fissazione. I migliori fissativi sono quelli che determinano la precipitazione degli elementi cellulari in piccolissimi granuli come l'acido osmico e la glutaraldeide, che però sono poco penetranti, e le soluzioni di formalina e cloruro di mercurio. Le aldeidi inoltre formano i legami crociati, o cross-linking, con molecole proteiche adiacenti, immobilizzandole e fissando in un reticolo le loro posizioni. Sono usati come fissativi anche acidi come l'acido picrico e acetico, con elevata penetrabilità ma che portano all'addensamento della cromatina, ma soprattutto l'alcool etilico. A volte sono utilizzate miscele di altre sostanze (come la miscela di Susa).

Se il tessuto da esaminare consiste in un singolo strato di cellule, esso è osservato direttamente al microscopio dopo asciugamento o disidratazione con alcol etilico e con o senza colorazione. Se invece il frammento di tessuto da esaminare è troppo spesso, sarà necessario sezionare il campione al microtomo ottenendo sezioni di 3-10 µm utili per l'analisi al microscopio ottico. Per rendere il tessuto sezionabile è necessario un mezzo di inclusione come paraffina, celloidina e gelatina o con materiale plastico che poi solidifica. Questo permette appunto il taglio del campione perché la consistenza di tessuti freschi non lo consente poiché si otterrebbero frammenti o una poltiglia. L'inclusione avviene in seguito a un procedimento di disidratazione e di successiva immersione in solventi del mezzo d'inclusione scelto (xilolo o benzolo per la paraffina, alcool-etere per la celloidina) in modo da permetterne una facile infiltrazione.

Un'infiltrazione con resina epossidica, un materiale più duro, consente l'utilizzo dell'ultramicrotomo che crea sezioni di poche centinaia di nanometri utilizzabili nella microscopia elettronica. Altro metodo molto utilizzato è il congelamento che presenta il vantaggio di essere molto rapido e di consentire una maggiore integrità delle molecole ma che porta al danneggiamento dell'organizzazione complessiva in seguito all'aumento di volume dell'acqua. Tuttavia, più rapido sarà il procedimento, più piccoli sono i cristalli che si formano e minori i danni. Per questo motivo viene utilizzato l'azoto liquido (-196°C) che porta a un congelamento quasi istantaneo. Per sezionare il tessuto congelato è utilizzato il criostato.

Si può dire dunque che la fissazione e l'inclusione consentono da un lato la formazione di sezioni sottili che possono essere colorate e osservate al microscopio, ma possono anche alterare la morfologia cellulare e portano anche alla solubilizzazione di molecole cellulari o tissutali.