Istologia e embriologia umana - fissazione e colorazione istologiche

Il principale tipo di legame tra colorante e substrato è quello ionico. In istochimica esistono anche reazioni che danno

luogo alla formazione di legami covalenti o semicovalenti. Legami deboli non sono in genere alla base di colorazioni

istochimiche.

I coloranti citologici sono soluzioni organiche aromatiche. Questi coloranti si legano alle parti costitutive delle cellule in

maniera molteplice e ancora sconosciuta. La maggior parte dei legami sono elettrostatici, o di tipo salino con i radicali

ionizzabili delle macromolecole dei tessuti: proteine, carboidrati, acidi nucleici, lipoproteine.

Struttura dei coloranti

I coloranti sono sostanze solide cristalline solubili in acqua sotto forma di ioni. Secondo la classificazione di Witt del

1876, le sostanze coloranti hanno un gruppo cromoforo (anello chinolinico o gruppi N-N) e un gruppo auxocromo

costituito o da gruppi aminici e quindi a carica elettrica positiva, o gruppi clorato o solfato a carica elettrica negativa, i

quali possono legarsi a proteine o altri costituenti.

La molecola completa del colorante è quindi costituita da due parti:

 il cromoforo: gruppo di atomi capaci di conferire colore a una sostanza;

 l'auxocromo: gruppo chimico responsabile dei legami chimici tra cromoforo e tessuto.

Nel caso di fluorocromi, utilizzati nella microscopia a fluorescenza, si parla rispettivamente di fluoroforo e di

auxofluoroforo.

Il cromoforo è un composto capace di assorbire radiazioni elettromagnetiche visibili (lunghezze d’onda nel visibile, da

790 nm a 360 nm). Il colore che esso riflette (o trasmette) è correlato a quello assorbito. Ad esempio una sostanza che

appare di colore giallo-arancione ha lo spettro di assorbimento nel blu-violetto mentre una sostanza che appare verde

assorbe le radiazioni del rosso.

L’auxocromo è un gruppo chimico ionizzabile, unito covalentemente al cromoforo. E’ responsabile:

della solubilità in acqua del colorante, della sua ionizzabilità e della capacità di contrarre legami stabili con le sostanze

tessutali. l’auxocromo può essere acido (quando si ionizza

A seconda della carica assunta in soluzione,

come anione) o basico (quando si ionizza come catione). Questa caratteristica genera la fondamentale distinzione dei

coloranti istologici in acidi e basici. Gli auxocromi acidi sono il gruppo solfonico (-SO3H), quello carbossilico, quello

idrossilico mentre gli auxocromi basici sono il gruppo amminico e i suoi derivati, e i metalli. Esistono poi coloranti

neutri formati da due ioni coloranti di carica opposta.

I coloranti basici reagiscono con componenti anioniche (cariche negativamente) delle cellule e dei tessuti. Le

componenti anioniche di cellule e tessuti, dette basofile, comprendono gruppi fosfato degli acidi nucleici, i gruppi

solfato dei GAGs e i gruppi carbossilici delle proteine. Solo un numero limitato di sostanze nelle cellule e nella matrice

extracellulare è basofilo:

 eterocromatina per la presenza dei gruppi fosfati (DNA);

 componenti citoplasmatiche come REG (RNA);

 sostanza extracellulare per la presenza dei gruppi solfato nei carboidrati complessi della cartilagine.

I coloranti acidi reagiscono con componenti cationiche (cariche positivamente) delle cellule e dei tessuti. I coloranti

acidi sono meno specifici e reagiscono con:

 filamenti del citoscheletro;

 miofilamenti;

 fibre della matrice extracellulare.

Ci sono poi le colorazioni, definite d’“insieme”, che non hanno alla base un legame acido-base, ma piuttosto hanno

caratteristiche di affinità tintoriale con un certo componente. Questo fa sì che due coloranti acidi possano, per esempio,

colorare nello stesso campione una struttura acidofila e una basofila.

Nomenclatura dei coloranti

Per colorante s’intende una molecola solubile e fornita di colore proprio, capace di legarsi stabilmente a substrati

cellulari e tessutali.

Tutti i coloranti possono essere suddivisi per la loro origine in:

 naturali animali (es: il carminio ricavato dalla cocciniglia);

 (es: l’ematossilina ricavata dal legno di campeggio);

naturali vegetali

 artificiali (denominati anche colori di anilina).

sono l’ematossilina utilizzata per colorare i nuclei, l’ematossilina

I coloranti di origine naturale ferrica (di

l’orceina

Heidenhain) con sali di Fe, (ottenuta dai licheni) utilizzata per colorare le fibre elastiche, poi carmallume,

paracarminio, picrocarminio (colorano i nuclei in rosso) derivano dalla cocciniglia.

I coloranti di anilina sono divisi in acidi e basici. Quelli basici sono il blu di metilene, verde di metile, violetto di

genziana, tionina, blu di toluidina, safranina e fucsina basica. Quelli acidi sono fucsina acida, blu di anilina, eosina,

orange G e verde luce.

In base al numero di coloranti che sono utilizzati in un metodo di colorazione, possiamo suddividere:

1. Colorazioni monocromiche

2. Colorazioni bicromiche

3. Colorazioni tricromiche

Un esempio di colorazione monocromica è la colorazione di Nissl: prevede utilizzo di coloranti basici come Cresil

violetto, Blu di Toluidina, Blu di metilene. Sostanza di Nissl: è rosso porpora, scuro/blu. Colora di blu violetto i nuclei.

Altro esempio è l’ematossilina ferrica. contiene un colorante nucleare, l’emallume, e un

Esempio di colorazione bicromica è E&E ematossilina-eosina:

colorante citoplasmatico, l’eosina.

Colora i nuclei di blu/nero, il citoplasma di varie tonalità di rosa, le fibre muscolari di rosa scuro/rosso, gli eritrociti di

arancio/rosso e le fibre collagene di varie tonalità di rosa/rosso.

ossidata dell’ematossilina) più

Ci sarà un colorante nucleare composto dall’emateina (forma allumi (in soluzione di

colorazione viene legata a sali complessi di Al, Fe, Cr si ottengono diverse tonalità di colorazione nucleare dall’azzurro

l’eosina

al nero) e un colorante citoplasmatico, (derivato dello xantene e più precisamente della fluoresceina). Di

quest’ultima ne esistono diversi tipi come l’eosina Y (yellowish) e l’eosina G.

Esempio di colorazione tricromica è la colorazione Mallory: è un metodo per la visualizzazione del tessuto connettivo

(fibre collagene, reticolari, cartilagine, ossa) e nuclei. Contiene:

 carbofucsina: un colorante nucleare;

 Orange G: un colorante citoplasmatico;

 blu di anilina: un colorante per connettivo.

Questa colorazione colora le fibre collagene, la cartilagine, il tessuto osseo e il muco di blu, gli eritrociti, la mielina e i

nucleoli di giallo oro e le fibre elastiche di rosa pallido. È la colorazione più utilizzata.

Ci sono poi le colorazioni speciali che sono specifiche per determinati tessuti, per esempio si usa l’impregnazione

l’orceina per il tessuto elastico.

argentica per il tessuto nervoso e

Per la colorazione di preparati istologici non è conveniente usare la miscela è di ematossilina-eosina utile, invece, in

esami citologici. Essendo, infatti, colorazioni d’organo si noterebbero solo i nuclei (in blu scuro), i citoplasmi (colorati

di rosa) mentre tutto il resto risulterebbe trasparente. Si usa quindi la colorazione Azan-Mallory. Questa è molto utile

per esempio per le strutture di collagene, che sono acidofile, soprattutto nelle zone in cui si addensano molto e si

colorano poco con l’eosina risultando quindi poco visibili e trasparenti.

La Azan-Mallory è composta da tre coloranti diversi (tricromica):

 il blu di anilina: colorante acido che si lega al collagene colorandolo di blu. È il miglior colorante per il collagene

a causa della sua maggiore affinità rispetto a qualsiasi altro colorante;

 la fuxina acida: colorante acido che si lega ai nuclei colorandoli di rosso scuro nonostante il loro carattere;

basofilo;

 l’Orange G: si lega al citoplasma colorandolo di rosa.

Impregnazione dei tessuti con sali di metalli pesanti

Un metallo pesante viene assunto da una soluzione di un suo sale o di altro composto e depositato allo stato colloidale

su certi componenti dei tessuti. Avvenuta l’impregnazione il tessuto è sottoposto all’azione di una soluzione riducente,

del tipo utilizzato in fotografia e il metallo è ridotto allo stato elementare. Esempi sono soluzioni di sali di argento, oro,

osmio. Questo colorano le fibre reticolari, il complesso del Golgi e SNC (citoscheletro di neuroni) e SNP (guaina

mielinica).

Metacromasia

Dal punto di vista istochimico, è il viraggio di colore di un colorante istologico quando entra in contatto con certi

componenti tissutali, ovvero quando la colorazione di un componente tessutale è tale che lo spettro di assorbimento del

complesso colorante-tessuto sia tanto diverso da quello del colorante originale da dare una colorazione diversa.

I coloranti che danno metacromasia sono quelli con gruppo tiazinico (blu di toluidina, tionina, azzurro A).

La metacromasia dipende dalla densità di cariche elettronegative presenti sulla superficie del composto e

dall’orientamento delle molecole del colorante.

Il colorante polimerizza sulle macromolecole con cariche periodiche negative (gruppi acidi liberi). Si ottiene una

speciale aggregazione ordinata del colorante, con formazione di nuovi legami intermolecolari tra le molecole adiacenti

di colorante.

Requisiti:

1. Le molecole di substrato devono funzionare come centri di orientamento con i loro gruppi anionici liberi

2. Densità di superficie di cariche negative

3. Presenza di elevata concentrazione di colorante e pH elevato -

Sono metacromatici i glicosaminoglicani solforati in cui la presenza di SO H in unità disaccaridiche comporta una

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distanza intercarica inferiore a 4 Å e quindi una metacromasia forte e stabile.

Metodi istochimici di colorazione

Sono metodi che consistono nell’applicazione alle preparazioni istologiche di tecniche di analisi chimica. Sfruttano le

proprietà di alcuni reagenti per formare con certi composti chimici dei tessuti composti colorati visibili al microscopio.

Lipidi

La colorazione dei lipidi dipende dalla proprietà di assumere certi coloranti solubili nei grassi come il Sudan nero B,

blu Nilo, Sudan III.

Carboidrati

La reazione più nota per evidenziare la presenza di polisaccaridi nei preparati istologici è la reazione PAS o acido

periodico-Schiff. Questa consiste con la reazione di acido periodico (HIO ) con la sezione istologica che porta

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all’ossidazione in gruppi aldeidici i gruppi 1,2-glicol degli zuccheri. In seguito il reattivo di Schiff reagisce

selettivamente con essi. Il reattivo di Schiff o leucofucsina si ottiene trattando la fucsina basica con acido solforoso. La

basica, reagisce con l’acido solforoso trasformandosi in un composto incolore,

parafucsina presente nella fucsina

l’acido bis-N-aminosolfonitrico. Questo reagendo con le aldeidi genera un composto di colore rosso magenta. Questa

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