Citologia, istologia ed embriologia

Allestimento di un preparato istologico

Per poter osservare un campione al microscopio, è necessario che il preparato venga opportunamente allestito attraverso alcune procedure standard. I preparati che vengono dati agli studenti affinché li osservino al microscopio ottico sono per la maggior parte rappresentati da sezioni di tessuti fissati in formalina, inclusi in paraffina e colorati con EE.

La fissazione

È il primo processo che viene attuato per conservare a tempo indeterminato un tessuto e preservare la sua morfologia, la sua struttura e la sua situazione biochimica. È un trattamento fisico o chimico che permette di preservare la struttura del tessuto per i successivi trattamenti. Il campione dovrebbe essere immerso nel fissativo immediatamente dopo esser stato rimosso dal corpo. La fissazione ha il ruolo di bloccare il metabolismo cellulare; prevenire la degradazione delle cellule o dei tessuti a opera di enzimi litici presenti nei tessuti stessi (autolisi); uccidere eventuali microrganismi patogeni, come batteri, funghi o virus, che potrebbero degradare il campione; rendere duro il tessuto attraverso il cross-linking (formazione di legami crociati tra molecole) o la denaturazione delle proteine.

Tra i vari mezzi di fissazione, possiamo annoverare mezzi fisici, tra cui il congelamento, e mezzi chimici, tra cui gli alcoli (alcol metilico o alcol etilico, usati in modo inferiore) e gli aldeidi (gliceraldeide e formaldeide, in particolare il fissativo più comune è la formalina, una soluzione acquosa di formaldeide che viene impiegata a varie diluizioni), che impediscono i processi di degradazione cellulare e assicurano la conservazione. Per poter fissare un campione, è necessario che questo sia ridotto in piccoli frammenti affinché i mezzi di fissazione possano penetrare nel preparato con una maggiore velocità.

L'inclusione

Una volta ridotto e fissato, il campione necessita di essere permeato da un mezzo di inclusione, che, una volta indurito, gli consenta di essere ridotto ancora in frammenti più piccoli dell’ordine dei micrometri (µm). Il tessuto fissato però è, di per sé, troppo soffice per permettere un taglio netto e preciso, dunque l’inclusione viene preceduta da altre pratiche. In particolare, prima di poter includere il tessuto nel mezzo, essendo questo di natura idrofoba, è necessario rimuovere tutta l’acqua con un processo di disidratazione.

Inizialmente il campione fissato viene quindi lavato e disidratato mediante immersione in una serie di soluzioni acquose contenenti concentrazioni crescenti di alcol fino ad arrivare al 100% per rimuovere l’acqua, in cui la paraffina (mezzo di inclusione) non è solubile. In seguito, il campione viene chiarificato per immersione in una soluzione di solventi organici (xilolo o toluolo), che prendono il posto degli alcol e allo stesso tempo sono buoni solventi per la paraffina (chiarificazione).

Dopodiché, il tessuto, così processato, è pronto per essere infiltrato con un mezzo di inclusione che, dopo solidificazione, conferirà al tessuto la giusta consistenza per ottenere sezioni sottilissime. I mezzi di inclusione che si utilizzano in microscopia sono in genere mezzi di natura idrofoba, privi di affinità per l’acqua, come la paraffina. La paraffina è una miscela di idrocarburi saturi che diventa fluida se riscaldata (58°), mentre solidifica a temperatura ambiente. Il campione viene immerso dunque in paraffina fusa in un apposito contenitore e, completata la fase di infiltrazione, viene lasciato solidificare a temperatura ambiente.

Il campione a questo punto presenta la consistenza idonea per essere tagliato in sezioni che hanno uno spessore di circa 3-10 µm (taglio). Per eseguire il taglio, si può utilizzare un microtomo, e tra questi, il meno comune, presente nei vecchi laboratori di istologia, è il cosiddetto microtomo a slitta: questo strumento è costituito da una lama mobile e da un compartimento nel quale viene posto il blocchetto di paraffina, il quale sarà poi soggetto al taglio man mano che l’operatore muove la lama su di esso. Dal punto di vista della sicurezza questa tipologia non era il massimo, dunque venne pian piano sostituita da un’altra più sicura, il microtomo rotativo, in cui il blocchetto di paraffina, contenuto in un braccio mobile, viene mosso dall’operatore mediante una manovella che consente di farlo avanzare verso la lama fissa consentendo così di ottenere sezioni sottili. Le sezioni del blocchetto vengono ad agiate su un supporto di vetro (il vetrino), a cui aderiscono grazie ad un mezzo di montaggio adesivo.

La fissazione chimica non è l’unica che possiamo utilizzare: infatti in situazioni particolari, qualora ad esempio fosse necessario analizzare in breve tempo frammenti di tessuto espiantati nelle sale chirurgiche, non è possibile effettuare la lunga procedura appena descritta, quindi il frammento verrà congelato immergendolo in una soluzione di azoto liquido, che raggiunge temperature di -194°. Questo congelamento rapido evita che i cristalli, formatisi durante il passaggio di stato dell’acqua, principale componente dei tessuti, danneggino la cellula e i vari componenti citologici, cosa che invece avverrebbe se sottoponessimo i tessuti a un congelamento a temperature superiori e con modalità non così veloci.

Il tessuto viene poi sezionato tramite un microtomo, definito criostato, in cui la temperatura è mantenuta intorno ai -20°; pertanto il tessuto, pur non essendo infiltrato con la paraffina, assume la durezza necessaria per essere sezionato dalle lame inserite nella camera del criostato. Questo ci consentirà di allestire delle sezioni, mediante le quali potremo studiare le caratteristiche morfologiche dei diversi tessuti. Le sezioni sottoposte al taglio mediante criostato hanno generalmente uno spessore maggiore.

La colorazione

Le sezioni di tessuto tagliate al microtomo sono così sottili da risultare praticamente trasparenti. Si rende perciò necessario colorare il preparato per poterne osservare i particolari al microscopio ottico, ma, poiché nella microscopia la maggior parte dei coloranti è idrosolubile, è necessario rimuovere dal campione il mezzo di inclusione, dunque la paraffina, e reidratarlo (reidratazione) per evitare che questo possa interferire con la colorazione. La sezione dunque viene deparaffinata, per immersione in xilolo, e reidratata per immersione in una serie di soluzioni acquose contenenti concentrazioni di alcol decrescenti. A questo punto la sezione di tessuto viene posta su un vetrino, ed è pronta per essere immersa nel colorante scelto.

Dopodiché, per rendere la colorazione permanente, stabile e duratura nel tempo, dovremo applicare uno specifico collante (una resina), che viene interposto tra il vetrino in cui è presente la sezione, definito vetrino porta-oggetto, e un vetrino che viene posto al di sopra, definito come vetrino copri-oggetto. Il collante solidifica col tempo e questo ci permette quindi di avere preparati duraturi che possono essere osservati anche con il passare del tempo.

Una tra le più comuni tecniche di colorazione utilizzata in anatomia è quella che prevede l’utilizzo di ematossilina e di eosina, due coloranti che hanno caratteristiche opposte. L’ematossilina è un colorante basico, che colora tutte le strutture acide della cellula in viola-blu, come il nucleo che contiene il DNA e l’RNA immerso nel citoplasma, qualora le cellule osservate siano coinvolte in un’intensa attività di sintesi proteica (assumono per questo motivo il nome di cellule basofile). Vengono definite cellule acidofile invece quelle cellule che non presentano un’intensa attività di sintesi proteica e per questo il loro citoplasma sarà colorato di rosa, a causa dell’eosina, un colorante acido che colora tutte le strutture basiche.

Le sezioni dovranno essere analizzate mediante strumenti specifici che sono i microscopi. I più comuni nei laboratori istologici sono i microscopi ottici di cui naturalmente abbiamo diverse tipologie. Infatti, oltre al microscopio ottico tradizionale in campo chiaro, esistono anche altri tipi di microscopio ottico, come il microscopio a contrasto di fase, il microscopio a contrasto di interferenza differenziale, il microscopio in campo scuro, il microscopio a fluorescenza, ecc. Questi microscopi si servono di sistemi di luci particolari per mettere in evidenza particolari strutture.

Le sezioni di tessuto non sottoposte a ulteriore processazione e non colorate potranno essere osservate con microscopi in campo chiaro e, come vedete nella prima immagine, le caratteristiche citologiche più fini saranno lungi dall’essere osservate. Possiamo identificare nell’immagine un compartimento più interno che va a definire il nucleo e il protoplasma cellulare sarà costituito da tutto ciò che sta al di fuori del nucleo e che viene circondato da strutture che delimitano il citoplasma.

L’osservazione della stessa cellula, se svolta con microscopi ottici con contrasto di fase o con contrasto di interferenza differenziale in campo scuro, non risulta arricchita da ulteriori informazioni rispetto a prima. Questo pone il problema dello studio delle componenti citologiche più fini, stesso problema che possiamo avere nell’ambito di colture cellulari osservate in vivo. L’unico modo per superare il problema è sottoporre i tessuti a colorazione.

Le colorazioni che utilizziamo si avvalgono di coloranti che possiamo classificare in base alla composizione chimica:

• Coloranti basici: tra i più importanti vi sono il blu di toluidina, blu di metilene, ematossilina e azzurro B; essi colorano le strutture cellulari acide, e per questa ragione, l’affinità di tali componenti cellulari per il colorante basico viene detta basofilia.
• Coloranti acidi: tra i più importanti vi sono eosina, alizarina, trypan blu e blu pirrolo; essi colorano le strutture cellulari basiche, le quali sono appunto affini ai coloranti acidi. Questa affinità prende il nome di acidofilia.
• Coloranti neutri: i più importanti sono rosso neutro e verde janus; hanno caratteristiche intermedie tra i coloranti basici e quelli acidi.

Nel momento in cui sottoponiamo i tessuti a colorazione, si è soliti considerare le colorazioni semplici, definite come tecniche che fanno uso di un solo colorante. Talvolta invece è necessario utilizzare coloranti in combinazione tra loro, e si parla per questo di colorazione tricromica. Se il colorante reagisce con un solo tipo di struttura allora la colorazione sarà ortocromatica, se invece un colorante reagisce con più tipi di strutture virando il proprio colore allora si parla di colorazione metacromatica. A tal riguardo infatti, è necessario ricordare che alcuni coloranti basici, quando interagiscono con particolari strutture nei tessuti, cambiano il loro colore normale da blu a rosso o porpora. Tipico esempio è fornito dalla colorazione col blu di toluidina, che in soluzione è blu-violetto, mentre quando entra in contatto con particolari strutture le colorerà in porpora/rosso. La metacromasia è dovuta alla presenza all’interno dei tessuti di polianioni, che causano l’aggregazione delle molecole di colorante, le quali, organizzate così in dimeri o polimeri, modificano le proprie proprietà di assorbimento della luce.

Microscopia

Per osservare i tessuti, è fondamentale l’utilizzo dei microscopi. Il microscopio ottico è il più semplice: è costituito da una base, che contiene la sorgente luminosa, generalmente una lampadina. La luce, tramite un sistema di lenti e di specchi, viene convogliata fino ad un tavolino traslatore, sul quale viene riposto il vetrino che si vuole osservare. La lampada illumina il sistema di lenti che costituisce il condensatore. Fondamentale elemento ottico del microscopio, il condensatore serve a concentrare e regolare la luce emessa dalla lampada, sul campione da analizzare. Per essere efficiente, deve essere regolabile in verticale e in orizzontale. Il diaframma di apertura, di cui il condensatore è dotato, consente di regolare la quantità di luce da trasmettere in base all’obiettivo che si sta utilizzando.

All’apice di un braccio esterno vi è la lente oculare, o una coppia di lenti (nel caso di microscopi binoculari), che permettono l’ingrandimento e l’osservazione del campione riposto nel vetrino fino ad un massimo di 10x. Dopodiché vi sono gli obiettivi, i quali sono montati su un revolver, un supporto girevole, che consente di cambiare facilmente l’obiettivo scelto. Gli obiettivi che utilizzeremo durante le esercitazioni sono 4x, 10x, 20x e 40x. In realtà l’ingrandimento totale è dato dal prodotto tra l’ingrandimento della lente oculare e quello dell’obiettivo (con l’obiettivo da 10x, si avrà un ingrandimento complessivo di 100 volte).

Esistono diversi tipi di microscopi ottici, quelli più evoluti prevedono che l’immagine possa essere raccolta per l’osservazione da parte dell’operatore ma, nel frattempo, possa anche essere rilevata da una videocamera che poi andrà a trasferire l’immagine su uno schermo digitale in modo tale da essere visualizzata, eventualmente possa essere salvata e, magari, manipolata successivamente migliorandola attraverso tecniche specifiche.

Il potere risolutivo è la distanza minima al di sotto della quale non siamo più in grado di vedere due punti come distanti tra loro; quello dell’occhio umano è di circa 0,2 mm. La risoluzione dipende dal rapporto tra il prodotto di una costante per λ (lunghezza d’onda della luce usata – per la luce bianca si assume un valore pari a 0.53 µm), e il prodotto tra n (indice di rifrazione del mezzo) e il seno di theta (apertura numerica). Il valore dell’apertura numerica è solitamente riportato all’esterno di ogni obbiettivo. Più il valore dell’apertura numerica è grande, migliore è la risoluzione.

Il potere risolutivo del microscopio ottico non consente di distinguere distanze inferiori a 0,2 µm; al di sotto di questa distanza i due punti appariranno come un’unica entità. L'osservazione al microscopio ottico permette di vedere le principali strutture cellulari, come il nucleo, i mitocondri e i cromosomi durante la mitosi, ma anche la matrice extracellulare; non consente però di osservare le strutture subcellulari. Gli oggetti più piccoli che si possono vedere con questo tipo di microscopio sono i batteri, che hanno dimensioni medie attorno ai 2 µm.

Nel momento in cui andiamo ad allestire le sezioni di tessuto e le coloriamo con l’EE, potremo identificare le componenti costitutive fondamentali delle cellule: l’ematossilina colorerà in blu-violetto il nucleo e la cromatina, l’eosina invece andrà a colorare il citoplasma in rosa. La colorazione riuscirà anche a definire, a grandi linee, i confini cellulari e limiterà l’area delle cellule stesse, individuando ad esempio le membrane; si potrà quindi definire la morfologia delle cellule. Potremmo quindi capire se le cellule siano più sviluppate in altezza, in larghezza oppure se siano cellule in cui l’altezza e la larghezza si equivalgono.

Altre volte, utilizzando dei coloranti specifici, si possono esaminare componenti distinte, come per esempio il DNA nell’ambito del suo compartimento nucleare, il quale si può definire in seguito alla reazione di Feulgen, durante la quale viene impiegato il reagente di Schiff. Lo stesso reagente è alla base anche della reazione acido periodico-reattivo di Schiff (periodic acid-Schiff, o PAS), la quale tinge i carboidrati e le macromolecole ricche di carboidrati, come le glicoproteine.

La colorazione con ematossilina-eosina è una colorazione panottica, cioè che permette di colorare tutti i tessuti; dobbiamo però tenere conto del fatto che certe componenti macromolecolari, come ad esempio i glicosamminoglicani (GAG) o le glicoproteine che troviamo nell’ambito della porzione apicale delle cellule epiteliali intestinali e nelle cellule caliciformi mucipare, possono non essere colorate adeguatamente perché i componenti glucidici di queste strutture cellulari dimostrano scarsa affinità per l’ematossilina e l’eosina a differenza di tutte le altre cellule che sono comprese nello spessore dell’intestino e che si colorano adeguatamente.

Dalla combinazione della colorazione EE con la colorazione PAS possiamo naturalmente avere un’informazione più completa e più dettagliata su quella che è la morfologia e la struttura complessiva dell’organo che abbiamo colorato.

Il microscopio elettronico non utilizza la luce della lampadina, ma una sorgente luminosa artificiale, ossia un fascio di elettroni. Questo strumento è formato da una sorgente di elettroni, da una lente che svolge la funzione di condensatore magnetico e che serve a indirizzare il fascio di elettroni sul campione che si desidera osservare posto sul retino, da una lente magnetica che ha la funzione di obiettivo, da un’altra lente sempre magnetica che funge da proiettore e che blocca gli elettroni nel campo ottico del sistema, e infine da un elemento che serve a raccogliere le immagini restituite dal microscopio, che può quindi essere una lastra fotografica, una pellicola o uno schermo fluorescente. Tutto il sistema viene mantenuto sottovuoto spinto per evitare che si possano verificare indesiderate dispersioni del fascio di elettroni.