Citologia e Istologia

Corso integrato di citologia, istologia ed embriologia

Indice

• Introduzione
• Allestimento dei preparati
• Tecniche di analisi
  • Microscopia
  • Immunoistochimica
  • Citofluorimetria
• Citologia
  • Membrana plasmatica
    • Struttura e composizione chimica
    • Trasporto di sostanze attraverso la membrana
    • Sistemi di comunicazione cellulare
  • Reticolo endoplasmatico rugoso (RER)
  • Reticolo endoplasmatico liscio (REL)
  • Apparato del Golgi
  • Sistemi di trasporto vescicolare
  • Lisosomi e meccanismi di degradazione
  • Mitocondri
  • Citoscheletro
    • Microtuboli
    • Microfilamenti
    • Filamenti intermedi
  • Specializzazioni della superficie cellulare
  • Nucleo
    • Nucleoscheletro
    • Nucleoplasma
    • Nucleolo
• Istologia
  • Tessuto epiteliale
    • Epiteli di rivestimento
    • Epiteli differenziati
    • Organi di senso
    • Epiteli ghiandolari
      • Ghiandole esocrine
      • Ghiandole endocrine
  • Tessuto connettivo
    • Matrice extracellulare
    • Cellule del tessuto connettivo
    • Tessuti connettivi propriamente detti
    • Tessuto adiposo
    • Tessuto cartilagineo
    • Tessuto osseo
  • Sangue
    • Plasma
    • Cellule del sangue
    • Leucociti
  • Tessuto linfoide
  • Emopoiesi
  • Tessuto muscolare
    • Tessuto muscolare striato scheletrico
    • Tessuto muscolare striato cardiaco
    • Tessuto muscolare liscio
    • Capacità rigenerativa del tessuto muscolare
  • Tessuto nervoso
    • Neurone
    • Organizzazione del tessuto nervoso
    • Rivestimenti del neurone
    • Propagazione dell'impulso tra due cellule
    • Terminazioni nervose periferiche
    • Cellule della neuroglia

Introduzione

Allestimento dei preparati

Per essere analizzati al microscopio ottico o elettronico, i preparati istologici necessitano di alcuni trattamenti che ne facilitano l'osservazione e ne impediscono la degradazione.

Fissazione: Garantisce che il tessuto da analizzare si conservi a lungo. Il metodo utilizzato dipende dal risultato che si vuole ottenere: si distinguono metodi chimici (formalina, liquido di Bouin, acido acetico, alcol, paraformaldeide) e fisici (congelamento).

I fissativi chimici hanno il vantaggio di lasciare inalterate la struttura morfologica e la composizione chimica dei tessuti, ma richiedono tempi relativamente lunghi (circa 12 ore a seconda del fissativo e della dimensione del preparato); congelando il preparato la fissazione è estremamente rapida ma può portare alla creazione di artefatti strutturali dovuti a fratture provocate dalla formazione di cristalli di acqua.

In genere si opta per il congelamento quando si ha necessità di riportare in vita le cellule o di conservare le strutture lipidiche (che si degradano con la maggior parte dei fissativi chimici) e quando è richiesta una certa rapidità nell'analisi. Quando la temperatura scende sotto i -70/-75 °C l'attività enzimatica delle cellule è bloccata quindi i tessuti si conservano meglio.

Disidratazione e diafanizzazione: Il preparato è disidratato tramite passaggi successivi in alcol a gradazione crescente (6-24 ore); questo processo è necessario per procedere all'inclusione con paraffina, che è particolarmente idrofobica. La diafanizzazione (1-6 ore) avviene sostituendo gradualmente l'alcol con un solvente della paraffina (xilolo, benzene, toluene).

Inclusione: Serve a dare al preparato le caratteristiche di durezza e duttilità necessarie al taglio della sezione. Il tessuto disidratato e impregnato di xilolo è immerso in paraffina alla temperatura di 50/58 °C finché non è completamente impregnato (dopo circa 2 ore); poi viene lasciato raffreddare.

Taglio: Il taglio avviene per mezzo del microtomo: si producono sezioni di spessore di circa 5-10 µm, sufficiente per essere attraversato dalla luce del microscopio ottico. I campioni fissati tramite congelamento sono tagliati al criostato: un microtomo raffreddato a -25 °C.

Montaggio: Le sezioni vengono fatte aderire a vetrini trattati con sostanze adesive.

Colorazione: Le sezioni devono essere contrastate per essere osservate al microscopio; in microscopia ottica si utilizzano coloranti idrosolubili. La paraffina è rimossa dal preparato con lo xilolo; quest'ultimo viene eliminato con immersioni in alcol a gradazione decrescente concludendo con acqua distillata (idratazione).

Le strutture cellulari si possono distinguere grazie alla loro diversa affinità per i pigmenti dei coloranti. Si distinguono tre classi di coloranti:

• Coloranti che permettono di distinguere componenti basici e acidi;
• Coloranti che permettono di identificare la componente fibrosa della matrice extracellulare;
• Sali metallici che creano un precipitato visibile al microscopio (utili soprattutto per le cellule del sistema nervoso).

Di seguito i coloranti più utilizzati:

• Blu (ematossilina): regioni acide (basofile), nucleo Ematossilina-Eosina rosa (eosina): regioni basiche (acidofile), citoplasma
• Azzurro: fibre collagene
• Azan-Mallory arancione: fibre muscolari rosso: nuclei
• Blu di Toludina blu: regioni basofile
• Acido Periodico di Schiff (PAS) magenta: glicogeno e molecole ricche di carboidrati blu scuro: nucleo
• Tricromica di Masson rosso: muscoli, cheratina, citoplasma blu chiaro: mucinogeno, collagene
• Orceina marrone: fibre elastiche Weigert blu: fibre elastiche
• Sali d’argento nero: fibre reticolari Ematossilina ferrica nero: striature muscolari, nucleolo, eritrociti
• Per la colorazione differenziale delle cellule del sangue: Giemsa-Wright rosa: eritrociti, granuli eosinofili porpora: nuclei dei leucociti, granuli basofili blu: citoplasma di monociti e linfociti

Le colorazioni che distinguono componenti acide da basiche possono dare risultati diversi a seconda dei tipi cellulari che si osservano: il citoplasma, per esempio, può essere basofilo nelle cellule in cui è ricco di ribosomi.

Tecniche di analisi

Microscopia

Le caratteristiche di un tessuto a livello cellulare possono essere osservate tramite il microscopio. Verso la fine del ‘500, le tecniche di produzione delle lenti consentirono di produrre un primo microscopio ottico.

Microscopio ottico: Sistema composto di lenti che sfrutta la radiazione della luce visibile. Un fascio luminoso viene proiettato attraverso il vetrino e un un sistema di lenti formato da obiettivo e oculare ingrandisce l’immagine e la proietta sulla retina. Ha un limite di risoluzione di 200nm dovuto alla lunghezza d’onda della luce visibile.

Microscopio a contrasto di fase: Sfrutta la radiazione della luce visibile per l’osservazione di cellule vive. La luce colpisce il campione dall’alto e un sistema di lenti converte la differenza di fase tra le onde riflesse in differenze di ampiezza percepibili dall’occhio umano.

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM): Sfrutta un fascio di elettroni con lunghezza d’onda nell’ordine di 0,1-0,2 nm garantendo, quindi, un limite di risoluzione più piccolo rispetto al microscopio ottico. Il ruolo delle lenti è svolto da una serie di campi magnetici che accelerano gli elettroni; questi colpiscono il campione e proiettano un’immagine in scala di grigi che tende al nero nelle zone più dense agli elettroni (in cui, cioè, il colorante devia maggiormente gli elettroni dalla loro traiettoria).

Microscopio elettronico a scansione (SEM): Come il TEM sfrutta un fascio accelerato di elettroni ma in modo tale da formare un’immagine tridimensionale del campione. Ha un limite di risoluzione di circa 1-2 nm.

Microscopio a fluorescenza: I campioni sono colpiti da un fascio di luce ultravioletta (360-430 nm) che eccita il marcatore fluorocromo e provoca l’emissione di luce visibile. In genere queste osservazioni sono condotte al buio per ottenere immagini ricche di contrasto anche con poca fluorescenza.

Microscopio confocale a scansione laser: Sfrutta la luce emessa da un laser e la fluorescenza emessa dai campioni marcati con fluorocromo per ricostruire un’immagine tridimensionale del preparato. In microscopia elettronica si utilizzano metalli pesanti impropriamente detti coloranti.

Immunoistochimica

Tecnica di osservazione che prevede l’utilizzo di anticorpi specifici per la proteina che si vuole ricercare: questi vengono marcati con fluorocromi o coloranti che ne consentono la visione al microscopio.

La produzione di anticorpi prevede lo sfruttamento del sistema immunitario di animali quali capre, conigli, maiali, topi, ratti. Immunizzando un animale per un determinato antigene è possibile ottenere una popolazione policlonale di anticorpi. Una popolazione monoclonale è ottenuta tramite l’immunizzazione di un animale, prelievo delle plasmacellule dalla milza, fusione delle stesse con mielomi (linee tumorali dei linfociti B) per la loro immortalizzazione e clonaggio delle cellule. Le cellule così create sono dette ibridomi e sono utili alla produzione di anticorpi monoclonali.

Questa tecnica è importante negli esami istologici: anticorpi specifici per proteine espresse solo in condizioni patologiche possono determinare la presenza o meno di una malattia. Esempi sono le citocheratine nei tumori di origine epiteliale, desmina nei tumori muscolari, proteina fibrillare acida gliale (GFAP) nei tumori delle cellule gliali.

Citofluorimetria

Tecnica utilizzata per la discriminazione di diverse popolazioni cellulari presenti, per esempio, in un campione di sangue. Le cellule vengono colpite, una per una, da un fascio laser e un sistema è in grado di riconoscere le diverse lunghezze d’onda emesse dai diversi fluorocromi. È una tecnica cell-sorter.

Citologia

È l’analisi della cellula dal punto di vista morfologico e funzionale. Per cellula si intende l’unità fondamentale della struttura dei viventi. In un organismo eucariotico tutte le cellule derivano dalla cellula uovo fecondata e con lo sviluppo si differenziano in otto principali tipi cellulari: epiteliali, di sostegno, contrattili, nervose, germinali, ematiche, immunitarie e ormono-secernenti. Alcune cellule possono svolgere più funzioni e quindi rientrare in più di una categoria.

Composizione del corpo umano

Il corpo umano è chimicamente composto da idrogeno (62%), ossigeno (26%), carbonio (10%), azoto (1,5%) e altri elementi presenti in tracce (P, K, Na, Z, Cl, S, Mg, Fe).

Membrana plasmatica

Ogni cellula è delimitata da una membrana detta cellulare o plasmatica che svolge diverse funzioni:

• Separa la cellula dall’ambiente extracellulare;
• Permette gli scambi e le interazioni con l’ambiente e con altre cellule;
• Ha un ruolo nella regolazione del ciclo cellulare e nella modulazione dei messaggi che vengono dall’esterno.

Struttura e composizione chimica

Al TEM si presenta come un foglietto trilaminare costituito da due strati scuri separati da uno strato più chiaro. È principalmente costituita da fosfolipidi che si orientano, in ambiente acquoso, a formare un bilayer che separa l’ambiente extracellulare dal citoplasma, esponendo ai due ambienti le teste apolari. Ha uno spessore di 7,5-8 nm. Questa struttura è propria anche delle membrane degli organelli citoplasmatici ed è quindi detta membrana unitaria.

Lipidi

È una struttura principalmente fosfolipidica costituita da fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositolo e sfingomielina; la prevalenza di FS e FE nel versante citoplasmatico la rende asimmetrica. I lipidi che la compongono sono sia saturi che insaturi: le catene di questi ultimi infatti presentano dei ripiegamenti che conferiscono alla membrana una certa fluidità (fosse steriche). Nella componente lipidica rientrano anche il colesterolo e i glicolipidi: il primo si inserisce tra gli acidi grassi del bilayer limitandone la fluidità, i secondi hanno la componente polare costituita di una catena oligosaccaridica che sporge esternamente alla cellula. Zone particolarmente ricche in colesterolo formano i rafts lipidici: isole a scarsa fluidità in cui trovano posto clusters proteici che possono spostarsi nel resto della membrana (non costituisce un’eccezione al modello del mosaico fluido).

Proteine

La fluidità della membrana è alla base del modello del mosaico fluido: le proteine di membrana si trovano immerse nel bilayer e si spostano con facilità al suo interno. Ciò è stato dimostrato analizzando i linfociti che, una volta marcate le proteine globulari di membrana, presentano una colorazione uniforme in condizioni normali mentre diventa più densa in una zona se messa a contatto con una cellula tumorale. Le proteine di membrana sono globulari e sono per la maggior parte associate a proteine citoscheletriche; di seguito sono riportate le loro principali funzioni:

• Trasporto di molecole attraverso la membrana;
• Mediatori delle giunzioni intercellulari;
• Proteine con attività enzimatica;
• Recettori per specifici segnali provenienti dall’ambiente extracellulare;
• Mediatori del riconoscimento tra cellule;
• Ancoraggio della cellula alla matrice extracellulare anche per mezzo del citoscheletro.

Si distinguono proteine:

• Estrinseche o periferiche legate da interazioni deboli alle teste polari dei lipidi di membrana: possono quindi trovarsi su entrambi i versanti; fanno parte di questa categoria le proteine legate ad ancora lipidica, che interagiscono con la membrana tramite legami covalenti (es. GPI).
• Intrinseche se penetrano parzialmente o completamente (transmembrana) il bilayer fosfolipidico e sono fissate alle code apolari con legami idrofobici; le proteine transmembrana si distinguono in single-pass o multi-pass a seconda del numero di domini idrofobici che presentano.
• Esistono anche proteine legate ad ancore GPI (glicosilfosfatidilinositolo, un lipide di membrana) localizzate in particolar modo nei rafts lipidici.

Carboidrati e glicocalice

I carboidrati di membrana possono essere associati a lipidi (glicolipidi) o a proteine (glicoproteine o proteoglicani) e sono sempre esposti sul versante extracellulare. Lo strato oligosaccaridico che sporge sul versante extracellulare della membrana costituisce il glicocalice con funzioni di:

• Riconoscimento di ligandi extracellulari;
• Riconoscimento self e non-self;
• Adesione tra cellule di uno stesso tessuto;
• Controllo della proliferazione cellulare;
• Favorisce i processi di assorbimento;
• Protezione meccanica (es. conferisce l’impermeabilità alle cellule della vescica urinaria).

Il glicocalice può determinare una carica elettrica utile, per esempio, agli eritrociti che si respingono tra di loro per evitare il coagulo.

Trasporto di sostanze attraverso la membrana

Importante ruolo della membrana plasmatica è la comunicazione della cellula con l’ambiente extracellulare: ogni cellula necessita di un continuo scambio di molecole da e verso l’esterno per garantire la piena funzionalità della stessa. La membrana plasmatica è caratterizzata da una permeabilità selettiva: la diffusione passiva attraverso di essa è possibile solo ad alcune molecole; altre necessitano di sistemi di trasporto attivo. Può essere definita semipermeabile in quanto molecole di H₂O possono attraversarla.

Trasporto passivo

I meccanismi di trasporto passivo avvengono spontaneamente e sfruttano la differenza di concentrazione di un soluto o la differenza di potenziale tra i due versanti della MP. La velocità di diffusione dipende da questi due parametri. A tal proposito si distinguono diffusione semplice e diffusione facilitata: la prima è mediata esclusivamente da forze osmotiche; la seconda è propria di molecole relativamente ingombranti o cariche che attraversano la membrana tramite proteine vettrici (o carrier o permeasi, glucosio e amminoacidi) e proteine canale (ioni), seppur secondo gradiente.

Attraverso la membrana passano per diffusione semplice:

• Piccole molecole idrofobiche (O₂, CO₂, N₂, …);
• Piccole molecole liposolubili;
• Piccole molecole polari senza carica (H₂O, glicerolo, etanolo, …).

Le proteine carrier sono caratterizzate da un’elevata specificità per il substrato e vanno incontro a saturazione in caso di elevata concentrazione dello stesso. Hanno una struttura a pori oscillanti che consente di accogliere il substrato nel poro prima di cambiare conformazione per liberarlo all’interno della cellula. Le proteine canale consentono un trasporto estremamente rapido e sono selettive per ioni di determinate carica e dimensione; strutturalmente sono canali idrofili che possono non essere sempre aperti: la loro attività può essere regolata da specifici ligandi (es. neurotrasmettitori), dalla differenza di potenziale o da stimoli meccanici.

Trasporto attivo

Avviene contro gradiente di concentrazione e di potenziale elettrico con consumo di energia ricavata dall’idrolisi di ATP. È veicolata da proteine carrier a pori oscillanti ATP-dipendenti. Se l’attività ATP-asica è propria del complesso che attua il trasporto il meccanismo è detto di trasporto attivo primario: appartiene, per esempio, a questa categoria la pompa ionica del sodio e del potassio (Na⁺/K⁺) che esporta 3 ioni Na⁺ ogni 2 ioni K⁺ importati.