Citologia e istologia, appunti dettagliati integrati al libro Citologia&Istologia, Idelson,Gnocchi (compresi di immagini)

Citologia e istologia

Citologia

Osservazione di campioni biologici

Preparazione campioni per poterli poi osservare in microscopia ottica o elettronica. Per studiare gli organuli citoplasmatici è necessario isolarli dal contesto cellulare ottenendo delle frazioni cellulari. Il frazionamento richiede la lisi cellulare e la separazione degli organuli mediante centrifugazione. Per la lisi cellulare si utilizzano sia metodi fisici che chimici (azione meccanica, shock osmotico, sonicazione) che provocano la rottura della membrana plasmatica con conseguente fuoriuscita degli organuli cellulari e la loro sospensione in un mezzo acquoso.

Centrifugazione

Le due più comuni tecniche di centrifugazione sono:

• Centrifugazione differenziale: sfrutta la differente velocità di sedimentazione di particelle di diverse dimensioni e densità.
• Centrifugazione zonale: consiste nella sedimentazione delle particelle in zone ben definite. È usata per la separazione di particelle di forma e densità simile ma di massa diversa.

Analisi morfologica

I due principali procedimenti di analisi morfologica sono: l’osservazione diretta di cellule e di tessuti viventi; l’osservazione di cellule e tessuti fissati con procedimenti che ne conservano le strutture il più possibile simili a quelle viventi. L’occhio umano è stato il primo microscopio esistente: si potevano effettuare, però, soltanto delle osservazioni di tipo macroscopico, poiché l’occhio umano ha un potere di risoluzione limitato a 2mm.

Microscopi

Microscopio ottico

Con l’esigenza di guardare più profondamente sono nati quelli che attualmente vengono chiamati microscopi. Il microscopio ottico consente di vedere una cellula con il suo nucleo. Perché il nucleo, con la quantità di acido nucleico che ha al suo interno, si colora intensamente rispetto al citoplasma e quindi possiamo distinguere se ha uno o due nuclei; è possibile anche definirne la forma. Si possono osservare batteri e mitocondri. Con questo tipo di microscopio è possibile ottenere ingrandimenti che variano da 5 a 1500 volte la grandezza del campione. Le tecniche di illuminazione possibili sono: campo chiaro; polarizzata; campo oscuro; contrasto di fase; contrasto di fase differenziale. Il limite massimo di risoluzione di un microscopio ottico è determinato dalla lunghezza d’onda della luce visibile, che è compresa tra 0,4 micron (violetto) e circa 0,7 micron (rosso scuro). Il massimo potere di risoluzione è di 0,2 micron.

Componenti di un microscopio ottico

Tutti i microscopi odierni, detti composti, hanno 2 lenti accoppiate ad una certa distanza (l’obiettivo e l’oculare) e permettono la formazione di un’immagine capovolta ed ingrandita. Ogni microscopio ottico deve essere in possesso di: stativo con tavolino portaoggetti; tubo (struttura che contiene i sistemi di ingrandimento e collegamento tra obiettivi ed oculari); porta obiettivi (la parte terminale inferiore del tubo del microscopio sagomata in maniera particolare costituisce la torretta girevole o “revolver” porta obiettivi); ottica (obiettivi ed oculari). Sugli obiettivi è inciso il tipo di correzione applicata, oltre ai dati che li caratterizzano, cioè ingrandimento, lunghezza del tubo e spessore richiesto al vetrino coprioggetto e la sua apertura numerica. Alcuni obiettivi lavorano a secco, mentre altri immersi in olio (in genere di cedro) che permette l’ottenimento di ingrandimenti più elevati grazie alla riduzione dell’interferenza dell’aria.

Microscopio elettronico

Il microscopio elettronico è possibile individuare tutti i costituenti cellulari, le sequenze, acidi nucleici, organelli, ecc. È così chiamato perché questa tecnologia utilizza gli elettroni, come fonte luminosa, e permette di ottenere una maggiore risoluzione rispetto a quanto ottenibile con la microscopia ottica. I microscopi elettronici sono fondamentalmente di due tipi:

• Microscopio elettronico a trasmissione (TEM);
• Microscopio elettronico a scansione (SEM).

Le differenze tra i due risiedono nelle modalità con cui il fascio elettronico è controllato per formare l’immagine finale. I microscopi elettronici sono caratterizzati, in qualunque caso, da: un sistema di vuoto che rimuove l’aria (colonna); un sistema per fornire corrente alle lenti; la colonna che consiste di una serie di lenti elettromagnetiche allineate una sull’altra. Ogni avvolgimento elettrico è schermato da campi magnetici esterni e raffreddato da un sistema ad acqua refrigerata. In cima alla colonna è posta la camera che genera gli elettroni, o “cannone elettronico”. Questo è rappresentato da un filo di tungsteno riscaldato e dagli elettrodi associati. In un TEM la camera dove viene posto il campione è posizionata circa a metà colonna. In un SEM il campione è posto alla base della colonna stessa. Nel TEM il materiale sensibile è introdotto alla base della colonna e viene direttamente esposto agli elettroni nel vuoto. Nel SEM, l’immagine visibile è prodotta su di uno schermo con tubo catodico, che può essere posizionato lontano dal microscopio stesso. Un terzo tipo di microscopio elettronico classico, lo Scanning (STEM), riunisce insieme le caratteristiche del TEM e del SEM.

Risoluzione

La risoluzione ottenibile con i microscopi elettronici è di circa 1 nm per il TEM; 10 nm per il SEM; 1,4 nm per lo STEM. Potere di risoluzione è la capacità del microscopio di vedere due punti adiacenti nel campo visivo come entità distinte. d è la distanza minima dalla quale due punti del campione devono essere separati per essere risolti, λ è la lunghezza d’onda della luce (450 nm per la luce blu), n è l’indice di rifrazione del mezzo, presente tra il campione e le lenti dell’obiettivo, α è uguale al semiangolo del cono di luce che entra nell’obiettivo. Apertura numerica (A.N) è la capacità che ha l’obiettivo di captare la luce senza che vi siano eccessive interferenze. Migliore è il valore dell’apertura numerica, migliore sarà l’obiettivo.

Colorazioni vitali e sopravitali

Colorazione vitale o intra vitam: coloranti vitali possono essere iniettati nell’animale intero. Colorazione sopravitale: un pezzo di tessuto od organo appena prelevato dall’animale viene immerso nella soluzione colorante. Una colorazione analoga si può ottenere in vitro quando al mezzo di coltura delle cellule si aggiunge il colorante. Le più ampie applicazioni in citologia ed istologia prevedono il ricorso a preparati fissati, sezionati, per risultare sottili e trasparenti, ed infine colorati, per essere perfettamente visibili. Esistono delle tappe nelle metodiche convenzionali di preparazione dei campioni biologici che prescindono dal tipo di microscopio usato. Con particolari tecniche (citochimica, istochimica e immunocitoistochimica) si possono colorare rispettivamente le cellule ed i tessuti in modo da evidenziare alcuni costituenti specifici di un tessuto o di una cellula ottenendo così informazioni sulla presenza e localizzazione di macromolecole intra ed extracellulari sia in MO che in ME.

Preparazione dei campioni biologici per lo studio della morfologia cellulare

• Fissazione
• Disidratazione e diafanizzazione
• Inclusione
• Sezionamento/affettatura
• Colorazione

Come prima cosa bisogna effettuare un prelievo ed impedire la degenerazione dei tessuti che è anche causa di un’alterata visione della struttura di un tessuto. Per cui si applica un procedimento che si chiama fissazione che consiste nell’immobilizzazione istantanea di tutti i componenti molecolari e macromolecolari dell’architettura cellulare in uno stato il più possibile simile a quello vivente (stabilizzazione), allo scopo di prevenire alterazioni della struttura protoplasmatica conseguenti alla morte della cellula. A tal fine, si agisce sui componenti proteici cellulari, inattivando gli enzimi per impedire fenomeni di autolisi. La fissazione può essere di tipo chimico o fisico.

Fissazione chimica

I fissativi chimici si dividono in:

• Fissativi che coagulano le proteine (es. alcol etilico);
• Fissativi che non coagulano le proteine e pertanto le mantengo stabili, come aldeidi e acido osmico.

Questa differenza è importante per il livello di indagine: se si deve effettuare un’indagine in MO possono essere utilizzati i fissativi coagulanti, per un’indagine ultrastrutturale vanno, invece, utilizzati i fissativi non coagulanti, come la formaldeide, che mantengono le proteine stabili creando solo dei legami in modo da formare una rete che le blocca nella loro posizione. I fissativi più comunemente usati in MO sono la formalina ed il liquido di Bouin. Le modalità di ripiego dei fissativi chimici possono essere per immersione, per fusione e per mezzo vapore.

Fissazione fisica

Sono tecniche molto laboriose che permettono di esaminare il campione senza alterarlo chimicamente (fissazione) o fisicamente (disidratazione, impregnazione con resina, essiccamento). Il campione è congelato rapidamente (generalmente con Freon), portato rapidamente all’interno dell’apparecchiatura di Freeze-fracturing (FF) e mantenuto alla temperatura di lavoro di circa -110°C sotto vuoto. Una buona fissazione dipende dalla rapidità con cui avviene, dalla velocità di penetrazione del fissativo e dallo spessore del tessuto da fissare. È necessario rispettare un esatto rapporto volumetrico tra fissativo e tessuto (circa 30:1) sia perché alcuni fissativi si esauriscono durante il processo della fissazione, sia perché la fuoriuscita dal tessuto di umori e di acqua comporta una diluizione del fissativo.

Le cellule al loro interno hanno molecole proteiche e lipidiche, in alcune cellule, poi, come per esempio quelle della corteccia surrenale, o dell’ovaio, prevalgono le molecole di natura lipidica su quelle di natura proteica. Quindi, succede che se le proteine resistono agli alcol, i lipidi non lo fanno, di conseguenza in un tessuto che ha avuto tutto il procedimento di fissazione con disidratazione in alcol, i lipidi appariranno nella cellula come dei buchi la goccia lipidica che è delimitata dalla membrana, conserva la membrana ma l’interno se ne va. Quindi, possiamo dire di osservare una struttura citoplasmatica fortemente vacuolata. Se si vogliono conservare questi lipidi, si può utilizzare il freddo: si congelano, si tagliano con un microtono e si osservano.

Fissazione e lavaggio

Dopo la fissazione, è necessario avere dell’acqua distillata per effettuare dei risciacqui. Dopodiché si può procedere con la disidratazione essa è necessaria perché togliendo l’acqua è possibile conservare le strutture in modo migliore e si possono stabilizzare i contenuti citoplasmatici. La disidratazione si ottiene usando soluzioni alcoliche a concentrazioni crescenti (50, 70, 95 e 100°) che permettono la graduale sostituzione dell’acqua con l’alcol evitando il raggrinzimento del campione. È importante considerare che un tempo di disidratazione molto lungo potrebbe causare un’estrazione dei lipidi dal tessuto, poiché questi sono solubili in alcol. Per la MO segue il processo di diafanizzazione (il pezzo di tessuto diventa trasparente) ossia il campione viene immerso in un solvente miscibile con il mezzo di inclusione.

Inclusione dei campioni

Per poter procedere al sezionamento dei campioni è necessario che questi siano inclusi in una sostanza sufficientemente rigida e plastica da permettere il taglio (microtomia) in sezioni sottili.

Inclusione in paraffina

A seguito della diafanizzazione, si procede all’infiltrazione ed inclusione in paraffina. Quest’ultima è il mezzo di inclusione per eccellenza per la MO. È una miscela di idrocarburi ad elevato peso molecolare, solida a temperatura ambiente, e con punto di fusione tra 40-60°C, è insolubile in acqua e alcol ma è solubile in solventi come xilolo e toluene. Prima dell’inclusione in paraffina, i campioni devono essere sottoposti alla fase di infiltrazione, durante la quale i solventi della paraffina vengono sostituiti con quest’ultima. Questa fase viene effettuata ponendo i campioni in paraffina fusa ed in stufa termostata per un certo tempo (2-24 ore) sufficiente a far penetrare la paraffina in tutte le strutture tissutali. Dopo l’infiltrazione il tessuto viene disposto in una formella, orientato e ricoperto di paraffina fusa, e lasciato solidificare a temperatura ambiente. Con la solidificazione della paraffina si ottiene un blocchetto di inclusione pronto per essere tagliato al microtono (microtomia) in sezioni sottili che possono raggiungere anche i 4 micron di spessore.

Inclusione in resina

È necessaria per il TEM poiché ci sono lenti magnetiche che direzionano gli elettroni ad attraversare il campione; di conseguenza, è necessario che il campione da osservare sia preparato in modo tale da poter essere tagliato in sottilissime e resistenti sezioni che permettono agli elettroni di attraversarlo. Per l’ottenimento di questa condizione, il campione deve essere incluso in un mezzo dotato di notevole resistenza termica ed elevata inerzia chimica e con caratteristiche fisico-chimiche tali da permettere un agevole sezionamento ultrasottile (50-90 nm). I blocchetti di resina dovranno avere forma a punta, sia perché le lame sono piccole, sia perché in tal modo si riduce la probabilità di introdurre artefatti durante il taglio. La resina ancora liquida viene messa nella capsula facendo attenzione che il campione vada a finire sul fondo (se sono cellule si centrifuga).

Sezionamento

Il campione incluso in paraffina può essere sezionato mediante microtomo in sezioni sottili dello spessore di circa 4-10 micron. Il microtomo è uno strumento di precisione che è provvisto di una lama e di un braccio su cui si monta il blocchetto da sezionare. Lo strumento utilizzato per preparare le sezioni da osservare al TEM è chiamato ultramicrotomo. Le sezioni fini, dello spessore di circa 0,5-1 micron, ottenute vengono raccolte su particolari supporti detti retini o griglie e colorati direttamente. Le lame utilizzate in ultramicrotomia sono di due tipi: lame di diamante e lame di cristallo dette, comunemente, “di vetro”. Il taglio permette di ottenere sezioni semifini dello spessore di 1 micron ed ultrafini dello spessore di 50 nm.

Montaggio e colorazione

Il montaggio delle sezioni di materiale incluso in paraffina consiste nel porre le sezioni ottenute al microtono su vetrini pretrattati con materiale che crea una pellicola adesiva. I vari componenti cellulari e tissutali per poter essere osservati al MO devono essere colorati. In MO i coloranti, essendo generalmente idrosolubili, formano legami elettrostatici di tipo salino con le macromolecole ionizzate.

Coloranti

I coloranti naturali sono di derivazione animale (carminio) o vegetale (ematossilina, orceina), quelli artificiali sono generalmente composti organici della serie aromatica, nei quali si trovano sempre determinati raggruppamenti atomici, noti come cromofori, dai quali dipende il colore. Distinguiamo:

• Coloranti acidi: vanno a colorare le componenti strutturali che sono cariche positivamente, dette acidofile;
• Coloranti basici: possiedono un gruppo cationico che forma un ponte salino con un costituente tissutale carico negativamente detto basofilo. Fra questi: ematossilina, blu di toluidina, tionina, azzurro B, blu di metilene.

Esistono, inoltre, le sostanze mordenzanti che agiscono da intermediari tra il colorante ed il tessuto; ne è un esempio l’alluminio. In genere, dopo la colorazione, è necessario eliminare il colorante non legato specificamente al tessuto per mezzo di lavaggi ripetuti in acqua, alcol, ecc. In TEM si può usare anche la colorazione negativa, un sistema di colorazione elettivo per l’osservazione di materiale non incluso o materiale fresco (virus, molecole, batteri, liposomi, ecc.) ove del metallo pesante si deposita sulla griglia porta-campione attorno all’oggetto. I coloranti più in uso sono: l’acido fosfotungstico o l’acetato di uranile. Particelle minute come cellule, batteriofagi o batteri sono mescolati con soluzioni di sali di metalli pesanti e adagiati sui retini preventivamente ricoperti di un film di formvar che serve come supporto. Il campione e la soluzione salina vengono fatte asciugare e osservate al microscopio. Il metallo pesante, che circonda il campione organico, assorbe gli elettroni, mentre gli elettroni che passano attraverso il campione organico formano un’immagine “colorata in negativo”. I campioni così preparati non possono essere conservati.

Metodi di colorazione citochimiche e istochimiche

Per le ricerche istochimiche sono state messe a punto negli ultimi anni un’ampia serie di tecniche che permettono di trasformare in prodotti colorati i vari componenti chimici della cellula, in modo che possano essere visibili al MO. Questi metodi si basano sull’attività degli enzimi, su reazioni chimiche e su fenomeni chimico-fisici associati ai componenti che si vogliono evidenziare. L’avvenuta reazione si evidenzia con la formazione di un precipitato insolubile che conferisce una certa colorazione. In alternativa, si possono usare prodotti fluorescenti. Con le reazioni istochimiche possono essere evidenziati anche gli enzimi. In questo caso le sezioni sono incubate con un substrato specifico per l’enzima. L’enzima presente nel tessuto reagirà con il substrato dando luogo ad un prodotto insolubile e colorato. La localizzazione di proteine, carboidrati o componenti particolari delle cellule può avvenire, oltre che per reazioni di cito (isto) chimica, anche utilizzando anticorpi specifici in grado di legarsi specificamente.