Citologia e Istologia - Appunti

Appunti istologia

Lezione 1 | Data 01/10

Istologia

I primi studi sono stati condotti nel 1520 da Falloppia. Come mezzo di indagine è stata utilizzata la dissezione di un cadavere: qui si notò che vi erano elementi propri che si ripetevano. Falloppia ne identificò 13 mentre Bischa 21.

I tessuti istologici sono semplicemente quattro, organizzati in diversa maniera: epiteliale, connettivo, muscolare e nervoso. Il sangue può essere considerato connettivo o tessuto a sé.

Hook nel 1665 introdusse il limite di cellula (sughero). La prima definizione riguardava una cavità vuota del sughero. Nel 1830 Swan formulò la prima teoria cellulare: unità fondamentale dell'organismo. All'interno di un tessuto però troviamo anche la matrice extracellulare interposta alle cellule.

Kenniker nel 1815 dimostrò che tutte le cellule derivano dalla cellula uovo. Le prime cellule sono tutte uguali tra loro e successivamente, si avrà prima una differenziazione di tipo morfologico e poi di tipo funzionale. Anche un organo passa per queste due tappe.

Cellula

All'interno della cellula è presente il protoplasma. In un organismo unicellulare troviamo tutte le caratteristiche del protoplasma ma non sono particolarmente sviluppate. Nell'uomo le caratteristiche del protoplasma non sono presenti in tutte le cellule ma troviamo casi in cui sono più o meno sviluppate: nelle cellule nervose, per esempio, è sviluppata l'eccitabilità. Le cellule nervose sono situate in zone dell'organismo molto protette siccome non hanno capacità mitotiche. Tuttavia, tramite l'assone, possono percepire gli stimoli esterni. L'eccitabilità è quindi la capacità di trasmettere l'impulso nervoso. A livello di corteccia cerebrale, si ha una risposta all'impulso e lo stimolo diventa cosciente.

La contrattilità presente nelle cellule delle fibre muscolari è un'altra caratteristica del protoplasma. La cellula in questo caso si presenta allungata. La contrazione del muscolo, passando per il tendine, determina il movimento del segmento scheletrico. La secrezione è caratteristica degli adenomeri delle ghiandole. Questo secreto viene riversato all'esterno dai dotti escretori. L'assorbimento, invece, avviene nelle cellule intestinali per poi riversare nell'albero sanguigno o linfatico le sostanze nutritive adeguatamente filtrate e degradate.

Organismo pluricellulare

Grazie alla specializzazione dei tessuti si ha un vantaggio. Anche all'interno della cellula si ha una specializzazione di organelli: ogni distretto ha una specifica funzione.

Reazioni

All'interno della cellula si hanno reazioni di sintesi (anaboliche) e reazioni di scissione (cataboliche). Una reazione di sintesi è per esempio quella della sintesi delle proteine: all'interno del citoplasma sono presenti amminoacidi liberi che vengono uniti; la reazione di scissione più importante è quella del glucosio (respirazione cellulare). Questo processo forma piccole molecole energetiche (ATP) che, per la loro dimensione, riescono a muoversi liberamente all'interno della cellula.

Composizione

75-85% H₂O, 10-20% Proteine, 1-2% Lipidi. Gli elementi principali sono H, O, C, N.

Organizzazione

La più semplice organizzazione vivente sono i virus, poi i procarioti, poi le cellule eucariotiche. La differenza tra virus e cellule procariotiche è che i primi non sono capaci di vita autonoma e non possono replicarsi autonomamente: per potersi replicare, sfruttano il corredo genetico di eucarioti o procarioti. La cellula procariote non possiede un nucleo delimitato da membrana al contrario della cellula eucariote.

Dimensioni

Le cellule hanno diametri medi intorno ai 20µm per cui occorre un microscopio ottico per il loro studio. Le strutture cellulari sono dell'ordine dei nanometri. L'Amstrong è la decima parte del nm. Un atomo misura 1-2Å. L'occhio umano può vedere fino a 100µm (0,1mm) oltre si utilizza il microscopio. Con il microscopio ottico si osserva la sovrastruttura mentre con quello elettronico l'ultrastruttura.

Laboratorio

Si effettuano studi sulle sezioni istologiche. Lo scopo dell'istologia è l'osservazione di tessuti vivi ma la maggior parte dei tessuti, per essere studiati, necessitano di una fissazione. Lo studio delle cellule vive avviene tramite colture cellulari.

Al microscopio ottico lo spessore del campione non deve superare i 4-10µm per lasciar passare il fascio luminoso. Al microscopio elettronico la sezione deve essere molto più sottile (60nm) in quanto deve oltrepassarla un fascio di elettroni. A tal proposito si utilizza un microtomo. Per preparare un vetrino istologico occorre preparare il campione: prelevare, fissare, includere, tagliare e colorare. Il passaggio più importante è la fissazione che ha lo scopo di preservare il campione il più a lungo possibile. Questo può essere eseguito tramite mezzi fisici (congelamento) o tramite mezzi chimici. La fissazione deve essere eseguita con rapidità in quanto la degenerazione delle strutture cellulari avviene subito dopo l'espianto. La fissazione in ogni caso provoca artefatti. L'inclusione prevede che il campione venga imbevuto di una sostanza che lo renda rigido al fine di consentire il taglio. Per l'inclusione si usa la paraffina, che è allo stato liquido dai 40°C ai 60°C. I fissativi sono tutti soluzioni acquose che devono essere lavati con soluzioni tampone. Per consentire alla paraffina di penetrare all'interno del campione, occorre disidratare con alcool. Successivamente l'alcool dovrà essere tolto o con benzolo o con xilolo, che sono solubili sia in alcool che in paraffina. I campioni vanno tolti dallo xilolo e messi in paraffina che a temperatura ambiente solidifica. Da qui, il microtomo seziona.

Lezione 2 | Data 02/10

Microtomo

Strumento che viene utilizzato per produrre sezioni istologiche. Al girare della manovella, il blocchetto incluso in paraffina, avanza di qualche µm e impatta contro la lama di acciaio. Le sezioni vengono tagliate in sequenza per ricostruire una sezione tridimensionale e conoscerne il volume. Una volta tagliate, le sezioni vengono fatte aderire ad un vetrino e si esegue la colorazione.

Colorazione

Consente di evidenziare alcuni costituenti della cellula. I coloranti si dividono in acidi (che presentano cariche negative libere) e basici (cariche positive libere). Prima di colorare occorre togliere la paraffina con lo xilolo, poi lavare con l'alcool e successivamente con l'acqua. A questo punto si può colorare la sezione poiché il colorante è solubile in acqua. Un colorante acido formerà legami con strutture con cariche positive. Questi costituenti li consideriamo quindi acidofili. Viceversa, una colorazione basica interagisce con componenti detti basofili. Un colorante comune in laboratorio è l'ematossilina (basica) ed eosina (acida). L'ematossilina ha un colore blu-viola. L'eosina ha un colore rosa-arancio pallido. Un'altra tecnica si chiama Azan-Mallory. Anche qui si utilizza un colorante basico (azocarminio rosso) e un colorante acido (blu di anilina). Il nucleo è la componente basofila classica della cellula. Le fibre collagene sono invece acidofile.

Osservazione

Una volta colorata, la sezione va ricoperta da un vetrino coprioggetti e osservata al microscopio ottico. Esso presenta tre tipi di lenti: condensatore, obiettivi e oculari. Gli obiettivi ingrandiscono da un minimo di 4 a un massimo di 100 volte. La lente che mostra i particolari è l'obiettivo. Il potere risolutivo di un microscopio ottico è la distanza a cui due punti possono essere osservati come due punti distinti. Nel microscopio ottico è circa 0,25µm. L'ultrastruttura rappresenta tutte le strutture più piccole di 0,25µm.

Sangue

Non viene utilizzata la tecnica della sezione ma quella dello striscio per osservare gli elementi corpuscolati. I globuli rossi, nello striscio si presentano con il centro più chiaro in quanto hanno forma di dischetto biconcavo. I globuli rossi maturi non hanno nucleo.

Microscopio elettronico

Il potere di risoluzione del microscopio elettronico è 2Å ma in pratica è 10-15Å. Il limite è dato dallo spessore delle sezioni osservate. Per crearle occorre utilizzare l'ultra-microtomo che però non riesce a dare sezioni inferiori ai 600Å. La lama può essere a filo di vetro o a filo di diamante. Per creare sezioni così sottili, occorre includere i materiali in cere più dure della paraffina. Sull'ultra-microtomo è presente un binoculare che permette all'operatore di osservare. Le sezioni vengono fatte poggiare su un vetrino che ha la stessa funzione di un vetrino portaoggetti. Le sezioni prima di essere osservate devono essere "colorate" nel senso di aumentare il contrasto della sezione. Si usano citrato di uranile e piombo che vanno a precipitare su alcuni elementi della cellula. Questo serve ad aumentare il contrasto dell'immagine.

Di microscopi elettronici esiste quello a trasmissione (TEM) e quello a scansione (SEM). Esso è formato da una colonna in cui sono montate lenti: condensatore, proiettore e obiettivo. Per funzionare il microscopio ottico occorre che abbia una condizione di vuoto al suo interno. Si lavora con una tensione variabile da 60 a 80kW. Il microscopio elettronico funziona grazie a un fascio di elettroni, senza l'ausilio di luce. Gli elettroni originano da un filamento di tungsteno posto in testa (catodo). Le lenti del microscopio elettronico sono bobine elettromagnetiche. A circa metà cilindro è posizionata la sezione. Il microscopio elettronico da solo immagini in bianco e nero. Gli elettroni che riescono ad attraversare la sezione formano dei punti bianchi (elettrontrasparenti), viceversa si avranno dei punti neri (elettrondensi). Alcuni elettroni vengono assorbiti con calo della qualità dell'immagine. La sezione si colora con metalli pesanti al fine di avere diverse gradazioni di grigio ed aumentare la qualità.

SEM

Più recente del TEM. Anche in questo caso abbiamo il vuoto per consentire il passaggio degli elettroni. Con il SEM possiamo vedere unicamente i particolari esterni della cellula, interagendo con il pennello di elettroni della superficie. Non abbiamo nessuna informazione sull'ultrastruttura interna. Anche in questo caso le immagini sono in bianco e nero. Le tecniche più moderne di colorazione sono quelle di immunoistochimica e immunocitochimica che permettono di evidenziare una determinata proteina o un determinato acido nucleico.

Forma cellulare

Esistono cellule a forma fissa come gli spermatozoi o le cellule nervose e cellule a forma mutabile, come le cellule del tessuto connettivo. La loro forma è determinata dalla loro funzione. La forma della cellula è determinata dal citoscheletro. All'inizio le cellule sono tutte uguali ma poi si differenziano, a seconda della loro funzione, influenzate, tra l'altro, dall'ambiente cellulare esterno. Per esempio, le fibre connettivali, fanno modificare la forma delle cellule (anche con la matrice). Le cellule più piccole sono circa 4µm mentre le cellule più grosse sono i gameti femminili ed i neuroni. Le dimensioni delle cellule di una stessa linea, non variano in specie diverse o nella stessa specie. Levi, però, dimostra che i neuroni non seguono questa tendenza: essi variano proporzionalmente alla mole dell'individuo di appartenenza. Essi variano dunque in funzione del territorio di innervazione.

Lezione 3 | Data 03/10

Dimensione

I miociti del cuore possono aumentare di volume in condizioni patologiche (ipertrofia). Anche le cellule della parete dell'utero aumentano di dimensione in caso di gravidanza. Le dimensioni vengono controllate come rapporto nucleo/plasmatico: il nucleo deve avere un volume tale da controllare gli eventi del citoplasma. In particolari stadi del ciclo cellulare il volume del citoplasma può aumentare senza far variare la dimensione del nucleo. Questo è un segno che indica una mitosi imminente.

Altro rapporto è quello superficie/volume: cellule di grosse dimensioni hanno un rapporto superficie/volume svantaggioso mentre cellule di piccole dimensioni sono avvantaggiate. Nel neurone dobbiamo tener conto degli assoni e dei dendriti che aumentano notevolmente la superficie della membrana plasmatica. Altra eccezione la troviamo nelle cellule polinucleate che possiedono un'ampia quantità di citoplasma. Queste cellule si possono formare tramite attività sinciziale e sono dette sincizi; una seconda via è quella plasmodiale con la formazione di plasmodi. Il sincizio si forma tramite la fusione di più cellule. Nella modalità plasmodiale si attuano delle divisioni atipiche che portano alla scissione del nucleo ma non del citoplasma. Nel sincizio e nel plasmodio il rapporto nucleo/citoplasma rimane costante. Un esempio di sincizio sono le fibre muscolari striate.

Membrana plasmatica

Gli studi vengono condotti seguendo una linea morfologia, una biochimica ed una fisiologica. I primi modelli di membrana sono stati presentati nel 1902. Quello che utilizziamo oggi è stato proposto nel 1972. Lo spessore della membrana plasmatica varia da 7,5 a 10nm ed è quindi impossibile vederla al microscopio ottico. La membrana plasmatica delimita la cellula ma consente, allo stesso tempo, di attuare scambi con l'esterno. Questi ultimi vengono detti scambi controllati dalla membrana poiché la membrana è semipermeabile e non consente un passaggio libero di molte molecole. La membrana presenta siti di attacco per ormoni e farmaci in modo da riuscire a far variare il metabolismo cellulare in caso di riconoscimento di queste sostanze. Probabilmente controlla anche la divisione cellulare e l'espressione genica. Quando ci sono dei ruoli non chiari a livello cellulare, si fa riferimento alla membrana plasmatica. Una funzione importante della membrana plasmatica sono le funzioni extracellulari, tra le quali vi sono le giunzioni GAP che mettono in comunicazione il citoplasma di una cellula con quello della cellula adiacente. All'interno del citoplasma, tutti gli organelli sono delimitati da una membrana che infatti tende ad isolarli (eccetto i ribosomi).

Semipermeabilità

La membrana permette il passaggio del solvente ma non del soluto. Se la cellula viene messa in un ambiente ipertonico, la cellula si secca poiché la membrana permette il passaggio unicamente all'acqua dall'interno all'esterno della cellula. Viceversa, con ambiente ipotonico, la cellula si gonfia incamerando acqua e diventa turgida. Da qui può andare in lisi. L'ambiente cellulare deve quindi essere isotonic con l'ambiente intracellulare, per evitare modificazioni strutturali.

Fantasmi

Membrana di globuli rossi mandati in lisi per immersione in ambiente ipotonico. La membrana plasmatica non tollera margini liberi per cui, dopo la lisi, essa si risalda. La scelta ricade sui globuli rossi (per lo studio della membrana), poiché dopo la lisi al loro interno rimane unicamente emoglobina e risultano quindi molto comodi.

Chimica

Circa il 60% è formato da fosfolipidi. Una buona parte è formata da proteine che consentono di adempiere particolari funzioni (importanti sono le proteine transmembranali). Le proteine variano a seconda della membrana (mitocondriale, plasmatica). Terzo costituente (2-3%) è rappresentato dagli zuccheri. Le percentuali possono variare a seconda della tipologia: nella membrana mitocondriale sono più abbondanti le proteine.

I fosfolipidi sono costituiti da una molecola di glicerolo che attacca due catene di acidi grassi (uno saturo e uno insaturo che viene rappresentato in genere piegato). La testa è invece composta da un gruppo fosfato. La testa è idrofila mentre le code sono idrofobe. Questa qualità anfipatica, caratterizza la disposizione dei fosfolipidi: le teste idrofile verso le porzioni citoplasmatica ed esterna, dove è presente acqua; le code a contatto verso la porzione interna della membrana plasmatica. Secondo il modello del 1945, anche le proteine formavano un doppio strato verso l'interno e verso l'esterno. Da questo modello non emerge la componente glucidica. Per giustificare il passaggio di ioni e molecole, questo modello ipotizzò pori di 3-4Å formati dall'interruzione dello strato fosfolipidico. Questo modello non comprende la polarizzazione e l'asimmetria è spiegata con diverse dimensioni delle proteine interne/esterne. Successivamente, Roberson ipotizzò che tutte le membrane endocellulari, derivassero dalla membrana plasmatica. Questa affermazione non ha fondamento in quanto le proteine mitocondriali sono molto diverse da quelle plasmatiche.

Modello attuale

Risale al 1972 ed è il modello a mosaico fluido. I fosfolipidi formano sempre un doppio strato ma la componente proteica, non è distribuita egualmente sulla membrana. Mosaico fluido poiché a 37°C, i fosfolipidi si trovano allo stato fluido e possono muoversi sia loro che le proteine.

Proteine

Vengono distinte in proteine estrinseche e proteine intrinseche. Queste ultime sono presenti unicamente su un versante della membrana e non penetrano il doppio strato fosfolipidico ma ne instaurano dei legami forti. Le intrinseche sono sempre più voluminose delle estrinseche. Un esempio particolare di proteine intrinseche sono le proteine transmembrana che sporgono sui due versanti della membrana. Questo è determinato dalle dimensioni della proteina. La componente glucidica è rappresentata da catene di oligosaccaridi presenti unicamente nel versante esterno e collegate alla porzione esterna delle proteine di membrana (glicoproteine). La componente glucidica può anche formare i glicolipidi. In molte membrane è presente anche il colesterolo che ne regola la fluidità.

Microvilli

Specializzazione della membrana plasmatica dell'epitelio intestinale per aumentare la superficie di assorbimento. Si tratta di espansioni di membrana plasmatica. All'osservazione al microscopio elettronico la membrana ci appare tri-laminare. Una prima ipotesi prevede che i due strati elettrondensi, intervallati da uno strato elettrontrasparente, siano dovuti unicamente ai fosfolipidi (teste elettrondense e code elettrontrasparenti).