Citologia e istologia

Citologia e istologia

Microscopi

Un microscopio è uno strumento che ingrandisce un’immagine e permette di visualizzare dettagli che l’occhio non potrebbe apprezzare. Il potere di risoluzione è la distanza minima che deve separare due oggetti perché possano essere distinti come effettivamente separati. Esso dipende anche dal sistema ottico e dalla luce utilizzata per illuminare il campione.

Tipi di microscopi

Microscopio ottico in campo chiaro

• Il campione osservato deve essere sufficientemente sottile da far passare la luce e la colorazione serve per risaltare le diverse strutture.
• Sorgente di luce: per illuminare il preparato istologico.
• Lenti che condensano il fascio di luce sul campione (condensatore).
• Tavolino porta oggetti su cui è poggiato il campione.
• Obiettivi di diverso potere di ingrandimento che catturano la luce prodotta dalla sorgente di luce.
• Lente oculare per esaminare l’immagine prodotta dall’obiettivo.

Microscopio a contrasto di fase

Sfrutta le capacità di un oggetto di deviare la luce creando contrasto nell’immagine. Le zone più dense hanno un indice di rifrazione più alto e deflettono la luce maggiormente rispetto alle zone meno dense. Tramite una serie di distorsioni ottiche nel condensatore vengono introdotte lunghezze d’onda fuori fase. Permette di visualizzare il contrasto delle strutture cellulari senza l’uso di coloranti.

Microscopio in campo oscuro

L’unica luce che raggiunge l’obiettivo è quella che viene dispersa o rifratta dalle strutture del campione. Il campione è colpito da un fascio di luce obliquo che non entra nell’obiettivo. Ha la stessa risoluzione di un microscopio in campo chiaro ma permette di identificare le particelle più piccole per via del contrasto su sfondo nero.

Microscopio a fluorescenza

Viene usato in abbinamento a tecniche immunocitochimiche che introducono una fluorescenza nel tessuto. Vi sono numerosi filtri tra la sorgente che emette luce UV e il campione per rendere monocromatico il fascio di luce incidente. Una seconda serie di filtri tra il campione e l’obiettivo restringe le lunghezze d’onda della luce fluorescente emessa, permettendo di vedere in modo selettivo la luce emessa da un tipo di fluoroforo per volta. Sfrutta la capacità di alcune molecole di emettere fluorescenza se eccitate con UV.

Microscopio confocale a scansione

Permette di osservare un campione biologico nelle tre dimensioni. Tramite un foro stenopeico allineato al punto focale della lente dell’obiettivo, viene bloccata la luce 'fuori fuoco' ottenendo un’estrema chiarezza nelle immagini. Permette di osservare ciò che accade a una data profondità. La luce prodotta dal laser viene concentrata da un sistema di specchi in una porzione ridotta del preparato massimizzando l’intensità della luce in un punto unico. Un computer riconosce i dati durante la scansione e produce un’immagine tridimensionale del campione.

Microscopio a luce ultravioletta

L’immagine dipende dall’assorbimento della luce da parte del campione. La risoluzione è maggiore di un microscopio ottico a luce visibile e l’osservazione del campione avviene solo con sistemi fotografici digitali.

Microscopio a luce polarizzata

Viene posto un filtro polarizzatore tra la fonte luminosa e il campione e uno tra il campione e l’osservatore. Viene sfruttata la proprietà di birifrangenza (capacità di alcune molecole di ruotare l’angolo del piano di vibrazione).

Microscopio elettronico a scansione (SEM)

Le immagini sono tridimensionali e ritraggono la struttura della superficie del campione. La scansione è prodotta tramite un fascio di elettroni diretto sul campione producendo un’immagine che deriva dagli elettroni riflessi dalla superficie tridimensionale.

Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)

Una sorgente di elettroni (CATODO) emette elettroni attratti da un ANODO. La ddp crea un fascio di elettroni che passa attraverso un sistema di lenti elettromagnetiche. La lente del condensatore dirige e varia il diametro del fascio di elettroni. Le parti del preparato che hanno fermato gli elettroni appaiono scure, mentre le parti chiare sono quelle in cui gli elettroni passano senza ostacoli. Per poter sfruttare il potere di risoluzione del TEM bisogna fissare i campioni e preservare le strutture subcellulari. Il campione viene trattato con coloranti ad alta intensità che bloccano il fascio di elettroni.

Microscopio a forza atomica

Strumento potente per studiare la topografia di superfici con una risoluzione a livello molecolare e atomico. Il sensore consiste in una punta sottile che passa sul campione fino a coprire una certa area. Può essere utilizzato in liquidi ed è utile per osservare cellule vive e il microambiente che le circonda.

Procedura di preparazione del preparato in microscopi elettronici

• Fissazione: in gluteraldeide che preserva i costituenti proteici seguita da tetrossido di osmio che preserva le membrane cellulari essendo un ossidante che si lega ai lipidi e rendendo elettro dense alcune strutture cellulari.
• Disidratazione alcolica.
• Impregnazione in resina epossidica che viene fatta infiltrare nel tessuto.
• Taglio delle sezioni con lame di diamante per ottenere sezioni sottili (50-150nm) che vengono maneggiate in un liquido per evitare rotture.
• Trattamento: con Sali di metalli pesanti per aumentare il contrasto.

Preparazione dei tessuti

Fissazione: trattamento chimico-fisico che permette di preservare la struttura del tessuto per i successivi trattamenti. Blocca il metabolismo cellulare, previene la degradazione di cellule e tessuti, uccide microorganismi patogeni che potrebbero degradare il campione e rende duro il tessuto attraverso la denaturazione delle proteine. Il fissativo più comune è la formalina (formaldeide 37%) che reagisce con i gruppi amminici delle proteine senza alterarle agendo lentamente ma penetrando in profondità.

Inclusione in paraffina

Il campione viene lavato, disidratato in alcool prima di essere chiarificato per immersione in una soluzione di solventi organici. Il campione viene immerso in paraffina liquida per poi essere solidificato e tagliato con Microtomo per poi aderire su un supporto in vetro.

Colorazione

Il campione per l’osservazione al microscopio. La sezione viene deparaffinata per immersione in xilolo o toluolo e reidratato per immersione in soluzioni acquose a concentrazione d’alcool crescente. Il tessuto sul vetrino viene quindi colorato con una soluzione acquosa di ematossilina. L’eosina è preferenzialmente solubile in alcool. La fissazione in formalina non permette di ottenere le informazioni sulla composizione chimica delle parti di un tessuto. Ad esempio, per preservare le sostanze lipidiche si può congelare il tessuto e utilizzare coloranti solubili nei grassi. Per preservare strutture delle membrane cellulari si ricorre a fissativi contenenti metalli pesanti (permanganato e osmio). Nel caso in cui si volessero visualizzare alcune componenti strutturali delle sezioni istologiche è necessario utilizzare procedure di colorazione selettive.

• Orceina, Resorcina-fucsina: per le fibre elastiche.
• Colorazione di Azan Mallory: per le fibre di collagene dei connettivi.
• Impregnazioni argentiche: per le fibre reticolari e membrane basali.

Composizione chimica dei campioni istologici

La composizione chimica di un tessuto pronto per la colorazione è diversa da quella del tessuto vivo. Dopo la fissazione rimangono componenti di grandi dimensioni come nucleoproteine, strutture citoscheletriche intracellulari ma altre molecole come RNA sono difficilmente mantenuti e per osservarli bisogna utilizzare fissativi capaci di formare reticoli più stretti.

Coloranti

• Coloranti basici: Possiede una carica elettrostatica netta positiva e può essere indicata come Colorante Cl⁺.
• Coloranti acidi: (es. EOSINA) possiede una carica elettrostatica netta negativa e può essere indicata come Colorante A⁻.

Proprietà dei coloranti

La natura chimica di un colorante determina l’affinità differenziale per le componenti del tessuto. Le componenti anioniche di cellule e tessuti (gruppi fosfato di acidi nucleici, gruppi carbossilici di proteine) hanno la proprietà di reagire con coloranti basici = basofilia. La reattività dei gruppi anionici nei tessuti dipende dal Ph: se è basico solo i gruppi fosfato sono ionizzati e reagiscono con coloranti basici (quindi essi vengono utilizzati per rivelare la presenza di uno specifico gruppo anionico). L’ematossilina non è propriamente un colorante basico ma viene usato in combinazione con un mordente (molecola che fa da ponte tra il tessuto e il colorante) che rende la colorazione con ematossilina (insolubile in H₂O) simile a una colorazione di tipo basico.

Acidofilia

La reazione di un colorante acido con un gruppo cationico è definita acidofilia. Le proprietà del colorante sono influenzate da diversi fattori e ciò permette di utilizzare coloranti acidi in combinazione per rivelare strutture tissutali differenti. Spesso si usa prima l’ematossilina per colorare i nuclei e poi i coloranti acidi per differenziare il citoplasma e le componenti extracellulari.

• Sostanze basofile: Eterocromatina e nucleoli, componenti citoplasmatici (RER), materiale extracellulare.
• Sostanze acidofile: Filamenti citoplasmatici, componenti membranosi intracellulari, fibre extracellulari.

Metacromasia

Si verifica quando alcuni coloranti basici interagiscono con particolari strutture nei tessuti e variano il valore di assorbimento della luce passando da una colorazione blu a rosso porpora. È dovuta alla presenza di polianioni che causano l’aggregazione delle molecole di colorante.

Reattivo di Schiff

Gruppi aldeidici e il reattivo di Schiff (fucsina basica solforata): la reazione acido periodico-reattivo di Schiff viene usata per rivelare gli accumuli di glicogeno nelle cellule. Viene utilizzato anche per le reazioni di Feulgen che sfrutta l’idrolisi con acido cloridrico per rilevare la presenza di DNA. Essa si fonda sul distacco delle purine dal desossiribosio che forma il DNA tramite idrolisi acida, aprendo l’anello dello zucchero (quantificazione del contenuto di DNA).

Immunocitochimica

Alla base dell’immunocitochimica c’è la specificità della reazione tra un antigene e un anticorpo. Gli anticorpi (o immunoglobuline) sono glicoproteine secrete dalla cellula e dal sistema immunitario e hanno la capacità di riconoscere una porzione di proteina: antigene. Gli anticorpi si possono coniugare in laboratorio a un fluoroforo (molecola che assorbe la luce a una data lunghezza d’onda ed è in grado di riemettere luce a un’altra lunghezza d’onda visibile). Permette di localizzare l’antigene riconosciuto dall’anticorpo all’interno del tessuto.

Immunofluorescenza

Per poter osservare un immunofluorescenza si utilizza il microscopio a fluorescenza o confocale per determinare la localizzazione della proteina o ricostruire la sua forma. L’immunofluorescenza è abbinata a coloranti fluorescenti per meglio identificare le strutture cellulari. In genere coloranti che si attaccano al DNA e emettono nell’azzurro.

• Immunofluorescenza diretta: Per identificare un antigene in una cellula si usa la immunofluorescenza diretta (uso di un anticorpo primario coniugato con il fluoroforo che reagisce direttamente con l’antigene nel tessuto). L’intensità del segnale fluorescente è bassa.
• Immunofluorescenza indiretta: Nell’immunofluorescenza indiretta c’è una maggiore sensibilità perché il segnale dell’anticorpo primario è amplificato da un anticorpo secondario a cui si lega il fluoroforo. Dato che diversi anticorpi secondari possono agire contemporaneamente sulla stessa molecola il segnale è amplificato. Combinando anticorpi primari prodotti in specie differenti con anticorpi secondari coniugati a fluorofori diversi è possibile localizzare in contemporanea due proteine nello stesso preparato.

Autoradiografia

L'autoradiografia è utilizzata per studiare la proliferazione cellulare. Numerose piccole molecole possono essere incorporate con isotopi radioattivi nella loro struttura molecolare. I precursori marcati vengono iniettati in animali vivi e verranno incorporati nelle macromolecole di cui sono costituenti. Dopo che la cellula ha incorporato il precursore marcato si prepara una sezione che viene immersa in un’emulsione fotografica rendendo possibile l’osservazione di granuli scuri al microscopio ottico. L’autoradiografia fornisce una localizzazione subcellulare più precisa del materiale marcato radioattivamente.

Genetica

Nasce nel 1800 con l’utilizzo dei primi microscopi e con le prime leggi di Mendel, che vennero riscoperte a inizio ‘900 quando la genetica affiancò lo sviluppo della concimazione chimica e la meccanizzazione del comparto agricolo. Bateson fu il primo a utilizzare la parola genetica nel 1906 e a dargli il seguente significato: “Scienza che studia ereditarietà e variazione cercando di scoprire le leggi che governano le somiglianze e le differenze negli individui che sono in rapporto di discendenza.” Questa definizione non è aggiornata in quanto la genetica non studia solo analogie e differenze di individui della stessa specie ma compara anche individui di classi e phylum diversi.

Tipi di genetica

Genetica mendeliana

Studio della trasmissione di caratteri da una generazione all’altra. Mendel scoprì delle regole fondamentali (1854-1864) che governano la trasmissione dei caratteri determinati da un singolo gene e che si presentano solo con due forme alternative facilmente distinguibili.

Genetica molecolare

Studio della struttura chimica e delle funzioni dei geni a livello molecolare.

Genetica delle popolazioni

Analisi delle caratteristiche genetiche delle popolazioni mediante metodi matematici e statistici. Studia le variazioni delle frequenze alleliche dei geni sotto l’influsso delle 4 forze che regolano l’ereditarietà: selezione naturale, deriva genetica, mutazioni, migrazioni. La variabilità cambia nel tempo e nello spazio e spiega l’adattamento e la speciazione.

Genetica quantitativa

Studio dei caratteri poligenici che non seguono le regole della trasmissione mendeliana ma sono determinati dall’azione concomitante di molti geni.

Genetica umana

Studio della successione ereditaria negli esseri umani. È utile per comprendere le potenzialità di sviluppo e per il trattamento di malattie.

Citogenetica

Studio delle strutture che hanno un rapporto diretto con i fenomeni ereditari e quindi, con i cromosomi.

Genetica dei microrganismi

Studio delle trasmissioni ereditarie nei microrganismi.

Progetto genoma umano

Il Progetto Genoma Umano (PGU) è stato avviato nel 1990 con l’obiettivo di sequenziare tutto il DNA degli esseri umani e identificare in esso la posizione di ogni gene. Il progetto è stato portato avanti parallelamente da un consorzio pubblico internazionale e da un’azienda privata, la Celera Genomics, che nel 2001 pubblicò i primi risultati. Ciò permise di scoprire il numero di nucleotidi presenti nel genoma (3.2 miliardi in 23 cromosomi) e che il numero di geni codificante per proteine era più basso di quanto ipotizzato (21.000 geni). Inoltre si scoprì che il 98% del DNA non è codificante ma che segna un’importante differenza tra eucarioti e procarioti. Si notò la presenza di DNA ripetitivo a livello dei centromeri, la cui funzione è strutturale ed è associata agli elementi trasponibili (porzioni di DNA in grado di spostarsi). Il PGU ha inoltre permesso di identificare centinaia di geni associati a malattie e di raccogliere informazioni sulle varianti genetiche che determinano le diverse caratteristiche degli esseri viventi.

Genomica

Scienza che studia l’intera dotazione dei geni di un organismo e l’interazione tra i geni stessi. Ciò permise di determinare le proporzione tra DNA codificante e non codificante, la densità genica e l’assenza di una stretta relazione tra il numero di geni e la complessità di un organismo. Inoltre lo studio dei genomi di organismi diversi permette di comprendere alcuni aspetti dell’evoluzione.

Ricerca genetica

Ricerca di base: Pura o fondamentale ha come obiettivo l’avanzamento della conoscenza, senza scopo pratico previsto, anche se i suoi risultati possono portare a applicazioni inaspettate. Essa è la più trascurata.

Ricerca applicata: Svolta allo scopo di trovare soluzioni pratiche e specifiche. Il suo obiettivo non è l’avanzamento della conoscenza teorica bensì lo sfruttamento di essa per fini pratici e per lo sviluppo tecnico e tecnologico.

Applicazioni della genetica

• Allevamento animale
• Agraria
• Medicina legale
• Medicina
• Archeologia

Caratteristiche degli organismi nella ricerca genetica

• Conoscere l’origine genetica dei genitori
• Ciclo vitale breve
• Progenie numerosa
• Facili da manipolare e gestire
• Variabilità naturale

Il progresso fondamentale in genetica si ebbe con la scoperta che i GENI (i fattori di Mendel) erano associati con i CROMOSOMI. Questo correlava genetica e citologia e le modalità di trasmissione dei caratteri con il comportamento di strutture visibili al microscopio.

Deriva genetica

Componente dell’evoluzione di una specie dovuta a fattori casuali e che può essere studiata con metodi statistici. Questo effetto può far divenire un allele e il fenotipo da esso rappresentato più frequente o meno presente nella popolazione.