Citogenetica

CITOGENETICA

LEZIONE 1 = Organizzazione del genoma eucariotico

LEZIONE 2 = Fibra cromatinica

LEZIONE 3 = Le isocore e l’evoluzione del genoma

LEZIONE 4 = I territori cromosomici

LEZIONE 5 = Struttura e funzione del telomero

LEZIONE 6 = Allungamento del telomero per ricombinazione

LEZIONE 7 = Struttura e funzione del centromero

LEZIONE 8 = La cromatina centromerica

LEZIONE 9 = I siti fragili

LEZIONE 10 = Sindrome dell’X fragile

LEZIONE 11 = Bandeggio cromosomico

LEZIONE 12 = Bandeggio ad alta risoluzione

LEZIONE 13 = Ibridazione in situ fluorescente

LEZIONE 14 = Telomeric DNA

LEZIONE 15 = Aberrazioni cromosomiche

LEZIONE 16 = Sindromi ad instabilità cromosomica

STRUTTURA DEL CROMOSOMA – ORGANIZZAZIONE DEL GENOMA

EUCARIOTICO (LEZIONE 1)

CHE COSA È LA CITOGENETICA?

La citogenetica è una branca della genetica che ha lo scopo di studiare la struttura dei

cromosomi con il fine di determinare il rapporto che esiste tra i caratteri ereditari ed i

cariotipi specifici (e quindi di stabilire una relazione genotipo-fenotipo).

ORGANIZZAZIONE DEL GENOMA EUCARIOTICO

Esiste una sproporzione sostanziale tra la lunghezza del DNA e le dimensioni del nucleo,

cioè il compartimento deputato a contenerlo.

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Facendo un esempio nei vertebrati 5,5 x 10 bp metri, e se pensiamo che nel nucleo

abbiamo 46 cromosomi, abbiamo metri e metri di DNA.

Il diametro di un nucleo va da 1 a 10 e quindi le molecole di DNA devono

µm,

organizzarsi in qualche modo per entrare all’interno di esso.

Quindi esiste una necessità strutturale per la quale il DNA deve essere in grado di

organizzarsi e compattarsi.

Non ci dobbiamo dimenticare che i processi che avvengono all’interno del nucleo sono

strettamente regolati nello spazio (si intende il nucleo) e nel tempo (ciclo cellulare).

Per fare un esempio, il genoma deve riprodursi in maniera costante e ciclica, durante la

fase S; inoltre la struttura dei repliconi è strettamente rigida (essi si attivano solo nella

fase S).

Ancora nella divisione cellulare deve avvenire una segregazione che deve essere

ordinata e perfetta dei genomi nelle due cellule figlie e l’espressione genica sappiamo

che è settorializzata, cioè ci sono delle regioni che esprimono i geni in un determinato

momento e regioni che non le esprimono.

Quindi, oltre ad una necessità di tipo strutturale, ci deve deve essere una necessità

funzionale per cui il genoma deve organizzarsi.

Per cui una necessità strutturale ed una necessità funzionale richiedono

un’architettura organizzata del nucleo e del genoma contenuto all’interno del nucleo

in una gerarchia di livelli strutturali, la quale è definita come condensazione della

cromatina.

Esistono diversi tipi di condensazione cromosomica:

1) Condensazione del cromosoma mitotico, processo che porta alla formazione dei

cromosomi mitotici (cioè processo che porta la cromatina dispersa in interfase alla

condensazione in cromosomi mitotici).

Questo processo è distinto in 3 passaggi: individualizzazione, condensazione e

risoluzione.

2) Frammentazione dell’eterocromatina, processo che porta all’estrema condensazione

di singole regioni cromosomiche o di interi cromosomi.

Quindi la formazione dell’eterocromatina porta al silenziamento di tutti i geni presenti

in quella singola regione o all’interno di quel cromosoma.

Per esempio, il cromosoma X nelle cellule di mammifero (intero); il cromosoma che

diventa eterocromatico; il centromero di un cromosoma (singola regione

eterocromatica).

3) Condensazione apoptotica, l’apoptosi è un tipo di morte cellulare in cui la cellula svolge

un ruolo attivo, cioè si dice che la cellula decide di morire.

Durante l’apoptosi si ha una frammentazione della cromatina in frammenti

estremamente grandi dell’ordine di megabasi, successivamente questi vengono digeriti

in frammenti più piccoli dell’ordine dell’ordine delle chilobasi e poi questi frammenti

vanno incontro a condensazione e si formano quelli che sono i corpi apoptotici che

rappresentano tutta la cromatina frammentata ed altamente condensata.

DIFFERENTI TIPI DI CONDENSAZIONE

A) Condensazione del cromosoma mitotico, abbiamo 3 passaggi:

1) durante l’individualizzazione i cromosomi cominciano a prendere un aspetto

indipendente l’uno dall’altro;

2) durante la condensazione cominciano appunto a condensarsi ed a diventare più spessi;

3) nella risoluzione si ha la formazione dei due cromatidi fratelli che costituiscono il

cromosoma metafasico.

B) Esempio di condensazione in eterocromatina, la pallina verde rappresenta la regione

altamente condensata - FORMAZIONE DELL’ETEROCROMATINA.

C) Vediamo come l’eterocromatina durante la morte cellulare si frammenta e poi questi

frammenti vanno incontro a condensazione e quindi si ha la comparsa dei corpi

apoptotici – CONDENSAZIONE APOPTOTICA.

Sappiamo che la doppia elica ha un diametro di 20 Å e quindi deve ripiegarsi per arrivare

a 600 Å che è il diametro del cromosoma metafasico.

La condensazione del DNA è descritta in termini di rapporti di impaccamento.

Il rapporto di impaccamento si calcola attraverso il rapporto tra la lunghezza del DNA

e la lunghezza dell’unità che lo contiene. 7

Per esempio, cromosomi con circa 4,7 x 10 bp = 14 mm di DNA esteso.

Questi 14 mm di DNA esteso nel loro massimo di condensazione occupano circa 2 µm

(il più piccolo cromosoma umano).

Quindi per calcolare il rapporto di impaccamento trasformiamo i 14 mm in 14.000 µm

e quindi il risultato di impaccamento sarà di 14.000/2 = 7.000.

µm

Dai rapporti di impaccamento nei nucleosomi il DNA nudo è più compatto di circa 6-7

volte.

Il nucleosoma quindi rappresenta il primo livello gerarchico di condensazione.

Sempre dai rapporti di impaccamento sappiamo che la fibra cromatinica è più

compatta di circa 6-7 volte rispetto al DNA nudo dei nucleosomi.

L’avvolgimento della fibra avviene in mitosi dalle 200-500 volte e infine il cromosoma

metafasico dalle 10.000-20.000 volte.

La condensazione è dovuta dall’interazione del DNA con:

- proteine istoniche;

- proteine non istoniche;

- RNA (meno del 10% catene nascenti).

L’insieme del DNA, proteine istoniche e non va a costituire la cromatina.

MODELLI GERARCHICI PER L’ORGANIZZAZIONE DEL CROMOSOMA MITOTICO

A) Fibra del nucleosoma;

B) Fibra della cromatina;

C) Avvolgimento della fibra cromatinica;

D) Modello alternativo dell’avvolgimento della fibra cromatinica che coinvolge la

formazione di uno scaffold proteico e delle anse di cromatina.

GLI ISTONI

Gli istoni sono stati scoperti nel 1884 e fu scoperto e capito subito che questi elementi

fossero dei componenti universali dei cromosomi eucariotici.

Inizialmente si pensò che gli istoni costituissero il materiale genetico.

Tuttavia poi si è visto che il materiale genetico è costituito dalla molecola del DNA.

Ma poiché le proteine istoniche si trovavano in grandi quantità su tutta la molecola del

DNA, si cominciò a pensare che avessero un ruolo fondamentale nella regolazione

dell’espressione genica.

Successivamente nel 1965 fu scoperto che in realtà esistono solo 5 famiglie di istoni,

cioè H1, H2A, H2B, H3 ed H4.

Poi nel 1969 si è scoperto che le proteine istoniche sono le proteine meno variabili che

si conoscono.

Il fatto che gli istoni si siano così conservati durante il processo di evoluzione, ci fa capire

il ruolo fondamentale che hanno queste molecole nella struttura del nucleosoma

(struttura conservata nel corso dell’evoluzione).

Tuttavia nel 1969 nasce l’idea del controllo combinato, cioè secondo questa idea le

diverse famiglie istoniche potevano combinarsi in modi diversi tra di loro, in modo tale

da fornire dei sistemi di regolazione dell’espressione genica.

Però il comportamento chimico di questi istoni era un po’ bizzarro, perché provando ad

aggregare questi istoni tra loro, non formavano degli aggregati precisi ma ogni tipo di

aggregato casuale, e quindi c’era una difficoltà nel predire un modello e rendere l’idea

del controllo combinato per la regolazione dell’espressione genica.

Quindi per lungo tempo si pensò che gli istoni costituissero un rivestimento della

molecola del DNA e che non aveva nessun ruolo.

Nel 1971 sono stati scoperti gli inibitori delle proteasi (enzimi che digeriscono le

proteine), questa scoperta ha consentito operazioni di estrazione delle proteine

istoniche molto più delicate.

Attraverso gli inibitori delle proteasi è stato possibile estrarre il tetramero (2 molecole

dell’istone H3 e due molecole dell’istone H4) del nucleosoma e ugualmente è stato

possibile estrarre il dimero (1 molecola dell’istone H2A e 1 molecola dell’istone H2B).

Nel 1974 sono stati combinati con delle molecole di DNA in vitro e quello che si è

ottenuto è il classico pattern a diffrazione a raggi x della cromatina.

Per ottenere il pattern a diffrazione ai raggi x della cromatina non è necessaria la

presenza dell’istone H1.

Ciò che si è osservato è un unico ordine ripetuto, cioè il tetramero ed il dimero messi

con il DNA davano questo pattern ripetuto.

Così fu completamente abbandonata l’idea del controllo combinato (cioè che gli istoni

avrebbero avuto un ruolo nella regolazione dell’espressione genica).

Le proteine istoniche hanno un ruolo nell’organizzazione strutturale e funzionale, sono

delle proteine di piccole dimensioni (102-105 amminoacidi) ed hanno la caratteristica

di essere estremamente basiche (carica + a pH neutro).

Si trovano con la molecola del DNA in un rapporto 1:1, e sono costituite da 5 famiglie.

La classificazione può essere fatta in base:

- agli amminoacidi (H3-H4 ricchi di arginina, H2A-H2B ricchi di lisina; H1 molto ricco di

lisina);

- alla localizzazione (istoni nucleosomiali H3, H4, H2A ed H2B, cioè gli istoni che vanno

a formare l’ottamero istonico del nucleosoma e l’istone linker H1, cioè quello che non

è necessario da ottenere il pattern della cromatina a raggi x).

Gli istoni hanno delle affinità strutturali:

1) elevata presenza di amminoacidi basici;

2) dominio centrale apolare ed organizzato ad α-elica;

3) due estremità non organizzate, le code istoniche (estremità bipolare).

Il livello di conservazione degli istoni è in relazione alla loro funzione

nell’organizzazione del genoma; in particolare nell’organizzazione del primo livello

della gerarchia di livelli che portano alla condensazione della cromatina e cioè la loro

funzione nella formazione del nucleosoma.

Infatti vediamo che gli istoni H3 ed H4 sono i più conservati nel corso dell’evoluzione,

non ci sono praticamente differenze se non in qualche amminoacido fra le specie.

Gli istoni H3 ed H4 occupano la parte centrale del nucleosoma e che quindi prendono

la maggior parte dei contatti con la molecola di DNA (nocciolo del nucleosoma).

Gli istoni H2A ed H2B costituiscono i due dimeri e possono presentare variabilità

specie-specifica.

Infine l’istone H1 è quello meno conservato e può presentare variabilità tra specie e

tessuti della stessa specie, questo in quanto non partecipa alla costituzione della

struttura del nucleosoma (a causa di ciò presenta quindi una variabilità

amminoacidica).

Questo pannello mostra le 5 famiglie di istoni, il loro peso molecolare, il numero di

amminoacidi ed il contenuto di amminoacidi basici.

Si può vedere il loro dominio apolare conservato ed organizzato in e poi si

α-eliche

possono vedere le due estremità bipolari con la carica positiva tipica degli istoni.

Gli istoni in questo pannello sono rappresentati anche secondo il loro grado di

conservazione: H3 ed H4 altamente conservati (totalmente gialli); H2A ed H2B variano

leggermente (code corte blu); l’istone H1 il più variabile (code lunghe blu).

IL NUCLEOSOMA (OTTAMERO ISTONICO)

Il nucleosoma inizialmente è stato dedotto sulla base di evidenze sperimentali (si

facevano determinati esperimenti, si traevano conclusioni e l’insieme di queste

conclusioni ha fatto supporre la struttura del nucleosoma).

Dai rapporti stechiometrici si vide che tutti e quattro gli istoni (H2A, H2B, H3 ed H4)

erano richiesti in quantità equimolari.

Inoltre era stato visto che il peso del DNA e degli istoni era uguale; quindi una volta

trovato il peso degli istoni, si suppose che questi istoni dovessero essere associati con

200 bp di DNA poiché queste 200 bp di DNA come peso corrispondevano a quello degli

istoni.

Ancora dal comportamento biochimico si dedusse che il DNA dovesse essere avvolto

all’esterno, in quanto questo ottamero istonico aveva il comportamento di una

proteina globulare.

Infine si dedusse che la quantità di H1 era presente in un rapporto di 1:2 rispetto alle

altre proteine istoniche (quindi se erano richieste due molecole nucleosomiali (H2A,

H2B, H3 ed H4) nel DNA, per ognuna di queste due, era richiesta una sola molecola di

istone H1).

Il modello del nucleosoma è stato poi confermato da esperimenti con endonucleasi

(enzimi che sono in grado di tagliare il DNA all’interno).

Le endonucleasi tagliano il DNA nudo, quindi se il DNA era protetto da proteine, le

endonucleasi non possono tagliare.

Infatti questo esperimento con le endonucleasi operò effettivamente un taglio tra un

nucleosoma ed un altro.

Quando fu digerita la cromatina con le endonucleasi, si vennero a creare dei frammenti

di circa 200 bp.

Se invece con le stesse endonucleasi veniva fatto digerire DNA nudo, non si ottenevano

frammenti di 200 bp, ma si otteneva una classica svirata, che è indice del fatto che

erano presenti frammenti di qualsiasi dimensione (nel gel di agarosio).

Nel 1976 fu finalmente visualizzata la struttura della fibra cromatinica, la classica

collana di perle, le perle sono i nucleosomi ed il DNA nudo, e il DNA che è stato tagliato

dalle endonucleasi.

Ulteriori esperimenti hanno utilizzato una diversa nucleasi, la micrococcale, che è

un’esonucleasi che è in grado di digerire il DNA a partire da un’estremità.

L’utilizzo prima dell’endonucleasi e poi della micrococcale ha portato a capire che in

realtà le basi accoppiate con l’ottamero istonico non sono 200 ma 146 bp.

Questo perché la micrococcale ha fatto in modo di digerire tutto il DNA che sporgeva

dall’ottamero istonico.

È stato possibile isolare il complesso costituito dall’ottamero istonico e il DNA che è

stato chiamato core particle, è stato cristallizzato e sono stati quindi studiati i cristalli

in maggior dettaglio.

Si è osservato che il DNA si arrotola una volta e ¾ intorno all’ottamero istonico con un

andamento destrorso, che il tetramero costituito da 2 molecole di H3 e due molecole

di H4 si trova al centro della struttura del nucleosoma e che i dimeri costituiti da H2A

ed H2B sono esterni ed infine che tutti gli istoni hanno un ripiegamento simile che è

stato definito histone fold.

ASSEMBLAGGIO DELL’OTTAMERO ISTONICO

L’assemblaggio degli istoni avviene attraverso l’accoppiamento di due molecole di H3

e due molecole di H4 che vanno a formare il tetramero e una molecola di H2A e una

molecola di H2B che vanno a formare il dimero.

Quindi il tetramero H3-H4 si combina con due dimeri H2A-H2B per formare l’ottamero

istonico.

Dall’immagine si può vedere il ripiegamenro ad rappresentato dal classico tubo

α-elica

e le code non organizzate che si espandono al di fuori dell’ottamero istonico.

Quindi inizialmente si ha la formazione del dimero H3-H4 e poi la formazione del

tetramero H3-H4 (attraverso l’associazione dei due dimeri H3-H4).

Inoltre si può vedere lo stretto legame che prende il DNA con il tetramero H3-H4 che

forma il nocciolo del nucleosoma e questo spiega il loro elevatissimo livello di

conservazione.

E poi i dimeri che vengono assemblati ai due lati opposti del tetramero formando così

l’ottamero istonico completo.

INTERAZIONI MOLECOLARI DNA-ISTONI

Altri studi hanno messo in evidenza le interazioni molecolari tra DNA-istoni.

I contatti con il nucleosoma avvengono ogni 10 bp nel solco minore:

- con il gruppo fosfato sono presenti interazioni elettrostatiche e legami idrogeno;

- con il deossiribosio contatti non polari;

- con le basi in realtà non avviene nessun contatto specifico, poiché gli istoni non

riconoscono sulla molecola del DNA una sequenza consenso specifica, ma gli istoni sono

in grado di assemblare il nucleosoma su qualunque sequenza di DNA venga fornita.

Il solco minore ed il solco maggiore sono allineati lungo la molecola di DNA.

Il solco maggiore, proprio perché è più grande, è il solco informativo per tutti i contatti

del DNA e le proteine deputate ad interagire con la molecola del DNA.

Le proteine nel solco maggiore possono effettivamente leggere la sequenza di DNA e

quindi riconoscerla.

Quindi il solco informativo per i contatti tra DNA e proteine è il solco maggiore.

Le code istoniche sono esposte all’esterno.

I NUCLEOSOMI REPRIMONO LA TRASCRIZIONE

Il nucleosoma ha la funzione di reprimere la trascrizione.

Si tratta di repressori non specifici e quindi repressori generali, cioè tutta la cromatina

compresa nell’ottamero istonico non può trascrivere.

Gli istoni svolgono la loro azione di repressori generali mediante interazioni che

avvengono nel core del nucleosoma (tra le molecole istoniche ed il DNA) e mediante le

interazioni che avvengono tra le code istoniche (le code istoniche sulla struttura del

nucleosoma e le code istoniche tra il nucleosoma ed il nucleosoma adiacente).

Quindi poiché possa avvenire l